1、荧光定量荧光定量PCR技术与技术与常见问题分析常见问题分析汪瑾生命科学实验中心2012.09.26定量定量PCR是如何工作的是如何工作的一种实时监控目的基因PCR 扩增的技术传统PCR具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCR buffer缓冲液,Taq polymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGC
2、TGA 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:双链DNA模板变性 引物与模板退火 引物延伸 新的扩增片段理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍 在PCR混合液中含有无论哪个型号，所有的荧光定量 PCR仪都有三个共同的组成部分PCRPCRLots of PCRPCR product随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加Real-time PCR仪会记录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化Cycle 1Filter ASample 1Level:重复性好 灵敏度高 动力学范围宽一个可以检测到低拷贝的目的基因 快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。安全：不用EB或放射性物质
3、报告染料报告染料Reporter dye淬灭染料淬灭染料Quencher dyeReporter没有荧光信号（发射）能量光(激发)光能?Taq酶很特别 具有核酸外切酶活性，可以吃掉结合到模板上的DNA片段嗝!非特异结合非特异结合任意任意 双链双链DNA 定量结果不准确定量结果不准确非特异性非特异性PCR产物信号产物信号Temperature Fluorescence一个干净的峰=没有无关的产物Temperature Fluorescence可能是引物二聚体 非特异扩增 1、转录组中错误的目的基因。2、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组DNA又检测cDNA(由于短的内含子,基因组DNA有较高
4、的Tm值)。解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结合点 引物二聚体TaqMan,还是 SYBR Green?.优点 更高的特异性 不会有引物二聚体干扰 支持多重荧光实验设计 实验方法易于优化 缺点 价格稍贵 优点 价格便宜 大部分基因以及少量样品均适用 缺点 特异性稍差 必须要做 Melt curves 不支持多重荧光设计 实验方法通常需要优化首先让我们定义扩增曲线的各种参数。3个阶段中个阶段中最佳时期最佳时期 只有一个扩增期提供高质量的数据基线（空白）信号的产生是由于背景引起的默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10第一步：确定Ct值第二步：比较Ct值 绝对定量 相对定量 阴阳性鉴定
5、基因分型定量PCR的实验要素 目的基因 样品 标准曲线 标准品 监控系统故障 阳性对照 监控污染 阴性对照 校准生物学误差 内参(管家基因)校准物理误差 参比荧光 降低随机误差 重复实验示例实验未处理样本处理后样本目的基因：Plat1实验目的：样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化？对照样本比较Ct（Ct）法相对标准曲线法样本间目的基因的倍数关系 比较比较Ct(Ct)法法 相对标准曲线法相对标准曲线法*已知各个基因的扩增效率 *每个基因都要做一条标准曲线*不需要每次都做标准曲线 *准确的扩增效率计算*简单,经济,通量较高 *工作量大,成本高,通量较低 在EXCEL中制作图表在EXCEL中
6、制作图表比较Ct(Ct)法相对标准曲线法Ct法必要条件：必要条件：目的基因和内参基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%。Ct法如何确认扩增效率接近100%？每条引物一条标准曲线Ct法标准曲线可以帮助判定扩增效率例如：斜率-3.3说明扩增效率接近100%；更小的负值（如-3.5）说明扩增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1Ct法结果计算步骤一：内参基因均一化样本差异 Ct目的基因-Ct目的基因=Ct步骤二：处理样本和对照样本作比较 Ct处理样本-Ct对照样本=Ct步骤三：使用公式计算 倍数变化=2-Ct公式含义2-Ct2=循环间扩增产物量的变化（PCR扩增产物倍增）Ct=处
7、理样本和对照样本之间校正过大循环数的变化所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化倍数变化。Ct法计算示例Ct法计算示例为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理。Ct法计算示例首先，选择对照样本；接着，均一化对照样本；然后，所有样本和对照样本进行比较。Ct法计算示例最后，计算出倍数关系2 Ct。相对标准曲线法相对标准曲线法每对引物做一条相对标准曲线相对标准曲线法相对标准曲线法计算示例表示倍数差异 目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系；要求：浓度已知 标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%仪器质量一致 试剂质量一致：模板纯度、引物和探针
8、的Tm值、酶活性、缓 冲液成分 反应条件一致：循环参数相同、同一次实验标准品的准备标准品的准备 Dont:制备3个点的2倍标准曲线要求：Do:制备至少5个点的标准曲线(4 logs)去除离散的重复孔，或者有必要时去除整个梯度数据如何制备标准曲线如何制备标准曲线 选择目标提取/PCR 纯化测定浓度调整浓度梯度稀释 Ct值在17-30之间，覆盖全部样品浓度区间 10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v 标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v 注：不可由标准品i分别
9、加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v标准品梯度稀释方法扩增效率：每个循环中靶分子被作为模板利用的百分比。PCR效率的测定主要原因：样品不纯 扩增产物太长 没有选择合适的引物退火温度 引物的设计有错配 模板的序列特殊（比如GC含量高）抑制物的存在主要原因：背景污染 非特异性扩增对每个样品我们都要做重复实验（通常至少为3个重复）目标是所有复孔CT值都相近(通常SD值小于0.167)重复性好重复性差主要原因 加样误差（操作?加样器?）没有将试剂和样品充分混匀 低拷贝的样品泊分分 没有使用ROX校准(或者其他校准孔间误差的方法)ROX校准 Master Mix中ROX浓度固定 R
10、OX不参与PCR扩增，信号强度只与Mix用量有关 ROX的功能：校准物理误差 耗材质量：管盖厚度、透光性能 仪器稳定性：孔间批间波动 反应体系监控：蒸发卤素灯光源光学系统盖膜或管盖管壁光滑性反应体积ROX校准大大改善各拷贝复样的重复性(参比荧光)(报告荧光)Rn=Normalization=报告荧光/参比荧光(这个normalization是自动的)标准曲线线性不好引物特异性不好阴性对照有扩增退火温度的选择两步法还是三步法 日常实验中的注意事项日常实验中的注意事项 实验室分区 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器 使用带滤芯的吸头 光学平盖八联管（或96孔板+光学盖膜），不可裸手触摸盖或膜。尽量不要在八联管和96孔板上做标记 阳性对照和阴性对照 反应后PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启。扩增产物50-200bp，不要超过300bp Ct值17-30之间 扩增效率在90-110%之间 引物的特异性要好，熔解曲线单峰。内参基因的选择 选择跟目的基因表达量接近的 多个内参（当一个内参基因的表达量不够恒定时）在不同样本中内参的Ct值不能相差过大日常实验中的注意事项日常实验中的注意事项
