1、第10章 酶的作用机制和酶的调节一 酶的活性中心（一）、活性中心(active site)的概念 活性中心：活性中心：酶分子中直接与底物结合并催 化底物发生化学反应的部位。活性中心分为结合部位和催化部位 结合部位：结合部位：负责与底物的结合，决定酶的专一性（与km有关）。催化部位：催化部位：负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力效率（kcat)和催化性质。结合部位和催化部位也可以合二为一，活性部位可以提供调节部位，也可以为活性部位提供物质基础 酶的活性中心（二）、活性中心的结构特点：1活性部位在酶分子中只占一小部分（12）2酶活性部位是一个三维的特定空间结构3酶的活性部位和底物有时不互
2、补-诱导契合4.酶活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂缝 内往往是个疏水的微环境。5底物通过次级键结合到酶上，形成ES复合物。6酶活性部位是柔性或可运动性，即酶与底物结合 时构象发生一定的变化才互补。频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。-底物可以稳定酶！酶的活性中心（三）、研究活性中心的方法 化学修饰法通常是比较在底物或竞争性抑制试剂是否存在的情况下的化学修饰1、酶分子侧链集团的共价修饰（化学修饰）法酶的化学修饰法分类（1）、非特异性共价修饰非特异性共价修饰 某些酶活
3、性中心含有的活性基团在活性中心以外不存在或很少，这时可选择某些非特异性试剂进行修饰（2）、特异性共价修饰特异性共价修饰如DFP（二异丙基氟磷酸）可与活性中心中的丝氨酸反应。如，DFP与胰凝乳蛋白酶作用（只和活性部位的丝氨酸残基的羟基结合）（3）.亲和标记法 亲和标记亲和标记（Affinity labeling）：也属于共价修饰，主要是利用酶与底物特异性结合的原理而发展起来的一种特异性化学修饰法。（TPCK）修饰a胰凝乳蛋白酶His57 何谓亲和层析何谓亲和层析？Ks型不可逆抑制剂又称(?)研究活性中心的方法(续)2、动力学参数测定法 活性部位氨基酸残基(解离状态解离状态)和(酶活性酶活性)直接
4、相关通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用研究活性中心的方法(动力学分析法)核糖核酸酶最适 PH=7.8 参照最适PH值：谷氨酸、组氨酸或赖氨酸哪一个可能在活性中心？胃蛋白酶的最适PH值为2，哪一类氨基酸可能在活性中心？研究活性中心的方法(动力学分析法)酶 最适pH 活性中心的氨基酸胃蛋白酶 1.8 Asp215 和Asp32胰蛋白酶 7.7 His57,Asp102,Ser195核糖核酸酶7.8 His12,His119,溶菌酶 5.2 Asp52,Glu35研究活性中心的方法(续)
5、4、定点诱变 通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。3、X射线衍射分析法 通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X射线衍射分析。例如：(溶菌酶活性中心）定点诱变天冬酰胺天冬酰胺后Kcat小了5000倍结论：？结论：？苯丙氨酸后 Kcat不变 Km提高了6倍 结论：？结论：？胰蛋白酶突变突变突变突变羧肽酶A 为验证羧肽酶A Tyr 248 在催化中的作用，对其基因进行定点突变Tyr 248（TAT）定点突变为Phe（TTT）；实验结论是，Tyr 248 参与了与底物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据：A.Kcat 突变后降低 B.Km 变大 C.Kcat
6、/Km 升高 D.Kcat 不变 E.Kcat/Km 降低上海交通大学2007生物化学 定点诱变突变为苯丙氨酸后突变为苯丙氨酸后：Kcat不变，Km提高了6倍如何确定活性部位？（习题）例：碘乙酸可使核糖核酸酶的侧链His119和His12烷基化而抑制酶活性。其中His119的修饰对酶影响最大,但是研究中发现这两个His永远不能同时被碘乙酸修饰,而且,碘乙酸的类似物碘乙酰胺不能作为酶的修饰剂。此外在pH 5.5时碘乙酸一般不作用His,但在核糖核酸酶中,pH=5.5时,碘乙酸可作用His,由上述现象可对核酸酶的活性部位得出什么结论?答：这是一个说明通过侧链修饰如何确定活性中心的例题。（1）His
7、119和His12可能都处于活性部位，His119可能性更大或者His119是催化过程中第一启动者，（2）His119和His12不在同一个环境（3）由于酶环境的影响，His以质子供体的形式存在。有可能在his119和His12之间形成质子供体与质子受体的关系（四）、酶的必需基团（自学）必需基团：酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。（1）、活性中心内的必需基团：结合基团：与底物结合，形成酶底物复合物的部位；催化基团：影响底物中化学键的稳定性，与底物发生 化学反应，将底物变成产物。（2）、活性中心外的必需基团（调控基团或维持酶活性）构成酶活性中心的基团：His的咪唑基、Ser的-OH
