1、2021/7/261(最新整理)选修一微生物的实验室培养2021/7/262专题2 微生物的培养与应用课题1 微生物的实验室培养2021/7/263培养基可以分为哪几类？培养基一般都含有哪些营养物质，此外还要满足哪些要求？获得纯净培养物的关键是什么？什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤？如何倒平板？2021/7/264微生物的类群微生物的类群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻原核细胞原核细胞？2021/7/2652021/
2、7/266一、培养基一、培养基1.概念：人们按照微生物对概念：人们按照微生物对_的不同需求，配置的不同需求，配置出供其出供其_的营养基质。的营养基质。营养物质营养物质生长繁殖生长繁殖2.培养基的类型和用途培养基的类型和用途按物理性质按物理性质固体培养基固体培养基:加琼脂；用于分离、鉴定、计数加琼脂；用于分离、鉴定、计数液体培养基：不加凝固剂；用于工业生产。液体培养基：不加凝固剂；用于工业生产。半固体培养基：加少量琼脂；可用于保藏菌种。半固体培养基：加少量琼脂；可用于保藏菌种。2021/7/267按化学成分按化学成分合成培养基：成分明确；分类鉴定。合成培养基：成分明确；分类鉴定。天然培养基：成分
3、不明确；用于工业生产。天然培养基：成分不明确；用于工业生产。按目的用途分按目的用途分鉴别培养基：培养基中加入某种试剂或化学鉴别培养基：培养基中加入某种试剂或化学药品，区别出不同类型的微生物。药品，区别出不同类型的微生物。选择培养基：根据选择培养基：根据某一种或一类微生物的特某一种或一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性殊营养要求或对一些物理、化学抗性设计培设计培养基。如用青霉素选出酵母菌等。养基。如用青霉素选出酵母菌等。2021/7/268选择培养基选择培养基选择培养基应用应用加入青霉素加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐加入高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌
4、分离金黄色葡萄球菌不加氮源不加氮源分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的不加含碳有机物的无碳培养基无碳培养基分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生加入青霉素等抗生素素分离导入了目的基因的受分离导入了目的基因的受体细胞体细胞在微生物学中，将允许特定种类在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，的微生物生长，同时抑制或阻止其它种类微生物生长的培养基。同时抑制或阻止其它种类微生物生长的培养基。2021/7/269 2021/7/2610固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基2021/7/2611培养基一般都含有哪些营养物质，此外还要满足哪些要求？2021/7/2612不管哪种培养基，一般都
5、含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和和氮源氮源、无机盐无机盐等营养物质等营养物质另外还需要满足微生物生长对另外还需要满足微生物生长对pHpH、特殊营特殊营养物质养物质,例如例如:生长因子生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及以及氧气氧气、二二氧化碳氧化碳、渗透压渗透压等的要求。等的要求。2021/7/2613一一.培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32
6、2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等注：对于异养微生物，含注：对于异养微生物，含C C、N N的化合物既为碳的化合物既为碳源，也是氮源。源，也是氮源。2021/7/2614牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlN
7、acl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g2021/7/2615培养基配制原则培养基配制原则目的明确：目的明确：营养全面、浓度适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当适宜的适宜的pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、培养目的选择原料选择原料自养型：自养型：不加碳源不加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂（COCO2 2碳源）碳源）生产生产科研科研2021/7/26162.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程二二.无菌技
8、术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台2021/7/2617二、无菌操作技术二、无菌操作技术1.获得纯净培养物的关键？防止外来杂菌入侵防止外来杂菌入侵2 2、无菌技术除了用来防止实验室的培养物、无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的被其他外来微生物污染外，还有什么目的？避免操作者自身被微生物感染避免操作者自身被微生物感染2021/7/2618消毒与灭菌消毒与灭菌消毒：使用较使用较温和温和的物理或化学方法仅杀死物的物理或化学方法仅杀死物体体表面或内部一部分表面或内部一部分对人体
9、有害的微生物（不对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。包括芽孢和孢子）。灭菌：使用使用强烈强烈的理化因素杀死物体内的理化因素杀死物体内所有所有的的微生物，包括芽孢和孢子。微生物，包括芽孢和孢子。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。通也是最重要的技术。2021/7/2619 有些细菌在一定的条件下，有些细菌在一定的条件下，细胞里面细胞里面形成一个椭圆形成一个椭圆形的形的休眠体休眠体，叫做，叫做芽孢芽孢。芽孢的壁很厚，对恶劣的环境有。芽孢的壁很厚，对恶劣的环境有很强的很强的抵抗力抵抗力。每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。细菌、原生
10、动物、真菌和植物等产生的一种有细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的繁殖或休眠作用的生殖细胞生殖细胞。能直接发育成新个体。能直接发育成新个体。特殊的休眠构造2021/7/2620消毒的方法：消毒的方法：1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100煮沸煮沸5-6min2、巴氏消毒法巴氏消毒法：70-75 下煮下煮30min或或 80 下煮下煮15min3、化学药剂消毒法化学药剂消毒法:用用75%酒精进行皮肤消毒酒精进行皮肤消毒;氯气氯气消毒水源消毒水源4、紫外线紫外线适用对象：适用对象：操作空间、液体、双手等操作空间、液体、双手等2021/7/2621灭菌的方法：灭菌的方法：1、灼烧灭菌、
