1、授课人：XX XX XX学院 XX 专业【全套课件全套课件】前言 生物技术（Biological Techniques)二十一世纪是信息时代,是知识经济时代。知识经济时代有以六大技术为标志的高新科学技术群：电子信息、生物技术、新材料、新能源、海洋技术、航空航天技术。生物技术是当今六大高新技术之一。我国把它列为六大高新技术之首。生物技术是世界各国普遍关注和重视的热点，如19731977年全世界约有400多家生物工程公司，到1992年单美国就创办2000多家生物技术公司，每年投入近60亿美元进行研究开发利用。2000年世界生物技术产值估算超过6000亿美元。生物技术对解决当今社会许多重大问题，如人
2、口、食物、能源、环境污染、人类健康等问题的解决发挥了极重要的作用。绪论（preface)一、生物技术的定义及其用途 生物技术是一门重要的应用科学。（一）生物技术的概念 （Biological Techniques)定义：以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理，生产生物制品和创造具有特定性状的新品系或新物种的科学技术。与生物技术有关的学科：生物学、分子生物学、细胞生物学、生物化学、微生物学、遗传育种学、数理化 形成和发展有赖于：化学工程学、电子学、计算机、材料科学、发酵工程科学（二）生物技术的内容：1、包括：基因工程 细胞工程 酶工程 发酵工程 蛋白质工程：运用基因工程全套技术 改 变蛋白质结
3、构的技术。染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。生化工程：生物反应器及产品的分离、提 纯技术。生物反应器：利用酶或生物体（微生物、动植物细胞）具有的功能，在生物体外进行化学反应的装置系统。2、基因工程 在基因水平上操作并改变生物遗传的技术，它的核心是重组DNA技术。基因工程包括：体外DNA重组 体内基因操作 基因化学合成等 基因工程主要用酶作工具，切割 DNA，将DNA片段连接到载体（质粒、病毒等），形成遗传物质的新组合，然后再转移到寄主细胞中扩增和表达。基因工程特点：较复杂，难度较大，但它是分子生物学的生长点，有发展前途，能提高其他工程的层次。3、细胞工程 应用
4、细胞培养、细胞融合等细胞生物学方法，以改善品种，生产生物制品及其组分的技术。包括：植物组织培养 生产植物次生代谢产物的 细胞培养 植物种质的保存和保持 作物试管微型繁殖（快速繁殖、育 种、无病毒）体细胞无性系突变体 初级代谢产物：维持细胞生长必需的代谢产物，它包括合成代谢的中间产物及终产物。次生代谢产物：由初级代谢产物衍生而来，对生物的生存、生长、繁殖无关的那类代谢产物。4、酶工程：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。内容：酶的分离和提纯 酶的开发与利用 酶制剂的生产 固定化酶和固定化细胞技术 酶反应器的研究与设计 酶电极的研究与应用 酶分子的修饰改造 酶抑
5、制剂和激活剂的研究应用 酶的人工模拟 具有催化功能的大分子合成5、发酵工程 培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。四大工程互相联系，其中基因工程是生物技术的生长点、细胞工程是生物技术基础、酶工程是生物技术核心、发酵工程是生物技术工业化必由之路。二、生物技术的发展历史（1）生物技术的发端 人类农业活动的开始发端 制酱、制醋、酿酒最初的发酵技术5、发酵工程 培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。四大工程互相联系，其中基因工程是生物技术的生长点、细胞工程是生物技术基础、酶工程是生物技术核心、发酵工程是生物技术工业化必由之路。二、生物技术的发展历史（1）生物技术的发端 人类农业活动的开始发端 制酱