8、、Cys的-SH、Glu的-羧基1.酶的必需基团是（）（1）必需基团构成具有一定空间结构的构象（2）和底物结合幷将之转化成产物的部位（3）抑制剂都作用于酶的活性中心（4）所有酶的活性中心都有金属离子2.酶的活性中心是（）（1）所有的酶都有活性中心（2）所有活性中心都有辅基（3）酶的必需基团都位于活性中心（4）变构抑制剂直接结合的部位（5）重金属沉淀酶的结合区域3.讨论酶活性中心的特点，指出两种常用于研究酶活性中讨论酶活性中心的特点，指出两种常用于研究酶活性中心心 的方法的方法(8分分)（大连理工大学、中国农业大学（大连理工大学、中国农业大学20112011生物化学）生物化学）思考题 思考题5.
9、用定位点突变方法得到缺失某一个氨基酸残基突变体，这个突变的酶蛋白不再具有催化活性，因此可以认为该缺失残基一定是酶结合底物的必需基团。（判断判断）华南理工大学20096.某同源蛋白中的某同源蛋白中的Ala残基被替换为残基被替换为Val，此类替换属，此类替换属 于于 保守性替换保守性替换 。中山大学中山大学20097在酶的结构上十分重要，但在催化过程中极不可能和底物在酶的结构上十分重要，但在催化过程中极不可能和底物 相互作用，它是相互作用，它是()()a.谷氨酸谷氨酸 b.胱氨酸胱氨酸 c.组氨酸组氨酸 d.酪氨酸酪氨酸 e.丝氨丝氨酸酸江南大学江南大学2007 思考题8.什么是酶活性中心？有一种
10、酶，含一个半胱氨酸残基，设计一个技术线路，验证该Aa是否参与酶的催化作用或专一性。中国农业大学中国农业大学2010生物化学生物化学碘乙酸（碘乙酰胺）9 名词解释：酶的活性部位名词解释：酶的活性部位 20132013年山东大学年山东大学1010、判断：、判断：酶的活性中心由一级结构上相邻的氨基酸残基构成酶的活性中心由一级结构上相邻的氨基酸残基构成20132013年江南大学年江南大学华东师范大学华东师范大学20082008年年酶高效性的机理1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物的形变与诱导契合3、酸碱催化4、共价催化5、活性中心金属离子6、活性部位微环境的影响二、影响酶催化效率的有关因素3版生物
11、化学酶促反应的机制（一）、（一）、基元催化的分子机制：基元催化的分子机制：基元催化：基元催化：由某些集团或小分子催化的反应，如 1、酸碱催化2、共价催化3、活性中心金属离子（二）、（二）、酶具有高催化能力的原因酶具有高催化能力的原因 1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物的形变与诱导契合 3、多元催化与电荷极化4、活性部位微环境的影响新版生物化学填空填空:一个是酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、共价催化和()中山大学中山大学20102010年年（二）、酶具有高催化能力的原因1.邻近效应与定向效应Proximity/Orientation底物与酶的邻近效应与定向效应邻近效应与定向效应变分子间
12、反应为分子内反应。邻近效应邻近效应：酶与底物形成中间复合物中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。定向效应定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应。酶把底物分子从溶液中富集出来富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。邻近与定向（轨道定向）效应A.反应物的反应基团和催化基团既不靠近，也不彼此定向B.两个基团靠近，但不定向，也不利于反应C.两个基团既靠近，又定向，大大有利于底物形成过渡态，加速反应酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电
13、子云酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能 、酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。、底物形变，利于形成ES复合物。、底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能（二）、底物形变和诱导契合的催化效应溶菌酶 底物形变：酶与底物结合后，D 糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。1、定义：酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用，降低了活化能加速了反应，这种机制称为.。Specific acid-base catalysis（H+或OH-)General acid
