1、l酶就是由细胞合成的，在机体内行使催酶就是由细胞合成的，在机体内行使催化功能的生物催化剂化功能的生物催化剂。没有酶的反应没有酶的反应有酶催化的反应有酶催化的反应第一节第一节 酶的概念及其化学本质酶的概念及其化学本质l主要是蛋白质，极少数是RNA（核酶）。All enzymes are proteins except some RNAs and not all proteins are enzymes.1.1.绝对特异性（脲酶）绝对特异性（脲酶）2.2.相对特异性（磷酸酶）相对特异性（磷酸酶）3.3.立体异构特异性立体异构特异性 （D-D-氨基酸氧化酶）氨基酸氧化酶）高度的催化效率高度的催化效率
2、 高度的特异性高度的特异性 酶活力可调节性酶活力可调节性酶促反应的特点酶促反应的特点一、酶的高效催化性一、酶的高效催化性二、酶的高度专一性二、酶的高度专一性1.绝对专一性绝对专一性棉子糖棉子糖3、立体异构专一性、立体异构专一性三、酶促反应的温和性与对反应条件的高度敏感性三、酶促反应的温和性与对反应条件的高度敏感性酶的活性是受酶的活性是受严格控制的严格控制的酶促反应一般酶促反应一般在在pH 5-8 水溶水溶液中进行，反液中进行，反应温度范围为应温度范围为20-40C。高温或其它苛高温或其它苛刻的物理或化刻的物理或化学条件，将引学条件，将引起酶的失活。起酶的失活。四、酶活性的可调节性四、酶活性的可
3、调节性如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。根据酶分子的结构特点可将酶分为三类：根据酶分子的结构特点可将酶分为三类：单体酶单体酶：仅有一条多肽链组成的酶。仅有一条多肽链组成的酶。寡聚酶寡聚酶：有几个甚至几十个亚基组成的酶。有几个甚至几十个亚基组成的酶。多酶复合体多酶复合体：由功能相关的一组酶在空间相互嵌合的复合体。由功能相关的一组酶在空间相互嵌合的复合体。一一、酶的化学组成与分类、酶的化学组成与分类多酶复合体多酶复合体一一、酶的化学组成与分类、酶的化学组成与分类（一）单纯蛋白酶（一）单纯蛋白酶:酶本身就是蛋白质，没有其它成分。酶本身就是蛋白质，没有其它成分。酶按其分子组成
4、分为单纯酶和结合酶两类：酶按其分子组成分为单纯酶和结合酶两类：（二）结合酶（二）结合酶 由蛋白质和非蛋白部分组成的酶。由蛋白质和非蛋白部分组成的酶。非蛋白部分一般是有机小分子化合物或金属非蛋白部分一般是有机小分子化合物或金属离子，称为辅因子（辅酶或辅基）。缺少辅因子，离子，称为辅因子（辅酶或辅基）。缺少辅因子，酶的催化作用就会消失。酶的催化作用就会消失。P106P106表表 蛋白质部分蛋白质部分（酶蛋白）（酶蛋白）+非蛋白质部分非蛋白质部分（辅助因子）（辅助因子）结合酶结合酶单纯酶单纯酶小分子有机化合物小分子有机化合物（B B族维生素）族维生素）无机金属离子无机金属离子辅酶辅酶辅基辅基酶酶=全
5、酶全酶（有活性）（有活性）结合酶结合酶酶蛋白作用：酶蛋白作用：辅酶或辅基的作用：辅酶或辅基的作用：起传递电子、原子和某些基团的作用起传递电子、原子和某些基团的作用 即即决定反应的类型决定反应的类型决定催化反应的特异性决定催化反应的特异性辅助因子辅助因子金属离子作用：金属离子作用：1.活性中心的组成成分；活性中心的组成成分；2.连接酶与底物的桥梁；连接酶与底物的桥梁；3.维持酶的构象维持酶的构象结合酶各部分的作用结合酶各部分的作用1.1.氧化还原酶类（氧化还原酶类（oxidoreductaseoxidoreductase):):催化氧化还原反应：A A2H +B A+B2H +B A+B 可分为
6、 需氧脱氢酶、氧化酶和不需氧脱氢酶。2.2.转移酶类转移酶类(transferanses(transferanses)：催化底物功能基团之间的转移反应：AB+C A+BCAB+C A+BC3.3.水解酶类水解酶类(hydrolases(hydrolases):):催化底物进行水解反应:AB+HOH AOH+BH AB+HOH AOH+BH4.4.裂合酶类裂合酶类(lyases(lyases)：催化底物裂解反应，并产生双键，或其逆反应，将一个基团加到双键上：A AB A+BB A+B5.5.异构酶类异构酶类(isomerases(isomerases)：催化各种同分异构体的相互转变：A B A