6、、制醋、酿酒最初的发酵技术（2）生物技术的演变过程及其特征：1857年发现了发酵现象；20世纪初（1939年），用发酵法生产 丙酮、丁醇制炸药；1942年发现青霉素；1953年提出DNA的双螺旋结构模型；1970年发现限制性DNA内切酶、连接 酶；1973年基因重组成功；1975年形成单克隆抗体。生物技术特点：以高科技为背景的高新技术；材料可更新、可循环、简单便宜，甚至可废物利用；常温下快速反应，耗能少；物料转化率高；工艺过程留下的废物可降解且无毒；产品涉及人类各方面（生活和生存的各方面）。三、生物技术的应用 七十年代以来，各种生物技术产品相继出台。并产生巨大经济效益。（一）农业 1、提高作物
7、产量、改良品质（1）选育作物优良品种：82年转抗卡那霉基因到烟草成功，提抗药性8倍,现已有4500多种作物转基因获得成功。包括粮作、烟草、经作、菜、牧草、瓜果、花卉、树木的抗基、高蛋白含量基因、固氮基因等。（2）快繁：甘蔗一块生长锥培养143天，产生1737株苗。（3）脱毒：茎尖无毒部分培养产生无毒 苗。（4）人工种子：各国30多种作物可 产生人工种子。（5）固氮（6）制无毒高效农药、除草剂（7）产生新物种 2、发展畜牧业（1）胚胎工程：胚胎移殖 胚胎切割 胚胎嵌合体 性别控制 核移植 体外受精（2）转基因动物（3）饲料（4）疫苗（二）食品1、利用微生物生产单细胞蛋白质2、微藻的培养3、DNA
8、重组技术使大肠杆菌生 产无壳鸡蛋4、定做新蛋白质5、发酵法生产6、人工合成（三）医药 应用广泛，特别是贵重药物生产、疫苗生产、新的诊病技术、新的治疗方法有特殊意义。1、基因工程生产药物（1）生长激素（2）生长激素释放抑制素（3）胰岛素（4）干扰素2、细胞工程生产药物3、发酵法、酶法生产抗生物质4、疾病诊治检测（1）单克隆抗体的应用：抗体：由抗原刺激在生物体内产生、并与抗原进行特异性结合的一类蛋白质的总称。抗原：能诱导动物产生抗体的任何化学物质。抗原抗体反应有高度专一性、一种抗体只能与它相应的抗原相结合。抗原刺激 抗体 单克隆抗体用途：A、诊病B、治疗疾病C、提纯D、检测E、单抗体内定位识别5、
9、基因疗法 通过基因移植（或修复）的方法，消除（或修补）人体内的“坏”或“致病”基因，植入“好的”基因或“抗病”基因，使疾病得到治疗。6、PCR技术7、生物信息学技术（四）能源、环境污染1、解决能源危机（1）改变石油开采途径（2）生物量的利用生物量：生物体及伴随其活动生成的有机 物的总称。A、燃烧 B、微生物作用在常温下湿物质产生：乙醇、沼气C、碳氢化合物 某些植物（特别是大戟属植物）汁液中含有碳氢化合物可作石油代用品或作提取石油化学工业的各种原材料代用品。D、光合放氢特殊情况下：绿藻 放氢 蓝藻 放氢 细菌 放氢E、生物电池 生物燃料电池：利用酶或微生物将没有电活性燃料转化为电活性燃料。如甲醇
10、、甲醛、氢，加上电极后，燃料物质在氧化还原过程中自由能变电流。2、消除环境污染 生命活动是合成与分解周而复始，生命把原子及简单分子合成复杂分子。生物死后，细菌、酵母菌、霉菌等微生物又把其分解成简单的分子和原子。环境污染：生物圈（人、动物）产生的废弃物；人类开发产生的污染：农药、石油 企业、工厂废水、气、渣。防污染途径：生化过程代替化学合成过程；生物农药代替化学农药，以虫治虫，菌 治菌；阻止有害三废物质过度产生，尽量再循 环利用。治理污染：物理法：燃烧 化学法：燃发电 生物法：微生物、酶降解有 毒有害物质。（五）采矿、工业 1、采矿 2、工业 3、国防 第一章 基因工程及其应用一、基因工程的概念