14、-base catalysis（H+或OH-)+供体供体2、分类（三）、酸碱催化酶酶酶酶 Many protein enzymes use general acid-base catalysis as a way to increase reaction rates（催化有机反应的最普催化有机反应的最普遍有效的催化剂遍有效的催化剂）Acid-Base CatalysisSpecific acidbase catalysisGeneral acid-base catalysis The active site of some enzymes contain amino acid function
15、al group,such as those shown here,can participate in acid-base catalysispKa value*Asp 3.9;Glu 4.1 Lys 10.5;Arg 12.58.36.013.010.5Side chains used in general acid-base catalysis The active site of some enzymes contain amino acid functional group,such as those shown here,can participate in acid-base c
16、atalysis pKa value*PH=7 -COOH Asp 3.9;Glu 4.1 COO-NH3+Lys 10.5;Arg 12.5 NH3+组氨酸组氨酸-6.0Side chains used in general acid-base catalysis思考题 例如：某酶的化学修饰实验表明，Glu和Lys残基是这个酶活性所必需的两个残基。根据pH对酶活性影响研究揭示，该酶的最大催化活性的pH近中性。请你说明这个酶的活性部位的Glu和Lys残基在酶促反应中的作用，并予以解释 答 谷氨酸的-羧基的pKa值约为4.0，在近中性条件下，该基团去质子化，在酶促反应中起着碱催化剂的作用。赖氨酸
17、的?-氨基的pKa值约为10.0，在近中性条件下，它被质子化，在酶促反应中起着酸催化剂的作用。3、影响酸碱催化反应速度的两个因素 酸碱强度酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼 的催化基团。给出质子或结合质子的速度给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期 小于10-10 秒 酸碱催化所以，所以，His是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。思考题 1.在酶的广义酸碱催化机制中，特别重要的一个氨基酸残基是 _，其侧链pK 值接近生物体的pH 值。中山大学中山大学2007年年2.蛋白酶的酸碱催化作用加
18、强了共价键化基团对肽键碳原子的亲核进攻能力。（是非题）中山大学中山大学2009年年3.名词解释：酸碱催化 华东师范大学华东师范大学2003年年思考题 4.在生理条件下，下列哪种既可以作为H+的受体，也可以作为H+的供体?（A）His的咪唑基（B）Lys的氨基（C）Arg的胍基 （D）Cys的巯基 （E）Trp的吲哚基 华东师范大学华东师范大学 2007年年NucleotidesH2O2或或3-核苷酸核苷酸核苷核苷2,3环磷酸酯环磷酸酯 Basic hydrolysis of RNA Due to the 2-hydroxyl (1).共价催化：酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很
19、高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。（四）共价催化Covalent catalysis酶酶底物底物共价键共价键（2）.共价催化分类 （酶中）（酶中）亲核基团：（亲核催化）亲核基团：（亲核催化）Ser 的羟基、的羟基、Cys 的硫基，的硫基，His 的咪唑基、的咪唑基、Asp 的的羧基，等；这些富含电子的基团羧基，等；这些富含电子的基团(有孤对电子有孤对电子)，攻击底物分，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团（子中电子云密度较小的亲电子基团（底物中常见的亲电集团：底物中常见的亲电集团：如磷酰基、酰基和糖基），并供出电子，二者形成共价键，如磷酰基、酰基和糖基
