1、第一章第一章 血液标本采集与处理血液标本采集与处理临床免疫学检验技术第十四第十四章临章临床免疫检验的自动化床免疫检验的自动化分析分析陶志华目 录第一节 免疫浊度测定的自动化分析一、免疫散射比浊测定的自动化分析二、免疫散射比浊测定的影响因素第二节 发光免疫测定的自动化分析一、吖啶酯标记化学发光测定的自动化分析二、酶联发光免疫测定的自动化分析三、电化学发光免疫测定的自动化分析四、发光氧通道免疫测定的自动化分析目 录第三节 荧光免疫测定的自动化分析一、时间分辨荧光免疫测定的自动化分析二、荧光偏振免疫测定的自动化分析第四节 酶联免疫测定的自动化分析第五节 临床免疫检验自动化分析的选择与应用一、临床免疫
2、检验自动化分析的选择原则二、临床免疫检验自动化分析的临床应用重点提示临床免疫检验的自动化分析(automation of immunoassays)是将免疫学检验过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、结果报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，仪器自动完成整个免疫检验过程。重点提示各种自动化免疫分析仪都使用一种或两种免疫分析技术，如酶联免疫分析技术、生物素-亲合素技术、化学发光分析技术、荧光偏振免疫测定技术、时间分辨荧光免疫测定技术、电化学发光免疫分析技术等。有些免疫检验如免疫透射比浊则可采用全自动生化分析仪进行检测，有些则整合在其它一些自动化分析系统中，如自动
3、化血凝分析仪。重点提示通过本章学习，学生将全面掌握临床上常用的全自动免疫分析仪的类型、仪器检测技术要点和影响因素。通过本章学习，学生还将了解临床实验室选择选择原则和临床应用。第一节第一节 免疫浊度测定的自动化分析免疫浊度测定的自动化分析免疫浊度分析的基本原理抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。II042（dn/dc)2 Mc(1+cos)N24免疫散射比浊仪粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子
4、对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：式式I I 中为与入射光成中为与入射光成角处散射光强度；角处散射光强度；和和I0I0为入射光的波长和强度；为入射光的波长和强度；dndn/dc/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M M为颗粒分子量；为颗粒分子量；c c为浓度；为浓度；N N为阿佛加德指数；为阿佛加德指数；为颗粒到检测器的距离；为颗粒到检测器的距离；为散射光与入射光为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。的夹角（散射夹角）。定时
5、散射比浊法（fixed time nephelometry）检测检测原理：原理：定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。仪器测定技术仪器测定技术要点：要点：1.抗原抗体预反应阶段 2.反应阶段3.信号检测4.抗原过剩检测(1)抗体适当过量(2)对抗原过量进行阈值限定 定时散射比浊法（fixed time nephel
6、ometry）速率散射比浊法（rate nephelometry）速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1min2min即可完成。抗原抗体反应速率的动态变化抗原抗体反应速率的动态变化仪器测定技术仪器测定技术要点：要点：开启机器，进行校准反应阶段 抗原过量检测 速率散射比浊法（rate nephelometry）BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪全自动特定蛋白分析仪IMMAGE全自动特定蛋白分析仪全自动
7、特定蛋白分析仪免疫散射比浊仪方法评价散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质量要求很高。免疫比浊分析的影响因素1.抗原抗体比例2.抗体的质量3.增浊剂的使用4.伪浊度5.入射光光源和波长6.校准曲线制备与质量控制第二节第二节 发光免疫测定的自动化分析发光免疫测定的自动化分析发光免疫测定的自动化分析发光免疫测定的自动化分析是通过抗原或抗体标记技术、抗原或抗体的抗原抗体反应、固相分离技术、发光技术和计算机信息技术进行有机整合，实现了加样、温育、固相载体分离清洗、发光信号检
8、测和数据处理等过程自动化。一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。磁微粒分离技术Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y顺磁性微粒示意图顺磁性微粒示意图 磁微粒技磁微粒技术术 磁磁微粒微粒在在电磁场中电磁