11、及其内容 在基因水平上操作并改变生物遗传的技术，它的核心是重组DNA技术，也称基因克隆、分子克隆。或：在分子水平上，用人工的方法提取（或者合成）不同的生物的遗传物质，在体外切割拼接和重新组合，然后通过不同方法把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞进行复制与表达，按人的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给下一代。主要过程：抽取目的基因切割拼接繁殖表达。体外DNA重组：SDS、CTAB、尿素等方法提取DNA 酶作工具切割DNA DNA片段连接到载体上形成遗传物质新组合 转移到寄主细胞中扩增表达 体内基因操作 基因化学合成(一)体内基因重组：细胞内（体内）发
12、生的DNA 重组现象1、原理：供体（供给目的基因的生物体）DNA 受体（接受目的基因的生物）的DNA 生同源交叉（重组）使供体目的基因导入到受体的DNA 上，通过筛选获得重组体。通过两个转化实验就可以构造一个重组体，过程简便但局限性大，只能在特定的目标之下（DNA具一定同源性）才可运用。在体内发大肠杆菌大肠杆菌转化转化DNA复制复制 同源配对同源配对联会交换联会交换提取质粒提取质粒质粒质粒转入半乳糖转入半乳糖不发酵细菌不发酵细菌半乳糖培养基半乳糖培养基特殊染色特殊染色白白色色菌菌落落红红色色菌菌落落 当前人们所说的基因工程一般是指体外基因工程或DNA体外重组，体外分子克隆技术。克隆：分子无性繁
13、殖系通过无性繁殖从同一个祖先衍生的一群基因型相同的细胞或生物体，这些细胞和生物体基因型相同。一、体外基因工程技术要点：目的基因、工具酶、载体获得；目的基因与载体结合成重组DNA分子；重组DNA 分子引入受体细胞建立无性繁殖系；筛选所需的无性繁殖系，外源基因在受体细胞表达。1、目的基因、工具酶、载体的获得（1）目的基因：在基因工程中所需的基因 来源：分离自然的基因 人工合成基因 化学合成 酶促合成（2）人工合成 DNA合成仪合成基因：化学方法合成较小核苷酸片段 缓慢冷却过程中互补的区段形成双链 连接酶的作用下，把多核苷酸片段连接起来 加上调控顺序（起始子、终止子）（3）分离自然基因：方法很多：利
14、用理化方法分离、鸟枪法、菌落显色法、分子杂交法、阻遏物结合法2、载体：是较小的DNA分子，用来运载和保护外源DNA，使目的基因顺利进入受体细胞并在其内复制和表达。（1）载体的功能（条件）能在宿主细胞中自我复制，并能稳定的保存，有一定的内切酶切点（每种酶对其最好只有一个切点）能嵌入外源DNA片段，而且外源DNA嵌入后依然保持其复制能力。具可作为重组DNA分子选择的遗传标记。例如：细菌（大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌）的质粒 入噬菌 动物病毒如类人猿病毒 SV 40 农杆菌质粒（Ti、Ri）（2）质粒（细菌）细菌中独立于染色体并能自我复制的DNA 双键闭环DNA分子，细胞分裂时，能稳定地传递给子代的遗
15、传因子 经改造后质粒有不同的表型（3）农杆菌 农杆菌有根瘤农杆菌（含Ti质粒）和发根农杆菌（含Ri质粒），他们之中有一段可转移的T-DNA。由于根瘤农杆菌的Ti质粒上的T-DNA能被植物细胞整合，并稳定表达和传递给下一代，因而Ti质粒用作植物基因工程载体。具体操作过程：外源目的基因 Ti质粒 重组质粒 转入植物细胞。插入感染植物3工具酶：主要是内切酶和连接酶（1）限制性内切酶 内切酶有三种类型：、型，以型多用。型：分子量较小；与底物作用时，只要有Mg+2 存在就能发 生作用；切割点高度专一；造成粘性末端，如ECORI CTTAAG GAATTC 由于同一种内切酶造成的单链尾巴碱基顺序相同，所以