20、），并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。（酶中）亲电子基团：（亲电催化）（酶中）亲电子基团：（亲电催化）H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。共价催化集团共价催化举例-胰凝乳蛋白酶1.亲核催化中酶蛋白上最常见的提供亲核基团亲核基团的残基是（）A，His，Ser，Cys；B，His，Lys，Arg；C，Asp，Glu，Phe D，Asn，Gln，Trp 中国科学院中国科学院20052005年
21、年共价催化举例-胰凝乳蛋白酶2.酶蛋白氨基酸侧链提供各种亲核中心，可以对底物进行共价催化，酶蛋白上最常见的 3 种亲核基团为：(),()，()。底物的亲电中心主要有：（至少写出2 种）。中国科学技术大学中国科学技术大学2007-20082007-2008学年第学年第I I学期生物化学学期生物化学（区分）可逆的共价修饰的调控 （1）共价修饰调节：酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生可逆的共价修饰,从而导致酶活性的改变,称为共价修饰.（2）共价调节酶（covalent regulatory enzyme）是一类由其它酶对其结构进行可逆共价修饰，使其处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活
22、性。（共价调节酶）（五）、活性中心金属离子的催化作用金属酶和金属-激活酶（1）通过结合底物位反应定向；（2）通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。金属离子的催化往往和酸的催化相似，作用比质子强，不少金属离子有络合作用，并且在中性 pH 溶液中，H+浓度很低，但金属离子却容易维持一定浓度。金属离子通过电荷的屏蔽促进反应。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。Hexokinase激酶真正的底物是 Mg2+-ATP Carbonic Anhydrase:Zinc Activation of Water,The activated water(hydroxide
23、ion)acts as a nucleophile亲和基团,attacking the carbon dioxide,forming bicarbonateCarbonic Anhydrase The bound zinc activates its water ligand-makes it more reactive 基元催化基元催化：由某些集团或小分子催化的反应，如 1、酸碱催化 2、共价催化；3、活性中心金属离子 基元催化的分子机制基元催化的分子机制 思考题：思考题：1.酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、共价催化和（）中山大学中山大学20102010年年2.下列哪一项不是酶具有高催化
24、效率的因素？（）A、加热 B、酸碱催化 C、“张力”和“形变”D、共价催化 E、邻近定位效应南京林业大学南京林业大学20032003年年 多元催化和协同催化：多元催化多元催化和协同催化：多元催化常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网电荷中继网”，催化肽键水解。电荷极化电荷极化为基元催化提供了催化基团，如广义的酸碱、亲核基团和亲电基团及金属离子。（六）、多元催化与协同效应电荷极化和多元催化(新版生化）Ser195、His57、Asp102 Example:RNase AA AGeneral BaseGeneral Acid牛胰核糖核酸酶A酶的活性
25、中心：His12 His119 Lys41 49Example:RNase A（七）活性中心的微环境（1）疏水环境：酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反应力，有助于加速酶促反应。如果酶的活性中心周围是一个高介电环境中，活性中心就会有水分子存在，水分子对带电离子有屏蔽作用，削弱带电离子之间的静电作用，不利于酶促反应的进行 （2）电荷环境 在酶活性中心附近,往往有一电荷离子,可稳定过渡态的离子,增加酶促反应速度。活性中心的微环境酶活性中心的羧基与水形成氢键，导致酶活性中心羧基表面有一层水化层，水分子的屏蔽作用