11、灼烧灭菌2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 下加热下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：、高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持下维持15-30min.2021/7/2622请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手消毒消毒灭菌灭菌 灭菌灭菌 2021/7/2623练习：思考并讨论下面的仪器分别用什么样的消毒和灭菌方法？培养基培养基培养
12、皿培养皿空空 气气接种环接种环双双 手手牛牛 奶奶巴氏消毒巴氏消毒化学消毒化学消毒紫外线消毒紫外线消毒高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定义：定义：三、菌落三、菌落鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体2021/7/26251000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉
13、膏 5g琼脂琼脂20.0g四四.大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、
14、培养皿2021/7/2626约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基2021/7/26271.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，才能用左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：答：用手触摸，刚不烫手。用手触摸，刚不烫手。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。2021/
15、7/26283.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？生物吗？为什么？答：皿盖凝结水珠，防止水珠落入培养基，造成污染；答：皿盖凝结水珠，防止水珠落入培养基，造成污染；平板倒置，防止培养基表面的水分挥发。平板倒置，防止培养基表面的水分挥发。答：最好不用，空气中的微生物可能在皿盖与皿答：最好不用，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。底之间的培养基上滋生。2021/7
16、/2629二二.大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：平板划线法：平板划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.接种：接种：接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）2021/7/2630问题问题2：每次划线前灼烧接种环的目的：每次划线前灼烧接种环的目的：问题问题3：划线结束后灼烧接种环的目的：划线结束后灼烧接种环的目的：避免接种环上可能存在的微生物污染培养基避免接种环上可能存在的微生物污染培养基 杀死上次划线结束后残留的菌种杀死上次划线结束
17、后残留的菌种 及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和操及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和操作者。作者。问题问题1：第一步灼烧接种环的目的：第一步灼烧接种环的目的：2021/7/26312.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？从上一次划线的末端开始划线？答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，
18、每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。繁殖而来的菌落。2021/7/26324.为什么不能划破培养基？一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。一个条状的菌落。2021/7/26336 6支试管，分别加入支试管，
19、分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液2021/7/2634稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍2021/7/2635平板划线法：平板划线法：二二.大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：
20、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录2021/7/26362021/7/2637在普通琼脂培养基上在普通琼脂培养基上：圆形圆形，边缘整齐，表边缘整齐，表面光滑，半透明面光滑，半透明。典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为为:深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的深紫黑色、光滑、
21、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。圆形菌落。2021/7/26381.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？五、结果分析与评价五、结果分析与评价若有，说明培养基灭菌不彻底 相似的菌落，接种符合要求2021/7/26393.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。大小会有明显不同无菌操作未达到要求：培养基灭菌不彻底；可能是接种时或培养时污染2021/7/2640六六.菌种的保藏菌种的保藏1.1.临时
22、保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020斜面保藏甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法2021/7/2641知识小结知识小结:2021/7/2642【巩固】【巩固】下下列有关平板划线操作的叙述不正确的列有关平板划线操作的叙述不正确的是是()A第一步灼烧接种环是为了避免接种环上第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物可能存在的微生物污染培养物B每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种次划线结束后，接种环上残留的菌种C在第二区域内划线时，接种环上的菌种在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液直接来源于菌液D划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者感染操作者C2021/7/2643