9、场中分离分离磁磁微微粒粒标记抗体标记抗体发光发光Y YY磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶带丫啶酯标记酯标记物抗体物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后冲洗后双抗体夹心法双抗体夹心法（1 1）加入酸性加入酸性H H2 2O O2 2（pH10）仪器测定技术要点吖啶酯标记化学发光免疫分析仪ACS：180 SEACS CENTAURci8200i2000sr酶联发光免疫分析仪酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行被测物的定量。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷
10、酸酶(ALP)，常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP等。辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪该仪器采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。鲁米诺是一种还原剂，在碱性溶液中被H2O2氧化产生鲁米诺衍生物（激发态）。它以光量子辐射形式返回基态时，发出微绿色可见光。鲁米诺增强化学发光的原理仪器测定技术要点全自动增强化学发光酶免分析仪碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪该仪器是以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂进行测定的自动化仪器。仪器测定技术要点 Acc
11、essAccess全自动酶标记化学发光免疫分析仪全自动酶标记化学发光免疫分析仪UniCelUniCelDxIDxI 800800全自动酶标记化学发光免疫分析仪全自动酶标记化学发光免疫分析仪IMMULITE 2000IMMULITE 2000型全自动酶标记化学发光免疫分析系统型全自动酶标记化学发光免疫分析系统碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪 该仪器以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体（或抗原），以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）作为酶促反应的荧光基质（底物），底物被酶水解后，脱磷酸根基团，形成4-甲基伞型酮(4-MU)，用360nm激发
12、光照射，发出450nm的荧光。仪器测定技术要点AXSYM全自动酶标记荧光免疫分析仪全自动酶标记荧光免疫分析仪碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪 电化学发光免疫分析仪电化学发光免疫分析（ECLIA）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术，生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器。电化学发光稳定、持续时间长，易于控制并可根据待测分子的大小设计成多种反应模式如夹心法、竞争法等。仪器测定技术要点抗原抗体结合 电化学发光反应 光信号检测
13、检测完毕 全自动电化学发光免疫分析仪发光氧通道免疫分析仪是一种整合了高分子纳米微粒、免疫化学、CPM单光子计数技术的新型的均相化学发光免疫分析仪，所采用的均相化学发光技术具有快速、均相（免冲洗）、高灵敏和操作简单的特点。发光氧通道免疫分析仪以双抗体夹心法为例1.抗原抗体结合 将抗体包被感光微粒、抗体包被发光微粒和待测标本加入反应杯中，经温育后，形成抗体包被感光微粒-抗原-抗体包被发光微粒复合物。2.信号检测 用光子计数器计数得到相对光量子单位(RLU)值，光的强度与待测抗原的浓度成正比，通过校准曲线计算抗原浓度。仪器测定技术要点第三节第三节 荧光免疫测定的自动化分析荧光免疫测定的自动化分析自动
14、化荧光免疫分析仪主要是将抗原抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析仪器。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。时间分辨荧光免疫分析仪是采用镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，而建立起来的一种荧光免疫分析仪器，所采用时间分辨荧光免疫分析技术具有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，校准曲线范围宽等特点。仪器测定技术要点 抗原抗体结合 加入Eu3+螯合抗体 加入酸性增强液 4.信号检测 时间分辨荧光免疫分
15、析仪auto DELFIAauto DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统全自动时间分辨荧光免疫检测系统荧光偏振免疫分析仪是采用均相荧光免疫测定原理设计的一台荧光免疫分析仪。该仪器利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光（波长485nm）照射后，可吸收光能而产生另一单一平面的偏振发射荧光（波长525nm）。该荧光强度与荧光标记物质在溶液中旋转的速度与分子大小呈反比。常采用抗原抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。仪器测定技术要点1.抗原抗体反应 2.偏振荧光强度测定 注意事项1.FPIA的结果好坏取决于荧光素标记的好坏、激发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合物的特性