7、B 如异构酶和消旋酶催化的反应。6.6.合成酶合成酶(连接酶连接酶)类类(ligases(ligases)：这类酶催化一切必须与ATP分解相联，并由二种物质合成一种物质的反应：A+B+ATP AA+B+ATP AB+ADP+Pi(B+ADP+Pi(或或 AMP+PPiAMP+PPi)例如谷氨酰胺合成酶催化的反应.乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（EC.1.1.1.27）除上述除上述6类酶依次编号外，根据酶催化的化学键特点和参类酶依次编号外，根据酶催化的化学键特点和参加反应基团不同，将每一类分成亚类和亚亚类。每个酶分类加反应基团不同，将每一类分成亚类和亚亚类。每个酶分类由由4个阿拉伯数字组成，数字前冠以个
8、阿拉伯数字组成，数字前冠以EC（eneyme commission)命名原则如下命名原则如下（1）根据酶的底物命名。如蛋白酶、脂肪酶）根据酶的底物命名。如蛋白酶、脂肪酶（2）根据所催化的反应的性质命名。如水解酶、氧化酶）根据所催化的反应的性质命名。如水解酶、氧化酶（3）有的酶结合上述两个原则命名。）有的酶结合上述两个原则命名。例如：乙醇脱氢酶例如：乙醇脱氢酶（4）在这些基础上有时还加上酶的来源或酶的其它特点。）在这些基础上有时还加上酶的来源或酶的其它特点。如木瓜蛋白酶、蛇毒磷酸二酯酶如木瓜蛋白酶、蛇毒磷酸二酯酶三三 酶的命名酶的命名（一）习惯命名法（一）习惯命名法 要求能确切表明底物的化学本质
9、及酶的性质，包括两部分，即底物名称及反应类型，底物间用“：”分开，若底物之一是水则可略去不写。ATP+CH3COOH ADP+CH3CO P其系统名为：ATP：乙酸磷酸转移酶（二）国际系统命名法（二）国际系统命名法第四节第四节 酶的作用机理酶的作用机理 研究酶的催化机理，主要是为研究酶的催化机理，主要是为了说明酶是如何快速完成催化反应了说明酶是如何快速完成催化反应的，为什么能专一性地选择底物，的，为什么能专一性地选择底物，如何高效率地实现断键和成键催化如何高效率地实现断键和成键催化过程的，以便在生产实践中合理运过程的，以便在生产实践中合理运用。用。在一个化学反应体系中，只有处于活化态的分子才能
10、在一个化学反应体系中，只有处于活化态的分子才能在分子碰撞中发生反应。在分子碰撞中发生反应。反应物中活化分子越多，则反应速率越快。反应物中活化分子越多，则反应速率越快。活化分子具有的能量称为活化能。活化分子具有的能量称为活化能。分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量称为活化能。要的能量称为活化能。物质进行反应所需要活化能越高，则表明该物质越稳物质进行反应所需要活化能越高，则表明该物质越稳定。而酶作为催化剂能降低参加反应物质的活化能，因而定。而酶作为催化剂能降低参加反应物质的活化能，因而酶促反应具有了高效性。酶促反应具有了高效性。那些因
11、素促成酶具有高的催化效率？那些因素促成酶具有高的催化效率？酶酶可降低所催化反可降低所催化反应应的活化能的活化能SPESESTEPST反应进行方向反应能量变化无酶时所需能量无酶时所需能量有酶时所需能量有酶时所需能量差別在那差別在那里里？T=Transition state二、中间产物学说使分子变为活化分子的使分子变为活化分子的途径有二个途径有二个：(1)对反应体系加热或对反应体系加热或用光照射。用光照射。（2）改变反应途径改变反应途径,降降低反应能阈，使反应沿低反应能阈，使反应沿着一个活化能阈较低的着一个活化能阈较低的途径进行。途径进行。1.1.酶促反应改变反应途径酶促反应改变反应途径目前比较圆
12、满的解释是中间产物学说。目前比较圆满的解释是中间产物学说。即酶在催化反应时，首先与底物结合形成一个不稳即酶在催化反应时，首先与底物结合形成一个不稳定的中间产物定的中间产物ESES。然后。然后ESES再分解为产物和原来的酶：再分解为产物和原来的酶：E+SE+SESESE+PE+P 当底物和酶互补结合形成过渡态中间复合物时，释放出当底物和酶互补结合形成过渡态中间复合物时，释放出一部分结合能，使一部分结合能，使 ES ES 比比 E E 和和 S S 单独存在时能解较低，从单独存在时能解较低，从而使整个反应的活化能降低，加快了化学反应速度。而使整个反应的活化能降低，加快了化学反应速度。酶如何使反应的
13、活化能降低？酶如何使反应的活化能降低？一般化学反应历程：一般化学反应历程：S P酶促反应历程：酶促反应历程：S+E ES E+P 了解酶的活性中心，有助于了解中间产物的形成酶的活性中心酶的活性中心酶分子表面与底物结合并将底酶分子表面与底物结合并将底 物转化为产物的空间结构区域。物转化为产物的空间结构区域。活性中心包括结合基团和催化基团。活性中心包括结合基团和催化基团。结合部位决定酶的专一性，结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。催化部位决定酶所催化反应的性质。必需基团必需基团酶分子中与酶活性相关的基团酶分子中与酶活性相关的基团 （羟基、巯基、咪唑基和羧基）。（羟基、巯基、咪唑