26、，大大削弱了酶分子与底物离子间的静电相互引力，不利于酶促反应。思考题1.酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、共价催化和（）中山大学2010年生物化学2哪一种酶属于共价催化（哪一种酶属于共价催化（）？）？a.解链酶解链酶 b.DNA聚合酶聚合酶 c.RNA聚合酶聚合酶 d.拓扑异构酶拓扑异构酶 e.蛋白激酶蛋白激酶A 江南大学2007年生物化学Type I topoisomerases共价催化三、酶催化作用的实例（一）、溶菌酶（一）、溶菌酶（lysozyme)溶菌酶存在于鸡蛋清鸡蛋清和动物的眼泪动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁。溶菌酶是第一个用X-射
27、线法阐明其全部结构和功能的酶。是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)首次发现的。1.底物：底物：细菌细胞壁的肽聚糖，NAG和NAM交替排列形成多聚物，它们之间通过-1,4糖苷键相连。为什么眼睛和口腔不易被细菌感染？2011年四川大学生物化学年四川大学生物化学 肽聚糖（peptideglycan)LysozymePenicillin 注意：含有D-氨基酸溶菌酶的最适小分子底物 溶菌酶的最适小分子底物为NAG-NAM交替形成的六糖。6个糖环分别用A、B、C、D、E、F表示。溶菌酶水解D糖环和E糖环之间的糖苷键。溶菌酶的最适小分子底物 O18水证明溶菌酶催化底物C1-O键裂解2、溶菌酶结构
28、：溶菌酶由129个氨基酸残基构成，是一个单链蛋白，分子内含有四对二硫键。活性中心的氨基酸残基是Glu35和Asp52。从表面构象看，酶的结构不很紧密，大多数极性氨基酸残基分布在分子的表面，非极性氨基酸残基分布在分子的内部。整个酶分子中有一狭长的裂缝一狭长的裂缝。最适底物正好与酶分子的凹穴相结合.3.溶菌酶催化特点小结（1）靠近与定向（2）底物形变：酶与底物结合后，D 糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。（3）广义的酸碱催化（4）共价催化?溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它们的侧链羧基COOH的pK a 值分别为5.9和4.5。该酶最适pH（pH5.2
29、），1.这两个残基分别呈现什么样的解离状态（质子化或否）？2.这样的解离状态将使它们分别发挥什么样的作用？（谁起酸催化作用？谁起稳定正电荷作用？），3.根据该酶的pH-活性峰，请对这两个残基的解离与该酶的活性之间的关系给出恰当的解释。武汉大学生命科学学院2007-2008年度第1学期期末考试武汉大学生命科学学院2007-2008年度第一学期期末考试1.OptimumpHfortheenzymeis5.ThereasonforthisliesintheionizationstateofbothGlu-35andAsp-52:At pH5:Glu-35 ionizes and can not su
30、pply the hydrogen ion required.At pH5:Asp-52 is protonated and can not stabilize the carbocation intermediate.溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它们的侧链羧基COOH的pK a 值分别为5.9和4.5。该酶最适pH（pH5.2），溶菌酶两种催化机理假说广广义义的的酸酸碱碱催催化化广广义义的的酸酸碱碱催催化化正正碳碳离离子子共共价价催催化化?D糖溶菌酶两种催化机理假说(续)广义的酸碱催化广广义义的的酸酸碱碱催催化化溶菌酶催化机理假说(旧)溶菌酶主要活性基团是Clu35的COOH和
31、Asp62的bCOOH，在游离状态下，Glu和Asp这两个羧基的解离常数差异不显著，但在酶分子内，Clu35残基处在非极性环境中，因此其羧基不解离(起广义酸碱催化)，而Asp52残基则处于极性微环境中，其bCOOH可解离(协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用)。由于微环境差异导致羧基解离状态不同，从而使此酸可以利用相应基团进行酸碱催化反应。Glu35的羧基起广义酸碱催化，向底物D糖环和E糖环之间的糖苷键上的氧原子提供一个质子，氧原子与D糖环C1的糖苷键断开，D糖环的C1 带上正电荷成为正碳离子。Asp52上的-COO-起协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用。思考题1、判断判断：溶菌酶的最适pH为5
