1、人体疟原虫镜检技术 一、一、概述概述 二、疟原虫生活史二、疟原虫生活史 三、人体疟原虫形态特征三、人体疟原虫形态特征 四、血片制作与染色四、血片制作与染色一、概述 疟疾是由按蚊叮咬传播疟原虫引起寄生虫病。疟疾是由按蚊叮咬传播疟原虫引起寄生虫病。疟原虫是单细胞真核生物，属原生动物门、孢子疟原虫是单细胞真核生物，属原生动物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。自然界疟纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。自然界疟原虫有原虫有149149种，能感染人体的疟原虫只有四种：即种，能感染人体的疟原虫只有四种：即间日疟（间日疟（PvPv）、恶性疟（）、恶性疟（PfPf）、三日疟（）、三日疟（PmPm）、）、
2、卵形疟（卵形疟（PoPo）四种。）四种。在我国间日疟最常见，分布最广，发病最多；在我国间日疟最常见，分布最广，发病最多；恶性疟次之，但对人体危害严重，常引起脑型疟恶性疟次之，但对人体危害严重，常引起脑型疟等凶险发作。三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例等凶险发作。三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。报告。二、疟原虫的生活史二、疟原虫的生活史 疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人（中间宿主）和按蚊（终宿主）。是人（中间宿主）和按蚊（终宿主）。1 1、红细胞外期、红细胞外期2 2、红细胞内期、
3、红细胞内期3 3、子孢子增殖期、子孢子增殖期疟原虫生活史疟原虫生活史红细胞外期红细胞外期红细胞内期红细胞内期蚊体内发育蚊体内发育人体内发育人体内发育配子生殖孢子增殖1 红细胞外期n按蚊刺吸人血时，子孢子随唾液进入人体，约按蚊刺吸人血时，子孢子随唾液进入人体，约3030分钟随血流侵入肝细胞。分钟随血流侵入肝细胞。n在肝细胞内，子孢子在肝细胞内，子孢子滋养体滋养体裂体增殖裂体增殖红外红外期裂殖体期裂殖体裂殖子（约裂殖子（约1200012000个）个）肝细胞破裂肝细胞破裂裂殖子散出裂殖子散出血窦，一部分裂殖子被吞噬细胞血窦，一部分裂殖子被吞噬细胞吞噬，一部分则侵入红细胞内发育。吞噬，一部分则侵入红细
4、胞内发育。n目前认为间日疟原虫和卵形疟原虫的子孢子有：目前认为间日疟原虫和卵形疟原虫的子孢子有：速发型和迟发型。速发型和迟发型。2 红细胞内期 由肝细胞释放出的红细胞外期裂殖子侵入红细胞由肝细胞释放出的红细胞外期裂殖子侵入红细胞内进行裂体增殖，称为红细胞内期（红内期）。内进行裂体增殖，称为红细胞内期（红内期）。包括滋养体和裂殖体两个阶段。包括滋养体和裂殖体两个阶段。基本过程：环状体基本过程：环状体 大滋养体大滋养体 未成熟裂殖体未成熟裂殖体 成熟裂殖体成熟裂殖体 裂殖子裂殖子健康红细胞健康红细胞 ，重复上，重复上述过程几次，部分裂殖子在红细胞内不再进行裂述过程几次，部分裂殖子在红细胞内不再进行