14、基和羧基）。活性中心活性中心内内必需基团必需基团结合和催化结合和催化活性中心活性中心外外必需基团必需基团维持酶构象维持酶构象胰凝乳蛋白酶活性中心的三个氨活性中心的三个氨基酸残基形成催化基酸残基形成催化三联体。三联体。胰蛋白酶主链在空间的走向及活性中心胰蛋白酶主链在空间的走向及活性中心胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶与底物类似物复合物的结晶学研究说明了专一胰凝乳蛋白酶与底物类似物复合物的结晶学研究说明了专一性识别部位的位置以及敏感肽键的可能取向性识别部位的位置以及敏感肽键的可能取向（1 1）活性中心是一个三维实体，通常由在一级结构上并不）活性中心是一个三维实体，通常由在一级结构上并不 相邻的氨基
15、酸残基组成相邻的氨基酸残基组成（2 2）活性中心只占酶总体积很小的一部分（约）活性中心只占酶总体积很小的一部分（约1 12%2%）（3 3）活性中心为酶分子表面的一个裂缝、空隙或口袋，中）活性中心为酶分子表面的一个裂缝、空隙或口袋，中 心内多为疏水氨基酸残基，但也有少量极性氨基酸残心内多为疏水氨基酸残基，但也有少量极性氨基酸残 基，以便底物结合和进行催化。基，以便底物结合和进行催化。（4 4）与底物结合为多重次级键，包括氢键、疏水键和范德）与底物结合为多重次级键，包括氢键、疏水键和范德 华力；华力；（5 5）底物结合的特异性在一定程度上取决于活性中心和底）底物结合的特异性在一定程度上取决于活性
16、中心和底 物之间在结构上的互补性；物之间在结构上的互补性；（6 6）活性中心的构象不是固定不变的，而是具有一定的柔）活性中心的构象不是固定不变的，而是具有一定的柔 性。性。四、诱导契合学说四、诱导契合学说解释酶专一性的几种模型：解释酶专一性的几种模型：（1）锁与钥匙学说）锁与钥匙学说（2）诱导契合学说）诱导契合学说 为了阐明酶的催化机理，人们在大为了阐明酶的催化机理，人们在大量实验工作的基础上，从不同角度提出量实验工作的基础上，从不同角度提出了种种假设。了种种假设。但酶的多底物现象，酶促反应的催化但酶的多底物现象，酶促反应的催化，及酶促反应的相对专一性都无法用这一，及酶促反应的相对专一性都无法
17、用这一假说解释。假说解释。锁钥假说锁钥假说:认为整个酶分子认为整个酶分子的天然构象是具的天然构象是具有刚性结构的，有刚性结构的，酶表面具有特定酶表面具有特定的形状。酶与底的形状。酶与底物的结合如同一物的结合如同一把钥匙对一把锁把钥匙对一把锁一样。一样。酶与底物结合的酶与底物结合的“锁与钥匙锁与钥匙”模型模型酶与底物结合的酶与底物结合的“诱导契合诱导契合”模型模型诱导契合假说：诱导契合假说：酶的活性中心具有一定的柔性，当底物与酶相遇酶的活性中心具有一定的柔性，当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的改变，使活时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的改变，使活性中心上有关基团达到正确的排列和
18、定向，因而使酶性中心上有关基团达到正确的排列和定向，因而使酶和底物契合而结合成中间络合物，并引起底物发生反和底物契合而结合成中间络合物，并引起底物发生反应。应。l酶与底物结合的酶与底物结合的“诱导契合诱导契合”的要点的要点己糖激酶的诱导契合 诱导诱导契合学说契合学说比较合理地解释了酶促反应比较合理地解释了酶促反应的的 专一性，又为解释酶促反应高效性奠定了基专一性，又为解释酶促反应高效性奠定了基础。础。其理论要点是，酶与底物诱导互变，功能基其理论要点是，酶与底物诱导互变，功能基团与反应部位定向排布，达到互补契合，然后发团与反应部位定向排布，达到互补契合，然后发生反应。生反应。中间产物学说中间产物
19、学说E+S=ES-E+P五、使酶具有高催化效率的因素（一）（一）邻近效应邻近效应（proximity effectproximity effect）和定向效应和定向效应（orientation effectorientation effect）n在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做加的效应叫做邻近效应。邻近效应。n定向效应：定向效应：当专一性底物