32、.2，在此pH二侧活性下降的主要原因是活性中心Asp和Glu的不恰当解离。南开大学南开大学20012001年年 2.判断判断：溶菌酶水解的底物是N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物（）中国科学院中国科学院20032003年年思考题北京科技大学北京科技大学20112011年年3、（二）、核糖核酸酶（二）、核糖核酸酶A（RNase A）RNA 的碱水解机制的碱水解机制牛胰核糖核酸酶A酶的活性中心：His12 His119 Lys41 General AcidGeneral Base核糖核酸酶A水解机制牛胰核糖核酸酶A催化机理General AcidGeneral Base 核糖核酸酶是由核糖核酸酶是由124
33、个氨基酸组成的一条多个氨基酸组成的一条多 肽链，肽链，含有四对二硫键，空间构象为球状分子。含有四对二硫键，空间构象为球状分子。核糖核酸酶核糖核酸酶A 羧肽酶A（carboxypeptidaseA）是一个具有307氨基酸的单链蛋白质，其中紧密地结合着一个锌离子锌离子，它对酶活性很重要。羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基。（羧肽酶B：仅Arg、Lys，如果C-末端第二个残基是Pro,则酶A和酶B都不起作用.羧肽酶C能水解C-末端的Pro.）锌离子在羧肽酶A的活性部位上与两个组氨酸侧链和一个谷氨酸侧链和一个水分子相配位（三）、羧肽酶A（carboxypeptidaseA）催化中心催化中
34、心结合中心结合中心1、为验证羧肽酶A Tyr 248 在催化中的作用，对其基因进行定点突变Tyr 248（TAT）定点突变为Phe（TTT）；实验结论是，Tyr 248 参与了与底物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据：A.Kcat 突变后降低 B.Km 变大 C.Kcat/Km 升高 D.Kcat 不变 E.Kcat/Km 降低上海交通大学2007生物化学 定点诱变2、判断：用羧肽酶A 水解一个肽，发现从量上看释放最快的是 Leu，其次是Gly，据此可断定，此肽的C 端序列是：Gly-Leu.（）华南理工大学2007年羧肽酶羧肽酶A催化机理催化机理带负电荷四面体带负电荷四面体过
35、渡态中间物过渡态中间物羧肽酶羧肽酶A催化机理催化机理(四）、丝氨酸蛋白酶 一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理相似，一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理相似，可把它们归为一族。可把它们归为一族。蛋白水解酶：蛋白水解酶：（1）丝氨酸蛋白酶家族（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）（2）锌蛋白酶家族（羧肽酶等）（3）巯基蛋白酶家族（木瓜蛋白酶等）（4）羧基蛋白酶家族（胃蛋白酶等）1、名词解释:丝氨酸蛋白酶 山东大学山东大学 2011 2011 生物化学生物化学2、胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶典型的催化机制：广义酸碱催化共价催化。活性中心由Ser195、His57、Asp102
36、组成；Ser195的活性中心确定：用DIFP（二异丙基氟磷酸）进行化学修饰。（有机磷杀虫剂）His57的催化活性确定：用不可逆抑制剂TPCK（N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮）。水解过程分酰化和脱酰两个阶段。没有底物时没有底物时结合底物时结合底物时电荷中继网胰凝乳蛋白酶的催化三联体 丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser-His-Asp催化三联体 电荷中继网：通过电荷中继网进行 没有底物时：Ser195His57Asp102形成一个氢键体系，His57是去质子化状态，Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。结合底物时：His57从Ser195接受一个质子，增加了Ser195羟基氧原子对底物
37、的亲核攻击性，Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式。胰凝乳蛋白酶的催化三联体胰凝乳蛋白酶的活性中心结合部位：决定专一性催化部位丝氨酸蛋白酶的专一性 丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性趋异进化 丝氨酸蛋白酶的趋异进化P409P408丝氨酸蛋白酶的专一性 胰凝乳蛋白酶：口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键 胰蛋白酶：口袋较大，底部有Asp，利于 L