5、裂体增殖，而发育为配子体体增殖，而发育为配子体 。红内期增殖周期：间日疟和卵形疟为红内期增殖周期：间日疟和卵形疟为48h/48h/代；三代；三日疟日疟72h/72h/代；恶性疟代；恶性疟36-48h/36-48h/代代 。3 子孢子增殖期 雌按蚊刺吸疟疾患者血液，疟原虫随血入雌按蚊刺吸疟疾患者血液，疟原虫随血入蚊胃，仅雌雄配子体存活并继续进行配子蚊胃，仅雌雄配子体存活并继续进行配子生殖，而其它各期疟原虫均被消化。生殖，而其它各期疟原虫均被消化。雄配子体形成雄配子或称小配子。雄配子体形成雄配子或称小配子。雌配子体逸出红细胞外，发育为不活动的雌配子体逸出红细胞外，发育为不活动的圆形或椭圆形的雌配子
6、或称大配子。圆形或椭圆形的雌配子或称大配子。3.13.1雄配子形成 雄雄配子体几分钟内核分裂为配子体几分钟内核分裂为4-8块，胞质亦块，胞质亦向外伸出向外伸出4-8条细丝，核分别进入细丝内，条细丝，核分别进入细丝内，称称出丝现象出丝现象，即，即雄雄配子形成配子形成 细丝脱离母体，在蚊胃腔中游动，即细丝脱离母体，在蚊胃腔中游动，即雄雄配配子或小配子子或小配子3.23.2动合子和卵囊的形成 雌雄雌雄配子受精，形成圆球形的合子。配子受精，形成圆球形的合子。合子数小时后变为长形的香蕉状的能活合子数小时后变为长形的香蕉状的能活动的动合子。动的动合子。动合子穿过蚊胃壁的上皮细胞，停留在胃壁的上皮细胞和外层
7、弹性纤维膜之间，虫体变圆并分泌囊壁形成球形的卵囊，卵囊，卵囊也称囊合子卵囊也称囊合子。3.3 孢子增殖 卵囊逐渐长大并向蚊胃壁外突出卵囊逐渐长大并向蚊胃壁外突出 囊内的核和胞质反复分裂进行孢子增殖，囊内的核和胞质反复分裂进行孢子增殖，生成成千上万的子孢子生成成千上万的子孢子 子孢子呈梭形，子孢子呈梭形，1015m1m 主动从卵囊壁钻出或因卵囊破裂后散出，主动从卵囊壁钻出或因卵囊破裂后散出，随血淋巴流入蚊体组织。随血淋巴流入蚊体组织。只有到蚊唾腺内的子孢子才具有传染性。只有到蚊唾腺内的子孢子才具有传染性。子孢子3.4 雌性按蚊-终宿主-虫媒n蚊唾液腺内含有疟原虫子孢子蚊唾液腺内含有疟原虫子孢子n
8、当雌蚊刺吸人血时，可随唾液进入人体当雌蚊刺吸人血时，可随唾液进入人体n雌性按蚊饱餐人血雌性按蚊饱餐人血三、人体疟原虫形态特征 在红细胞内发现疟原虫是确诊疟疾和鉴别虫种在红细胞内发现疟原虫是确诊疟疾和鉴别虫种的重要依据的重要依据 疟原虫基本构造相同疟原虫基本构造相同-细胞膜、质、核细胞膜、质、核 瑞氏瑞氏WrightWright或姬氏或姬氏GiemsaGiemsa染色：核染成紫红色，染色：核染成紫红色，胞质呈兰色，疟原虫消化血红蛋白产物胞质呈兰色，疟原虫消化血红蛋白产物-疟色疟色素呈棕黄色素呈棕黄色 疟原虫在红细胞内各期形态各不相同疟原虫在红细胞内各期形态各不相同 三期六种形态三期六种形态 滋养
9、体期：大、小滋养体滋养体期：大、小滋养体 裂殖体期：成熟、未成熟裂殖体裂殖体期：成熟、未成熟裂殖体 配子体期：雌、雄配子体配子体期：雌、雄配子体1、薄血膜疟原虫形态特征（1）间日疟：环状体、滋养体、裂殖体、配子体（2）恶性疟：环状体、配子体小滋养体（环状体）间日疟间日疟恶性疟恶性疟约为红细胞直径的约为红细胞直径的1/3,1/3,环较粗大；核环较粗大；核1 1个，个，2 2个个核和一个红细胞寄生核和一个红细胞寄生2 2个环状体不如恶性疟原个环状体不如恶性疟原虫多见虫多见。约为红细胞的约为红细胞的1/61/6；环；环纤细，核纤细，核1 12 2个，一个个，一个红细胞寄生红细胞寄生2 2个环状体个环