20、向酶活性中心靠近时，会当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。l化学反应的速度取决于反应物分子的有效碰撞。处在化学反应的速度取决于反应物分子的有效碰撞。处在溶液中的反应物分子只有通过彼此扩散相遇才有可能溶液中的反应物分子只有通过彼此扩散相
21、遇才有可能发生反应。发生反应。l 在生理条件下，一个典型的溶质分子和酶分子活性在生理条件下，一个典型的溶质分子和酶分子活性部位结合的频率大约是部位结合的频率大约是108109 molL-1S-1。如果反。如果反应物之间有应物之间有静电吸引静电吸引，相遇的频率可能是很高的，相遇的频率可能是很高的l在反应中。仅有靠近还不够，还需要反应的基团彼此在反应中。仅有靠近还不够，还需要反应的基团彼此相互严格的定向。只有既靠近又定向，反应分子才被相互严格的定向。只有既靠近又定向，反应分子才被作用迅速形成过渡态（如下图所示）。作用迅速形成过渡态（如下图所示）。A.A.反应物的反应基团反应物的反应基团 和催化基团
22、既不靠和催化基团既不靠 近，也不彼此定向近，也不彼此定向B.B.两个基团靠近，但不两个基团靠近，但不 定向，也不利于反应定向，也不利于反应C.C.两个基团既靠近，又两个基团既靠近，又 定向，大大有利于底定向，大大有利于底 物形成过渡态，加速物形成过渡态，加速 反应反应邻近与定向（轨道定向）效应的示意图邻近与定向（轨道定向）效应的示意图 邻近效应需要底物分子同酶弱的结合，即这种结合是低亲和邻近效应需要底物分子同酶弱的结合，即这种结合是低亲和力的。实验表明，邻近效应对酶促反应的贡献使反应的效率提高力的。实验表明，邻近效应对酶促反应的贡献使反应的效率提高10104 410105 5。酶酶-底复合物形
23、成时，酶分子构象发生变化，底物分子也底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。从而降低了反应的活化能。底物结合可以诱导酶分子构象的变化，而变化的酶分子又底物结合可以诱导酶分子构象的变化，而变化的酶分子又可使底物分子的敏感键产生可使底物分子的敏感键产生“张力张力”，甚至，甚至“形变形变”，从而，从而促进酶促进酶-底物中
24、间产物进入过渡态。这实际上是酶与底物诱导底物中间产物进入过渡态。这实际上是酶与底物诱导契合的一个动态过程。羧肽酶契合的一个动态过程。羧肽酶A A的的X-X-衍射分析结果证明了衍射分析结果证明了“电电子张力子张力”的存在。的存在。酶催化的张力与变形效率的贡献至少提高酶催化的张力与变形效率的贡献至少提高1041045 5（二）底物分子变形或扭曲（二）底物分子变形或扭曲底物分子发生变形底物分子和酶分子都发生变形底物和酶结合时的构象变化示意图底物和酶结合时的构象变化示意图 这里指广义的酸碱催化，即质子供体及质子受体的催化。这里指广义的酸碱催化，即质子供体及质子受体的催化。发生在细胞内的许多反应类型是受
25、广义的酸碱催化的，达到降低发生在细胞内的许多反应类型是受广义的酸碱催化的，达到降低反应活化能的过程。反应活化能的过程。酶活性部位上的某些基团（如氨基、羧基、硫氢基、酚羟基及咪酶活性部位上的某些基团（如氨基、羧基、硫氢基、酚羟基及咪唑基等）可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。唑基等）可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。如如His His 残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。功能团。-COOH,-NH3,-SH,+OHNHNH+-COO,-NH2,-S,-.-O-NHN:（三）酸碱催化（三）酸碱催化 影响酸
26、碱催化反应速度的因素有两个。影响酸碱催化反应速度的因素有两个。1）酸碱的强度：）酸碱的强度：在这些功能基中，组氨酸咪唑基的解离常数是在这些功能基中，组氨酸咪唑基的解离常数是6.0，这意，这意味着咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的味着咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的H+相近，因相近，因此它在接近于中性条件下有一半以酸形式存在，另一半以碱此它在接近于中性条件下有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在。也就是说咪唑基既可以作为质子供体，又可作为形式存在。也就是说咪唑基既可以作为质子供体，又可作为质子受体在酶反应中发挥催化作用。因此，咪唑基是催化中质子受体在酶反应中发挥催化作用。因此，咪唑基是催化