38、ys.、Arg结合，裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶：口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小分进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键结合结合中心中心 4.胰凝乳蛋白酶的催化机制P409 胰凝乳蛋白酶的催化机制P4092.蛋白酶的酸碱催化作用加强了共价键化基团对肽键碳原子的亲核进攻能力。（是非题）中山大学中山大学20092009年年 胰凝乳蛋白酶的催化机制Activation Of Ser residuecovalent linkage with carbonyl group of polypeptide chain andFormation of tetrahe
39、dral inter-mediate transition state Cleavage of peptide bond,释放C端肽链第第1次四面体过渡态中间物次四面体过渡态中间物第第1阶段：阶段：酰化酰化NC 胰凝乳蛋白酶的催化机制Activation of water molecule by pairing with its hydrogen atom(through a basic residue)Formation of second tetrahedral intermediate transition stateRegeneration of Ser residue by a pr
40、otonated basic residue第2次四面体过渡态中间物第第2 阶段：脱酰阶段：脱酰Biochemistry 3070 Enzyme MechanismsEnzyme Mechanisms Chymotrypsin胰凝乳蛋白酶反应的详细机制 第一阶段：酰化 Ser195-OH 中的氧攻击肽键的羰基碳（共价催化），酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢键（酸碱催化），形成四联体过渡态（Ser195O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+），肽键断裂氨基产物释放，底物的羧基部分共价酯化到Ser195的羟基上。第二阶段：脱酰 电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-
41、攻击连在Ser195上底物的羰基C原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，底物中的酸成分从Ser195上释放。The Structure Folds of Chymotrypsin vs Substilisin枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 趋同进化趋同进化The overall folds of two members of different superfamilies of serine protease.The enzymes are chymotrypsin(top)and subtilisin(bottom).The residues in the
42、 catalytic triad are indicated for each)来源不同，功能特征相同，称异源的趋同进化。胰凝乳蛋白酶中是：胰凝乳蛋白酶中是：Asp102-His57-Ser195 枯草杆菌蛋白酶是：枯草杆菌蛋白酶是：Asp32-His64-Ser221Chymotrypsin酸碱度影响胰凝乳蛋白酶 In summary of Serine Proteases胰凝乳蛋白酶典型的催化机制：广义酸碱催化 共价催化。活性中心由Ser195-His57-Asp102组成；1.Asp102的确定:identified by X-ray crystallography2.Ser195的确定
43、:用DIFP（二异丙基氟磷酸）-化学修饰。3.His57的催化活性确定：用不可逆抑制剂TPCK-亲核标记。水解过程分酰化（Acylation）和脱酰（Deacylation）两个阶段。课后题课后题 9.胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些因素引起这些差异？因素引起这些差异？答：相似之处：相似之处：执行相同的反应裂解肽键；其结构和作用机制很相似；相对分子质量范围在 2.5103，并且具有相似的顺序和三级结构；3 个极性残基 His57、A
44、sp102 和 Ser195 在活性部位形成催化三联体。不同之处不同之处：专一性不同（二）烯醇化酶（enolase）作用需要金属离子（Mg2+)生物化学教程Enolase reaction involves metal ion and general acid-base catalysisgeneral base catalysis:protonabstractedbyLys435general acid catalysis:Glu211donatesproton,facilitateseliminationofthe-OHgroupMetal ion catalysis:twoMg2+ion
