1、1分子生物学分子生物学-基因操作基因操作(gene manipulation)柴柴 玉玉 荣荣 郑州大学基础医学院郑州大学基础医学院 组胚组胚 Gene Manipulation StartsAt the DNA LevelThe nucleuscontains DNASource:Access Excellence我们需要操纵基因的我们需要操纵基因的DNA编码编码的蛋白质的蛋白质.DNA本身就是一个双螺旋分子本身就是一个双螺旋分子储存在核细胞储存在核细胞.机体内每一个细胞都完全相同的机体内每一个细胞都完全相同的DNA分子分子.DNA Is PackagedSource:Access Exce
2、llence双链双链DNA；染色体染色体 浓缩浓缩染色体是有染色体是有DNA构成构成在整个生命周期的细胞在整个生命周期的细胞,DNA是一个不凝结的形式是一个不凝结的形式.染色体仅出现在细胞分裂的过染色体仅出现在细胞分裂的过程程.染色体包含基因染色体包含基因染色体染色体基因基因资料来源与卓越资料来源与卓越所有基因存在于在染色体上的特定的位置。每条染色体包含有成千上万的基因所有基因存在于在染色体上的特定的位置。每条染色体包含有成千上万的基因5分析工具常常使用的理化分析方法:1.超速离心法用来评估材料。大小2.电泳用来测试高电荷质量比3.紫外吸收分光光度法测定此外光的吸收量和DNA成正相关4.基础化
3、学分析氮磷比率为1.67凝胶电泳凝胶电泳 这项技术可以确定dna凝胶电泳的步骤凝胶电泳的步骤1.用限制性内切酶切割dna.2.使dna片段通过凝胶.3.在凝胶中片段会形成dna带4.DNA带是独一无二的,可以用来确定一个物种.5.DNA带像“遗传指纹”.8DNA:遗传物质在1944年 一组测试确定了传代物质的化学本质应用的技术已经排除了蛋白质和rna作为遗传物质的可能性确定dna就是遗传物质9赫尔希-蔡斯转型实验的过程他们显示噬菌体感染是来自于DNA10DNA 结构罗莎琳富兰克林的x射线数据表明有一个螺旋DNA的形状;数据还表明是一个常规，重复的结构 DNA序列被认为不规则的 沃森和克里克提出
4、了磷酸多糖骨架在外面,碱基对在内的双螺旋结构模型11DNA螺旋 结构类似于一个螺旋楼梯 梯子两侧的把手代表着磷酸多糖 楼梯的台阶像碱基对 每十个碱基对环形上升一周 箭头所示是反向平行的双联12DNA的组成 生化学家在20世纪40年代确定了核苷酸的组城 DNA的组成包括含氮碱基:腺嘌呤(A)胞嘧啶(C)鸟嘌呤(G)胸腺嘧啶(T)磷酸脱氧核糖13DNA的组成 Dna是磷酸核糖在外，碱基对在内的双螺旋分子 碱基对按照一定的法则配对:A结合T G结合C14 RNA 组成成分含氮碱基 和dna一样，只是尿嘧啶取代了胸腺嘧啶磷酸核糖15核苷酸 DNA 和 RNA 的组成亚单位是核苷酸，它们连接在一起，形成
5、核酸链 核苷酸包含一个和磷酸核糖1位相连的基团 Dna和rna中的磷酸和核糖通过磷酸二酯键相连接16DNA 连接核苷酸 是由 核苷和一个磷酸基团通过磷酸二酯键相连接组成的 核苷酸可能含有一个两个甚至三个磷酸基团17核苷三磷酸例如三磷酸核苷有极性 分子的顶端含有一个5磷酸基即5端 底部含有一个3羟基即3端18核酸的物理化学性质DNA和RNA分子能在几个不同的结构变体中出现 相对湿度的变化会引起DNA分子结构的变化 Dna螺旋在生理情况下是右手螺旋，但是在1979年人们发现了左手螺旋形的dna分子 左手螺旋的dna分子被称为Z-DNA一个基因活化需要Z-DNA19各种DNA的结构 高湿度下的dna
6、是B型 DNA 在比细胞内的湿度下降75%左右的环境中dna表现为A型在A型时碱基对不再垂直于螺旋轴A型DNA可以在当一个DNA与RNA在溶液中杂交时看到20Dna的生物特异性 G和C,A和T的比值在任何特定的有机体是固定的 G+C占总百分比的变化从22到73%不等 这样的差别在物理性质上也得到体现21DNA 变性 在热的作用下，dna连保持完整的共价键力量变得削弱和不稳定 维持稳定的力量破坏时，两条连发生变性或融化 当有一半的DN连接断开时的温度成为解链温度或Tm GC 在dna中的含量对解链温度有影响，含量越高解链温度越高22DNA 变性 除了温度下列方法也可使dna变性:有机溶剂 高 p