16、等因素。2.为提高FPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行预处理，除去干扰成分。第四节第四节 酶联免疫测定的自动化分析酶联免疫测定的自动化分析酶联免疫测定的自动化分析酶联免疫测定的自动化分析是将酶联免疫吸附试验（ELISA）各种操作步骤（加样温育洗涤加酶结合物温育洗涤加底物温育比色等）进行自动机器操作，实现自动化分析的免疫检测系统。根据自动化酶联免疫分析系统的处理模式不同，通常将全自动酶免分析仪分成二类：分体机和连体机。分体机是由“前处理系统”即全自动样本处理工作站和“后处理系统”即全自动酶免分析仪两个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶
17、标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印的全自动过程。仪器组成和性能1.条形码识别系统 2.样本架和加样系统 3.试剂架 4.温育系统5.液路系统 6.洗板系统 7.酶标板读数仪 8.自动装载传递系统 9.计算机管理和信息系统加样加样仪器组成和性能洗板洗板仪器组成和性能全自动酶免分析仪中的连体机是将样本处理工作站和全自动酶免分析仪联合起来，工作速度快，自动化程度高，适合大批量样本的处理，如血站系统。分体机，由于它有一个独立的全自动样本处理站，加样速度快，适合试验项目变化多、样本批量不等的临床实验室。仪器评价第五节第五节 临床免疫检验自动化分析的选择与应用临床免疫检验自动化分析的选择
18、与应用选择原则1.资质要求：企业法人营业执照、医疗器械注册证和医疗器械生产/经营企业许可证2.性能要求：性能指标（正确度、精密度、最低检测限、线性范围和临床可报告区间、分析干扰等）；还应考虑检验科内部仪器所组成检测系统的一致性和测定结果的可比性。3.仪器放置地的设施和环境条件 4.实验室项目检测速度要求和设备配置5.信息要求6.实验室检测项目的经济效益因素临床应用1.血浆、体液中的特定蛋白检测2.甲状腺激素及相关指标检测3.生殖激素检测4.肾上腺和垂体激素检测5.贫血因子检测6.肿瘤标记物检测 如 AFP、CEA、PSA、fPSA、CA19-9、CA125、CA15-3等。7.感染性疾病免疫学
19、指标检测8.糖尿病免疫学指标检测9.治疗药物浓度检测 如茶碱、地高辛、环孢素、苯巴比妥血药浓度测定等思考题1.什么是免疫检验自动化？应用哪些技术？优点是什么？2.免疫浊度分析的原理是什么？有哪些临床应用？3.定时散射比浊法和速率散射比浊法的测定原理，其抗原过量检测有什么不同点？4.免疫比浊分析的影响因素有哪些？5.吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪技术要点是什么？6.酶联发光免疫分析仪的原理是什么？有哪几种类型？各有什么特点？7.电化学发光免疫分析仪测定的技术要点是什么？8.光致发光化学免疫分析仪测定原理和技术要点是什么？9.时间分辨荧光免疫分析仪测定的技术要点是什么？注意事项有哪些？10.全自动
20、酶免分析仪的组成成分有哪些？优点是什么？小结临床免疫检验自动化分析是将免疫学检验过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、结果报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，仪器自动完成整个免疫检验过程。临床免疫检验自动化分析是通过采用一种或两种免疫分析技术和相应专用临床免疫检验自动化分析仪而实现。免疫散射比浊测定的自动化分析是利用可溶性抗原与相应抗体反应生成的免疫复合物微粒，微粒对光线产生折射而形成散射光而进行抗原（或抗体）定量检测，根据检测模式不同，根据检测模式不同，分成定时散射比浊法和速率散射比浊法。小结发光免疫测定的自动化分析是指一种利用发光标记物标记的抗原抗体反应
21、并通过发光强度变化而进行抗原或抗体定量检测的一类免疫自动化分析，由相应试剂和自动化发光免疫分析仪组成。自动化发光免疫分析仪根据所采用发光标记物和检测原理不同分为化学发光免疫分析仪、酶联发光免疫分析仪、电化学发光免疫分析仪和发光氧通道免疫分析仪。荧光免疫测定的自动化分析是将抗原-抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一类免疫自动化分析。由自动化荧光免疫分析仪、荧光免疫检测试剂和校准品等组成。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定仪主要有时间分辨荧光免疫分析仪；均相荧光免疫测定仪主要有荧光偏振免疫分析仪。小结酶联免疫测定的自动化分析是将酶联免疫吸附试验（ELISA）各种操作步骤进行自动机器操作的一类免疫自动化分析。根据酶联免疫测定的自动化分析的处理模式不同，通常将全自动酶免分析仪分成二类：分体机和连体机。临床免疫检验自动化分析的选择与应用应该充分考虑临床实验室实际情况和临床需求，包括：检测系统的性能指标；仪器放置地的设施和环境条件；实验室项目检测速度要求和设备配置；实验室项目检测速度要求和设备配置；实验室信息化要求；实验室检测项目的经济效益等因素。