27、中最有效且最活泼的一个催化功能基；最有效且最活泼的一个催化功能基；2）功能基供出质子和接受质子的速度：）功能基供出质子和接受质子的速度：在这方面，咪唑基又是特别突出，它供出或接受质子的在这方面，咪唑基又是特别突出，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半寿期小于速度十分迅速，其半寿期小于10-10秒。而且供出和接受质子秒。而且供出和接受质子的速度几乎相等。的速度几乎相等。广义的酸碱催化具有它的独到之处，因为在细胞中接近中性广义的酸碱催化具有它的独到之处，因为在细胞中接近中性PH的条件下，的条件下，H+及及OH-的浓度太低，不足以起到催化剂的作用。的浓度太低，不足以起到催化剂的作用。例如牛胰核糖核酸
28、酶及牛凝乳蛋白酶等都是通过广义的酸碱例如牛胰核糖核酸酶及牛凝乳蛋白酶等都是通过广义的酸碱催化而提高酶反应速度的。催化而提高酶反应速度的。许多生物化学上的反应易遭受到广义的酸许多生物化学上的反应易遭受到广义的酸-碱碱催化。具有酸催化。具有酸-碱催化能力的酶对溶液碱催化能力的酶对溶液pHpH非常敏感，非常敏感，因为因为pHpH影响酶活性部位的侧链质子化状态。影响酶活性部位的侧链质子化状态。广义的酸或碱催化可使反应速度提高广义的酸或碱催化可使反应速度提高1010100100倍。倍。n催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而
29、提高反应速度的过程，称为使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。共价催化。n酶中参与共价催化的基团主要包括以下酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团亲核基团：His His 的咪唑基，的咪唑基，CysCys 的巯基，的巯基，Asp Asp 的羧基，的羧基，Ser Ser 的羟的羟基等；基等；亲电子基团：亲电子基团：H H+、MgMg2+2+、MnMn2+2+、FeFe3+3+n某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。与共价催化作用。（四）（四）共价催化共价催化 生物学上重要的亲核剂生物学上重要的亲核剂 是带
30、负电荷的基团或含有容易与缺电子是带负电荷的基团或含有容易与缺电子基团形成共价键的未共用的电子对。基团形成共价键的未共用的电子对。生物学上重要的亲电剂：生物学上重要的亲电剂：是那些带正电荷的、含未饱和的价电子是那些带正电荷的、含未饱和的价电子层的层的或具电负性的原子。或具电负性的原子。共价催化在酶的催化反应中占据十分共价催化在酶的催化反应中占据十分突出的位置，对酶促反应速度的加速贡献突出的位置，对酶促反应速度的加速贡献大约是大约是100100倍。倍。许多氧化许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能
31、。许多激酶的底物为许多激酶的底物为ATP-Mg2+ATP-Mg2+复合物。复合物。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。結合結合区区可避免水分子干可避免水分子干扰扰在在避开避开水分子的干水分子的干扰扰下，分子間的下，分子間的离子键离子键才容易產生。才容易產生。-+（七）（七）多元催化作用多元催化作用n酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而
32、使整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态底物达到最佳反应状态。n 同时几个基元催化反应协同作用，例如胰凝同时几个基元催化反应协同作用，例如胰凝乳蛋白酶的乳蛋白酶的“电荷中继网电荷中继网”等。等。不同的酶，起作用的因素可能是不同的，可不同的酶，起作用的因素可能是不同的，可以受一种或多种因素的影响。以受一种或多种因素的影响。第五节第五节 酶活力及其测定酶活力及其测定一、一、酶活力及其测定酶活力及其测定 酶活力：酶活力：是酶促反应的能力。是酶促反应的能力。酶活力大小是指在一定条件所催化的某一化酶活力大小是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，学反应速