7、H 低渗溶液 GC 含量也会影响 DNA 密度 直接的，线性相关 这是由于一个A-T碱基的摩尔体积比碱基的G-C摩尔体积要大23DNA 复性 Dna双链解离后在合适的环境中会重新结合在一起，这个过程称为热处理或者是复性n 三个重要的因素:温度 最好低25度于 Tm DNA 浓度 在一定范围内应使浓度较高以便于两条链能识别对方 复兴时间 时间越久，越容易发生24多核苷酸连杂交杂交就是两种不同的核酸结合在一起 双联应当包括 1条 DNA 和1 条RNA 也可以是两条互补的或者是大部分互补的dna链25DNA 大小Dna大小有三种衡量方法:碱基对的数目 分子量-一个碱基对约是660 长度 每10.4
8、个碱基对组成一个螺旋，长度约是33.2 埃可以用电子显微镜或者是凝胶电泳来测量分子量的大小 26DNAs各种大小和形状 噬菌体DNA是典型的例子 有的dna是线状的 超螺旋的 DNA 像扭曲的橡皮筋27 自然状态下的DNA尺寸范围从几千个碱基到成千上万的序列变化不等 小分子量的到哪能通过电子显微镜估算 这项技术当然也能分辨出dna的形状是环形的，线性的，还是超螺旋的DNA 大小28Dna大小与基因组容量大小的关系如何知道在dna分子的特定片段中有过少个基因?不能单从dna的大小来决定 相关因素:Dna和基因的关系?基因之间的关联?29Dna大小与基因组容量大小的关系在dna分子中有过少个基因?
9、假设如下 基因翻译成蛋白质 蛋白质大约有 40,000 D有多少氨基酸这是否代表什么?平均一个氨基酸的质量大约是110 D 平均蛋白质-40000/110=364氨基酸 各氨基酸=3 DNA碱基对 364个氨基酸需要1092碱基对30DNA 基因组容量平均DNA会有多大?大肠杆菌 染色体 4.6 x 106 bp 4200 蛋白质 L噬菌体(侵染大肠杆菌)4.85 x 104 bp 44 蛋白质 x174噬菌体(最小当中的一种)5375 bp 5蛋白质31DNA含量和C值矛盾 C值矛盾是每单倍体细胞的DNA含量值 可能会以为更复杂 复杂生物体比简单的生物体需要更多的基因 相对于酵母，老鼠或人这
10、个观点是正确的 但是青蛙比人类每个细胞多7倍32C值矛盾 观察发现,更复杂的生物并不一定总是需要比简单的有机体更多的基因，这一点被称为C值矛盾 最有可能的解释是,DNA悖论不编码基因的功能是目前复杂的组织有更多的越少的DNA的原因33DNA,基因，蛋白质之间的关系基因?DNA?蛋白质?34基因和蛋白质的关系实验表明,有缺陷的基因表达的酶也会有缺失这些导致一个假设的产生，一个基因负责制造一种酶可能但并不完全正确的假设1.酶可以有几个多肽、每一个基因编码只有一个多肽2.许多基因编码非酶蛋白质3.一些基因的终端产物不是多肽链组成351.蛋白质序列与基因序列相关蛋白质序列与基因序列相关 NH3+-Me
11、t-Asp-Gly-Trp-Ser-Lys-COO-ATG GAT-GCT TGG-AGT-AAA C C C G A TCT G C A G2.基因的遗传信息被用来设计聚合酶链反应的引物基因的遗传信息被用来设计聚合酶链反应的引物正向引物:5-ATGGAT/CGCN-3反向引物:5-T/CTTNC/GT/ACCA-3注释:T/C=在这个位置混合T和C;N=四个核苷酸的混合物反向引物正相反补充的基因序列基因和蛋白质的关系36基因的活性基因执行三个主要的角色 保守复制 生成RNA和蛋白质 积累突变37A-复制 富兰克林和威尔金斯利用x射线衍射技术得到DNA的数据,沃森和克里克提议DNA双螺旋结构:两条链互补 知道一条链的序列就可知道另一条链的序列 半保留复制保证在每个女儿双链中有一条来源于父亲38B-基因产生多肽链 基因表达的过程就是基因产物的产生过程 两个必要的步骤 转录 翻译 密码子:对应于一个氨基酸的三个核苷酸碱基39C-积累变异基因变异的途径:单碱基转变 碱基缺失 碱基插入越更加激烈的改变，基因越可能会完全失去活性
