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资源描述

1、RT-PCR三部曲RNARNA提取提取逆转录为cDNAPCRPCRRNA提取-第一步提取RNA器械的处理n玻璃、不锈钢器皿:180度干烤46小时(不离人)n塑料制品:-高压灭菌,烘干-DEPC水浸泡过夜,捞出沥干水分(很重要),烘干-电泳槽可用0.5M的NaOH浸泡20min RNA提取所需试剂和器皿清单干烤的物品:干烤的物品:n玻璃器皿:10002000ml的大烧杯(浸泡Tip)、100ml的量筒(配乙醇用)、带玻璃塞子的玻璃瓶3个(装异丙醇、氯仿、75%的乙醇)n铝饭盒(放ET管)、镊子(夹Tip和EP管用)处理的塑料制品:处理的塑料制品:n枪头(1000ul/200ul/20ul)nEP

2、管(1.5ml、200ul)nEP管盒子(要与枪头配套)制剂:nDEPC、Trizoln异丙醇、氯仿、乙醇(未开封的)n电泳缓冲液、琼脂糖、EBDEPC(焦碳酸二乙酯)nDEPC水,nA:配制好未消毒;蒸馏水中加入0.1%DEPC,室温搅拌4小时以上至完全溶解。n作用:处理RNA提取的器材(不能干烤的物品)浸泡过夜nB:配制好已消毒。高压灭菌20分钟,冷却备用。(通过高压消毒,该物质会降解,从而无毒)n作用:配置75%乙醇,溶解RNA防止RNA降解n有专门的RNA提取区域:避免人员流动n实验人员带口罩、帽子,勤换手套n快速操作n保证低温环境:降低环境温度、冰上操作(冰盒)、低温离心1 Rnas

3、e是一种蛋白酶,能够降解RNA。2 皮肤、唾液3 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时,要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。什么是RNA酶Rnase?n1 1mlTrizol/孔,室温放置5min,用吸管吹打吸取到EP管中;2 加200ul氯仿 剧烈振荡15s,室温放置23min;3 12000g 低温离心 15min;4 小心取上层水相,一般400-450ul就足够了(千万不要贪多)!n5 加入500ul异丙醇 摇匀(反复颠倒10次),室温放置10min;6 12000g 低温离心 10min;7 75乙醇 1ml 洗涤沉淀;8 7500g 离心 5min;(也可加大离心速度,这样RNA不易被倒掉)9 小心弃去乙醇(不要把RNA倒掉),用小Tip吸干净残余的乙醇(底部不要吸的太干,室温干燥510min;n10 加2030ul DEPC水溶解沉淀。n留取6ul,其余立即分装两份冻存(-80度)n2ul用于定量,余下用于跑胶电泳-判断RNA完整性和是否有DNA污染n新鲜配置的电泳缓冲液n电泳时间不要太久,100120V,1015min足够了。如何判断RNA的完整性:n最理想的RNA降解的RNA是酱紫滴定量n1:70(1ul+69ul的水)

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