33、度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高；反之则表示该酶活力低。酶活力越高；反之则表示该酶活力低。pH、温度、离子强度和反应产物都会影响酶促反应体系的稳定、温度、离子强度和反应产物都会影响酶促反应体系的稳定酶活性测定，应酶活性测定，应测定酶促反应的初速度测定酶促反应的初速度（一）酶活力单位（一）酶活力单位：这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示（少酶单位来表示（U/g或或U/ml）。）。二、酶催化效率的表示单位二、酶催化效率的表示单位比活力：每比活力：每mg蛋白质所含有的酶活力单位数。蛋白质所含有的酶活力单位数。（
34、二）（二）酶的比活力酶的比活力 在酶的纯化过程中在酶的纯化过程中,每步纯化后都要测定酶的每步纯化后都要测定酶的比活力比活力,例如例如,某酶经过四个纯化步骤后某酶经过四个纯化步骤后,获得如获得如下的数据下的数据:纯化步骤：纯化步骤：总活力：总活力：6 4 3 26 4 3 2 总蛋白：总蛋白：20 10 5 220 10 5 2 比活力：比活力：6/20 4/10 3/5 2/26/20 4/10 3/5 2/2 在提纯中，总活性在减少，总蛋白也在减少，但在提纯中，总活性在减少，总蛋白也在减少，但比活性在提高。比活性在提高。此外此外,在酶的纯化工作中还要计算两个具有实际意义在酶的纯化工作中还要计
35、算两个具有实际意义 的量的量,即即纯化倍数和回收率纯化倍数和回收率(产量产量%)%)：纯化倍数纯化倍数 =每次比活力每次比活力/第一次比活力第一次比活力 回收率（产量回收率（产量%）=(=(每次的总活力每次的总活力/第一次总活力第一次总活力)100100 19721972年，为了使酶的活力单位与国际单位制中的反应速度年，为了使酶的活力单位与国际单位制中的反应速度(mol/s)表达方式一致，推荐使用一种新的单位（酶的转换数），表达方式一致，推荐使用一种新的单位（酶的转换数），既既KatalKatal,1Kat 1Kat为每秒能使为每秒能使1mol1mol底物转化成产物的酶量。底物转化成产物的酶量
36、。1Kat6 107 IU 1 IU16.6710-9 Kat 即1 IU=16.7 nKat 这种表示方法代表了酶催化底物转化的效率。这种表示方法代表了酶催化底物转化的效率。（三）酶转换数 （Katal）酶的转换数：酶的转换数：kcat值值 kcat值以一定条件下每秒钟每个酶分子转换底值以一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数来表示酶的催化效率。物的分子数来表示酶的催化效率。l 即在酶浓度一定时，底物浓度远远大于酶的浓度，即在酶浓度一定时，底物浓度远远大于酶的浓度，既体系中的酶活性中心被底物饱和情况下，酶对特定既体系中的酶活性中心被底物饱和情况下，酶对特定底物的最大催化速度（底物的最大催
37、化速度（VmaxVmax)，称为转换数，称为转换数（turnover number），也称为催化常数（也称为催化常数（KatKat，KatalKatal)。l 米氏方程推导中的米氏方程推导中的k k3 3即为转换数（即为转换数（ESE+PESE+P，箭头，箭头上以上以k k3 3表示）。表示）。l 当底物浓度过量时，因为当底物浓度过量时，因为VmaxVmax=k=k3 3EE0 0，故此转换，故此转换数可用以下公式进行计算：数可用以下公式进行计算：l转换数转换数=k=k3 3=Vmax/E=Vmax/E0 0 （四）自定义的酶活力单位这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能这种单位简单方便，省
38、去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。进行酶活力的相对比较。一、底一、底物物浓度对酶促反应速浓度对酶促反应速度影响度影响l在底物浓度低时在底物浓度低时,反应反应速度与底物浓度成正比，速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。表现为一级反应特征。l当底物浓度达到一定值，当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到结合后，反应速度达到最大值（最大值（V Vmaxmax），此时），此时再增加底物浓度，反应再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为速度不再增加，表现为零级反应特征。零级反应特征。l。l 这种酶促反应的动力学曲线可以用中间产物学说解释这种酶促反应的