45、sbind and orientthesubstrateandstabilizetheenolicintermediate.ThismakestheC-2proton(blue)moreacidic(lowersitspKa)thuseasiertoremoveFig.6-23,Lehninger4thEd.它们的活性中心是由两个天冬氨酸残基所组成，如由胃膜分泌的胃蛋白酶、肾脏中的血管紧张素释放酶及细胞溶酶体中的某些组织蛋白酶等。胃蛋白酶是典型的天门冬氨酰蛋白酶。一条肽链，相对分子质量为35103；胃蛋白酶的活性中心含有一水分子，水分子的两翼是Asp 215和Asp32（当一个天冬氨酸为离子化
46、形式，另一个为非离子化形式时酶才表 现其活性；天冬氨酸在酶的催化过程中起两个作用：激活它们之间的水分子，充当质子 的受体和质子的供体，形成催化二联体，进行广义的酸碱催化）。（五）、天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸天冬氨酸-活化水活化水天冬氨酸蛋白酶催化机制天冬氨酸天冬氨酸-活化水活化水思考题1.胃蛋白酶偏酸性，这说明其有哪些官能团？有哪些氨基胃蛋白酶偏酸性，这说明其有哪些官能团？有哪些氨基酸提供这些官能团？酸提供这些官能团？大连理工大学大连理工大学2012年生物化工专业生物化学年生物化工专业生物化学 2.苏州大学2004 年生物化学考研试题 1)举例说明竞争性抑制原理及应用 2)以溶菌酶或
47、糜蛋白酶为例说明酶作用机理 思考题3.胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的三维结构相似，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的三维结构相似，活性中心的丝氨酸附近的氨基酸序列也完全相同，活性中心的丝氨酸附近的氨基酸序列也完全相同，但作用的但作用的底物各不相同。底物各不相同。试根据底物的结构特点推测三种酶作用部位试根据底物的结构特点推测三种酶作用部位的结构特点。的结构特点。厦门大学2004年4.胰凝乳蛋白酶的活性中心中构成一个电荷中继网的三个氨基酸残基是:()A,HIS,Arg,Glu B,Ser,Lys,Asp C,Ser,His,Asp D,Ser,Arg,Glu江苏大学2005年思考题5.利用
48、利用DIFP对胰凝乳蛋白酶进行化学修饰对胰凝乳蛋白酶进行化学修饰,DIFP在温和条件在温和条件下只与酶上的一个下只与酶上的一个Serl95结合结合,化学修饰后化学修饰后,酶失去活性酶失去活性,且此酶且此酶也不能再与最适底物类似物也不能再与最适底物类似物TPCK结合结合,说明说明Serl95是（是（）:A.别构部位别构部位 B.催化部位催化部位 C.底物结合部位底物结合部位 D.与酶的催化活性无关与酶的催化活性无关。天津工业大学2007年6、酶催化反应的本质是降低达到反应平衡的活化能，请用酶催化反应的本质是降低达到反应平衡的活化能，请用实例说明共价催化、酸碱催化降低活化能的机理。实例说明共价催化
49、、酸碱催化降低活化能的机理。2008 2008 年中国农业大学年中国农业大学思考题8、判断：丝氨酸蛋白酶反应的动力学属于乒乓机制 中国海洋大学研究生考试真题中国海洋大学研究生考试真题2011生化生化 9欲较彻底的水解丝心蛋白，选用（）为宜。A.弹性蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.胰凝乳蛋白酶 D.嗜热菌蛋白酶南开大学南开大学 2002 2002 年年10判断：二异丙基磷酰氟是胰蛋白酶的亲和标记 南开大学南开大学 2001 2001 年年四、酶活性的调节控制调节酶：活性可被调节的酶，主要是2.酶在生物体内的调节主要有别构调节和（）?中山大学2009生物化学别构酶别构酶共价修饰酶共价修饰酶（1）别构效应
50、别构效应（又称为变构效应）：别构中心结合了效应物后，导致酶的构象发生改变，影响了活性中心对底物的催化作用。（某些物质能以非共价键形式与酶活性中心以外特定部位结合,使酶蛋白分子构象发生改变,从而改变酶的活性.）（2）别构酶别构酶：各种配体与酶的结合后，酶发生的构象变化，导致后继配体的亲和力改变的酶，别构调节不引起酶的构型变化，不涉及共价键变化。P413（一）别构调节（3）.Allosteric effectors别构调节物（别构效应物：Allosteric effectors）：与别构酶分子中的别构中心（调节中心）非共价结合后，诱导生或稳定了酶分子的某种构象，从而调节酶活性中心对底物的结合。A