10、状体的常见的常见。薄血膜间日疟环状体 2.1 2.1 未成熟裂殖体未成熟裂殖体 （immature immature schizontschizont）薄血膜间日疟环状体恶性疟薄血膜环状体薄血膜恶性疟环状体薄血膜恶性疟环状体大滋养体间日疟间日疟恶性疟恶性疟虫体不规则，较大；虫体不规则，较大；阿米巴样，空泡明显；阿米巴样，空泡明显；疟色素细小，黄褐色。疟色素细小，黄褐色。较小，圆形；空泡小；较小，圆形；空泡小；早期疟色素细小，金早期疟色素细小，金黄色，晚期结成块状，黄色，晚期结成块状，黄褐色黄褐色。薄血膜间日疟滋养体薄血膜间日疟滋养体未成熟裂殖体间日疟间日疟恶性疟恶性疟圆形或不规则，核分圆形或不
11、规则，核分裂为裂为2 2个以上，空泡个以上，空泡消失；疟色素分布不消失；疟色素分布不匀。匀。圆形，核分裂为圆形，核分裂为2 2个个以上；疟色素集成团以上；疟色素集成团块块。薄血膜间日疟未成熟裂殖体成熟裂殖体间日疟间日疟恶性疟恶性疟大于正常红细胞；裂大于正常红细胞；裂殖子殖子12122424个，通常个，通常1616个，排列不规则，个，排列不规则，疟色素常集于一侧，疟色素常集于一侧，黄褐色。黄褐色。小于正常红细胞；裂小于正常红细胞；裂殖子较小，殖子较小，8 82626个，个，通常通常8 81818个，排列个，排列不规则，疟色素成团不规则，疟色素成团块状，黑褐色。块状，黑褐色。薄血膜间日疟成熟裂殖体
12、薄血膜间日疟成熟裂殖体薄血膜间日疟成熟裂殖体雌配子体间日疟间日疟恶性疟恶性疟大于正常红细胞，圆大于正常红细胞，圆形；核小，致密，深形；核小，致密，深红色，偏于一侧，胞红色，偏于一侧，胞浆深蓝色；疟色素散浆深蓝色；疟色素散在。在。新月形，两端较尖；新月形，两端较尖；核小，致密，深红色，核小，致密，深红色，位于中央；胞浆深蓝位于中央；胞浆深蓝色；疟色素围于核周。色；疟色素围于核周。雄配子体间日疟间日疟恶性疟恶性疟大于正常红细胞，圆大于正常红细胞，圆形；核大，疏松，浅形；核大，疏松，浅红色，多位于中央；红色，多位于中央；胞浆浅蓝色或淡红色；胞浆浅蓝色或淡红色；疟色素散在。疟色素散在。腊肠形，两端钝圆
13、，腊肠形，两端钝圆，核大，疏松，淡红色，核大，疏松，淡红色，位于中央；胞浆浅蓝位于中央；胞浆浅蓝色或浅红色；疟色素色或浅红色；疟色素位于核周。位于核周。薄血膜配子体薄血膜配子体恶性疟配子体 恶性疟配子体恶性疟配子体大配子体和大滋养体的形态区别大配子体大配子体大滋养体大滋养体虫体大小虫体大小几乎充满被寄生的红几乎充满被寄生的红细胞细胞不超过被寄生红不超过被寄生红细胞的细胞的3/4核核一个，较大且致密，一个，较大且致密，周围有一圈空白的不周围有一圈空白的不染色带染色带一个，延长呈带一个，延长呈带状，状，周围无明显周围无明显的不染色带的不染色带胞浆胞浆边缘清楚，不含空泡边缘清楚，不含空泡边缘不整齐，
14、多边缘不整齐，多有空泡有空泡疟色素疟色素颗粒较多颗粒较多,较粗，均较粗，均匀散在匀散在颗粒较少颗粒较少,较细，较细，分布不均匀分布不均匀大配子体和大滋养体的形态区别吉氏染色液被寄生红细胞形态 间日疟间日疟 恶性疟恶性疟红细胞胀大，退色，红细胞胀大，退色，薛氏点薛氏点鲜红、细小、鲜红、细小、数多数多 。红细胞大小正常，色红细胞大小正常，色稍紫；稍紫；茂氏点茂氏点紫红色，紫红色，粗大，数少。粗大，数少。2、厚血膜中疟原虫形态 厚血膜的血量多，红细胞重叠且干燥较慢，致使疟原虫皱缩，空泡缩小或消失，虫体变形，虫种鉴别比薄血膜困难。厚血膜中小滋养体 胞浆可呈环状，也可收缩在核的一侧或两侧，也可围核分布等