39、动力学曲线可以用中间产物学说解释l k1 k2k1 k2l E +S ES P +E E +S ES P +E l k-1 k-1 一般以产物的生成速度代表整个酶催化反应速度，而产物生成一般以产物的生成速度代表整个酶催化反应速度，而产物生成的速度取决于中间产物的浓度的速度取决于中间产物的浓度.因此因此,整个酶促反应的速度取决于整个酶促反应的速度取决于中间产物的浓度中间产物的浓度.l 在酶促反应初始，底物与酶的结合速度反应了酶促反应速度，在酶促反应初始，底物与酶的结合速度反应了酶促反应速度，但当所有的酶与底物都结合后就达到最大反应速度，此时再增加底但当所有的酶与底物都结合后就达到最大反应速度，此
40、时再增加底物浓度，表观呈现的是一种酶与底物结合和解离的动态平衡，最大物浓度，表观呈现的是一种酶与底物结合和解离的动态平衡，最大反应速度不会改变。反应速度不会改变。米氏方程米氏方程19131913年，德国化学家年，德国化学家MichaelisMichaelis和和MentenMenten根据中根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。系的著名公式，称为米氏方程。V=Vmax SKm+Sv v 在不同在不同SS时的反应速度时的反应速度K Km m
41、米氏常数米氏常数V Vmaxmax 最大反应速度最大反应速度S S 底物浓度底物浓度 (一）米氏方程的推导：q l米氏方程表明了当已知米氏方程表明了当已知Km 和和Vmax 时时,底物浓度底物浓度与反应速度之间的关系与反应速度之间的关系.l在底物浓度较低时在底物浓度较低时,KmS,米氏方程分母中米氏方程分母中的的S可忽略可忽略,既反应速度既反应速度与底物浓度成正比与底物浓度成正比;为一为一级反应级反应.l在底物浓度很高时在底物浓度很高时,S Km,Km可忽略可忽略,此时此时V=Vmax,反应速度与底物浓反应速度与底物浓度无关度无关,为零级反应为零级反应.因此米氏方程是因此米氏方程是v对对s为变
42、量的典型双曲线方程为变量的典型双曲线方程当v=1/2Vmax时：Km的物理意义的物理意义：2.Km是酶的特征常数：是酶的特征常数：3、Km可以表示酶与底物的亲合可以表示酶与底物的亲合：4、当、当Km已知时，可求得任何底物浓度下酶活性中心已知时，可求得任何底物浓度下酶活性中心被底物饱和的分数被底物饱和的分数(Fes)。根据研究所需要的反应程度，加入合适的底物浓根据研究所需要的反应程度，加入合适的底物浓 度。度。Km 在实际工作中有以下应用：在实际工作中有以下应用：催催 化可逆反应的酶，两个方向的化可逆反应的酶，两个方向的Km 是不同的。是不同的。6、了解底物在细胞内的浓度，判断酶活性是否受到抑制
43、、了解底物在细胞内的浓度，判断酶活性是否受到抑制7、判断代谢中的限速步骤、判断代谢中的限速步骤8、判断抑制剂类型、判断抑制剂类型9、药用酶的筛选应用、药用酶的筛选应用1 1 K Km 1 1m 1 1 =+V V V Vmaxmax S S V Vmaxmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km（四）米氏常数Km的测定：pH影响酶和底物的解离状态，只有它们处于最佳解离状态时，才容易形成中间产物，使反应顺利进行。q三、三、pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响 q四、温度对酶促反应速度的
44、影响温度对酶促反应速度的影响 温度对酶促反应有两种互温度对酶促反应有两种互相矛盾的影响：相矛盾的影响：一方面，酶促反应和普通一方面，酶促反应和普通化学反应相似，遵循化学反应相似，遵循温度系数温度系数的一般规律；的一般规律；另一方面，随着温度的升另一方面，随着温度的升高，酶蛋白急剧变性，使酶迅高，酶蛋白急剧变性，使酶迅速失活。这两种因素综合影响速失活。这两种因素综合影响的结果，就出现了酶的最适温的结果，就出现了酶的最适温度。度。最适温度最适温度激活剂激活剂能使酶活性提高的物质能使酶活性提高的物质 Mg2+ATP对己糖激酶对己糖激酶 Cl对唾液淀粉酶对唾液淀粉酶巯基酶抑制剂巯基酶抑制剂丝氨酸酶抑制