15、，形成各种形态。间日疟原虫的环较大，胞浆较厚；核一个；虫体形态常呈分号“；”和感叹号“！”；品型 恶性疟原虫的环纤细，较小，着色较浅；核12个，虫体形态常呈分号“；”、飞鸟“.”、V状“V”和断环“O”状等；厚血膜中间日疟大滋养体 间日疟原虫呈阿米巴样，形状不规则。核位于胞质中或边缘；胞浆常断裂成几块或缩成圆形，疟色素分布不均。厚血膜中间日疟裂殖体 虫体较大，核2个以上，一般1224个，除虫体略为缩小且着色较深外，均与薄血膜的相似。厚血膜中间日疟配子体 除虫体略为缩小且着色较深外，均与薄血膜的相似。一般虫体较大，圆形，色素粗大，大配子核小，偏与一侧，胞浆深兰色。小配子核大，居中，胞浆浅兰色。厚
16、血膜中恶性疟配子体 恶性疟原虫大配子体为新月形，小配子体为腊肠形。核居中，疟色素围在核周，外为一圈胞浆。此外，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和疟色素，或核和胞浆均消失，只留下一些疟色素厚血膜中红细胞一般染色后，寄生的红细胞溶解，轮廓消失。但间日疟有时尚留下红细胞的“影子”和薛氏点。恶性疟常见红细胞“影子”和茂氏点疟色素 疟色素与原虫在一水平面上 有立体感；黄褐色、深褐色、金黄色。形状如沙粒状、短杆状等，可聚集成堆。疟色素在疟原虫诊断，虫期判断中有着重要作用。厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态本片中部有两个白细胞，在其左上方、左下方各有一个大滋养体；本片中部
17、有两个白细胞，在其左上方、左下方各有一个大滋养体；其右上方有两个大滋养体，胞浆皆已绉缩成数块，但皆有红细胞残其右上方有两个大滋养体，胞浆皆已绉缩成数块，但皆有红细胞残骸可见骸可见间日疟间日疟虫体位于本片中部，胞浆皱缩为多块，色素聚集于虫体右上方；本虫体位于本片中部，胞浆皱缩为多块，色素聚集于虫体右上方；本虫上方为一个大滋养体虫上方为一个大滋养体间日疟间日疟厚血膜恶性疟环状体厚血膜恶性疟配子体厚血膜疟原虫鉴别要点 在厚血膜中必须根据疟原虫的核、胞浆、疟色素三个条件鉴别是否是疟原虫及虫种。具备上述三条中的二个条件也能给与判定。有时因染色较浅，看不到核和胞浆，但看到典型的疟色素也可判定。疟原虫与其它
18、物体的鉴别 疑似疟色素：血膜上的染料残渣及灰尘，有时被误认为疟色素。可依据颗粒大小、色泽及分布范围加以区别。转动微调时，可见残渣及灰尘浮于红细胞上，于疟原虫不在一平面。疑似疟原虫核：球菌、白细胞破裂后散出的颗粒、血小板，皆为红色小点，与疟原虫核相似，最易混淆。但球菌形体较大，边缘光滑，常见多个聚集一处，分布较广。中性和嗜酸性粒细胞颗粒，着色较淡，边缘整齐，附近常有白细胞碎屑。血小板：红点结构松散，花瓣状，多35成群。疟原虫与其它物体的鉴别 疑似疟原虫胞浆：网织红细胞残留物和白细胞残留物通常为蓝色，与疟原虫胞浆相似，与某些红点结合在一起，易误诊为疟原虫。如似大滋养体，可根据有无疟色素特点加以区别
19、。如似小滋养体，可依据虫体大小、折光是否均匀、核与胞浆是否在一个平面上进行区别。四、血片的制作与染色1 1、材料、材料玻片：推玻片（具有光滑的边缘）、载玻片一次性采血针75%的医用消毒酒精（湿棉球）干棉球（止血用）标签、记号笔：载玻片上标识与编号玻片盒玻片的处理：（1）新玻片常有游离的碱质，使用前应用重铬酸钾洗液或稀盐酸（将浓盐酸稀释10倍）浸泡24小时，然后用自来水反复冲洗，晾干或烘干备用。（2）旧的玻片，应放入5%的肥皂或洗衣粉水中煮沸20分钟，再用热水将肥皂或血膜等污物洗去，用自来水反复冲洗，必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。2 2、采血、采血厚血膜血量约为5立方毫米
20、左右(即一小滴)，涂成边缘光滑之园形，直径约0.81.0厘米左右。薄血膜血量只需0.5-1.0立方毫米左右,过多则血膜过厚过大。薄膜宜涂成舌状长约2.5厘米，宽约2厘米3 3、制片、制片疟原虫镜检要求在一张玻片上必须同时制作厚、薄血膜。（1）涂制厚血膜：取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液45l，再用该端中部刮取血液11.5l。将左下角的血滴涂于载片的右端1/3处，由里向外划圈涂成直径为0.81cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到510个白细胞为宜）。厚血膜外观：圆形，厚薄均匀。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求
21、。涂制厚血膜涂制厚血膜（2）推制薄血膜：用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘（最好为磨口边缘）平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持3045度夹角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜（角度过大、速度过快，血膜太薄，反之血膜则太厚），用力要均匀，中途勿停顿，理想的薄血膜，应是一层均匀分布的血细胞。薄血膜外观：呈舌状，头体尾明显，厚薄均匀。位于玻片1/21/3处。推制薄血膜推制薄血膜 厚、薄血膜的位置厚、薄血膜的位置 每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图4 4、血片的固定和脱膜、血片的固定和脱膜 薄血膜用甲醇固定 现场检查的血片厚血膜可以不脱血膜
22、，直接染色。保存时间较长的标本片厚血膜要脱血膜后保存。5 5、制作血片的注意事项、制作血片的注意事项 自然干燥，不能太阳晒和火烤。血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细胞沉在一边，可使厚薄不匀。制成的血膜须完全干燥后(自然情况下约4-12小时才能全干燥；必要时，可置于3 7的暖箱中，促其速干)始可进行固定及染色否则薄血膜中的红细胞边缘皱缩，厚血膜容易在染色时脱落，而常现网状的背景；反之；血片搁置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红蛋白凝固，也不能使用，因此不利于镜检。若把未经固定的血片盛于氯化钙的干燥器内，然后放入冰箱中，可保存3年之久，并仍可较满意的染色。6 6、血片的染色、血片的染色吉氏染液的成份原料：吉氏染粉 10 g 中性甘油 500 ml 纯甲醇 500 ml将吉氏染液配成3%的稀释液水97 ml +3 ml吉氏液 PH7.0-7.2染色2030分钟影响染色效果的因素 染料和溶剂的质量染料和溶剂的质量 染液的新旧染液的新旧 染液稀释后的使用时间染液稀释后的使用时间 染液的稀释浓度染液的稀释浓度 染色时间：根据染液质量、新旧、浓度和染色时间：根据染液质量、新旧、浓度和气温气温 染色用水染色用水PH7.0PH7.07.27.2谢谢