45、剂丝氨酸酶抑制剂 不可逆抑制不可逆抑制抑制作用抑制作用可逆性抑制可逆性抑制反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用竞争性抑制作用竞争性抑制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用抑制剂抑制剂（inhibitorinhibitor）使酶活性降低而又不使酶变性的物质使酶活性降低而又不使酶变性的物质l概念：概念：抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合，不能抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合，不能 l 用透析、超滤等物理方法将其除去恢复酶活性。用透析、超滤等物理方法将其除去恢复酶活性。l常见抑制剂：巯基酶抑制剂常见抑制剂：巯基酶抑制剂 丝氨酸酶抑制剂丝氨酸酶抑制剂 巯基酶：巯基酶：以巯基（以巯基（-SH-SH）为必需
46、基团的酶）为必需基团的酶 抑制剂：抑制剂：重金属离子重金属离子AgAg+、HgHg2+2+、砷剂等、砷剂等 解除重金属离子中毒的常用物质：二巯基丙醇解除重金属离子中毒的常用物质：二巯基丙醇 丝氨酸酶：丝氨酸酶：以丝氨酸羟基以丝氨酸羟基(-OH)(-OH)为必需基团的酶为必需基团的酶 抑制剂：抑制剂：有机磷化合物有机磷化合物 如胆碱酯酶抑制可用解磷定解除如胆碱酯酶抑制可用解磷定解除乙酰胆碱乙酰胆碱+H2O胆碱胆碱+乙酸乙酸胆碱酯酶胆碱酯酶有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂胆碱使神经兴奋胆碱使神经兴奋中毒中毒（肌肉震颤、瞳孔缩小、流涎、多汗、呼吸困难）（肌肉震颤、瞳孔缩小、流涎、多汗、呼吸困难）有机磷农药的
47、中毒机理：有机磷农药的中毒机理：l概念：抑制剂与酶非共价结合，可用透析、超滤等方法除去而恢复酶活性。l类型：竞争性抑制作用 非竞争性抑制作用 反竞争性抑制作用l抑制剂与底物结构相似，两者竞争与酶的活性中心结合，当抑制剂与酶结合后，可以干扰酶与底物的结合，使酶的催化活性降低。EEE（1）抑制剂与底物的结构相似；）抑制剂与底物的结构相似；（2）抑制剂与底物相互竞争与酶活性中心结合；）抑制剂与底物相互竞争与酶活性中心结合；（3）抑制程度取决于）抑制程度取决于I/S相对比例；相对比例；（4）增加底物浓度，可以减少或解除抑制作用；）增加底物浓度，可以减少或解除抑制作用；（5）Km值增大，值增大，Vm值不
48、变值不变（6）动力学曲线与米氏有别）动力学曲线与米氏有别l竞争性抑制作用的速度方程：竞争性抑制作用的速度方程：1、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用COOHH2 NPABA(对氨基苯甲酸)SO2NHRSN（磺胺类药磺胺类药）H2 N2.磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的竞争性抑制作用磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的竞争性抑制作用磺胺类药物竞争细菌的二氢叶酸合成酶，妨碍细菌合磺胺类药物竞争细菌的二氢叶酸合成酶，妨碍细菌合成二氢叶酸。二氢叶酸是细菌生存必需的，细菌又不成二氢叶酸。二氢叶酸是细菌生存必需的，细菌又不能从环境中获得，因此阻碍了二氢叶酸合成也就起到能从环境中
49、获得，因此阻碍了二氢叶酸合成也就起到了抑菌作用，磺胺类药主要作用是抑制细菌的繁殖，了抑菌作用，磺胺类药主要作用是抑制细菌的繁殖，因有些细菌生长时，需利用对氨基苯甲酸。因有些细菌生长时，需利用对氨基苯甲酸。PABA二氢蝶呤二氢蝶呤谷氨酸谷氨酸FH2合成酶合成酶磺胺类药物（磺胺类药物（-）FH2FH2还原酶还原酶MTX（-）FH4结构相似结构相似结构相似结构相似（氨甲蝶呤）（氨甲蝶呤）蛋白质蛋白质核酸核酸（1）底物和抑制剂结构不相似）底物和抑制剂结构不相似（2）底物和抑制剂可同时与酶的不同部位相结合）底物和抑制剂可同时与酶的不同部位相结合（3）抑制程度只取决于）抑制程度只取决于I（4）增加）增加S
50、不能去除抑制作用不能去除抑制作用（5）Km值不变，值不变，Vmax值降低值降低（6）动力学曲线变化）动力学曲线变化 这类抑制剂只可与这类抑制剂只可与ES复合物结合复合物结合,不能与不能与 E直直接结合接结合,主要抑制催化功能主要抑制催化功能,不影响底物结合位点不影响底物结合位点.E +SESE +PEIS+I竞争性抑竞争性抑制制非竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制I I结合的对象结合的对象E EE E、ESESESESK Km m变化变化增大增大不变不变减小减小V Vmaxmax变化变化不变不变降低降低降低降低第七节第七节 调调 节节 酶酶 变构调节普遍存在于生物界变构调节普遍存