16、极性相反的单链尾巴一定是互补的，不同来源的DNA经同一种内切酶切割后混在一起，就会通过粘性末端的碱基互补配对而自动靠拢。也有一些内切酶的切口是平的：CCCCGGGG GGGGCCCC（2）连接酶 内切酶造成的粘性末端只能使DNA片段的互补单链尾巴彼此靠拢，但不能连接，连接酶把一个DNA片段5端的磷酸基因同另一个DNA片段的3端糖环上的羟基（-OH）以酯键的方式连接成一连续的DNA分子。2重组DNA分子 用同一种限制酶，切割不同来源的DNA产生DNA片段，可通过粘性末端对应碱基间的氢键集合到一起，并经DNA连接酶的作用，将切口接合起来，成一定完整的重组DNA分子。3转化和筛选1）转化 目的基因同
17、载体连接以后，便要将重组的载体输入受体细胞。受体细胞主要是细菌，如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、放线菌和动植物细胞等。转化过程：受体菌0、1MCaCl2（冷）处理，使细胞成感受态（大肠杆菌细胞）加入外来DNA分子，使与之相混合 混合吸附（外来DNA完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面）转入（双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌、另一链降解）自稳（外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA）表达（供体基因随同复制子同时复制，并被转录转译）转化成功率占DNA分子0.01%左右 感受态：细菌吸收转化因子（周围环境中的DNA分子）的生理状态。（2）筛选 接受了外源DNA的宿主细胞，只有其中一
18、小部分含有需要的基因，因此，重组DNA分子进入受体细胞后，就要从细胞群中选出含有所需重组分子的细胞 ，然后再繁殖成含所需基因的无性繁殖系（基因克隆）。(1)插入失活法 某些质粒DNA带有抗性基因或其他营养代谢标记基因。发酵乳糖（蓝）、半乳糖（红）基因 抗基失活、营养代谢基因失活 适当培养基筛选（2）杂交法原理：两条单键DNA中互补碱基序列能专一配对；利用已标记的某一DNA（RNA）作片段作为探针，探测重组DNA分子中是否有与探针同源的DNA顺序。插入外源DNA4植物细胞的遗传转化 第一步带有目的基因的受体大肠杆菌的质粒转到农杆菌质粒中去，然后用农杆菌去感染植物细胞，把目的基因导入植物体。大肠杆
19、菌（中间载体）农杆菌（在辅助质粒作用下，把中间载体的质粒导入农杆菌）两种质粒同源重组，目的基因插入农杆菌质粒。转化植物细胞 农杆菌介导：共培养：原生质体共培养 悬浮细胞共培养 愈伤组织共培养 叶圆盘法 活体接种法 DNA直接导入：基因枪法 电激法 花粉管通道法转化体的筛选：按质粒携带的抗性标记，选择 合适的选择培养基进行筛选。细胞转化方法三、基因工程的应用 1973年基因首次克隆成功以来，基因工程应用广泛。医药：基因工程菌生产药物 基因疗法 基因诊病食品、工程菌生产食品添加剂、色素、无壳 鸡蛋白（卵清蛋白）发酵工业：生产氨基酸、蛋白质饲料化学工业能源环境保护矿产开采农业：分子育种、生物因氮、生
20、物农药、畜牧兽医（一）多聚酶链式反应及其应用 它从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的序列，使某一DNA片段得到特异性的扩增，是DNA特定片段体外扩增技术。过程：提取总DNA 片段 变性 单链 模板 引物、核苷酸、聚合酶等 合成互补链 应用：测病切割（二）蛋白质工程 根据蛋白质结构研究结果，设计一个新蛋白质的氨基酸序列，通过修饰编码原蛋白质的DNA序列，最后创造出新的蛋白质的技术。是运用基因工程全套技术，按人的意志设计创造出适合人类需要的不同功能，不同性能的新的蛋白质。过程：测蛋白质结构功能 获编码设蛋白质的DNA序列 按蛋白质结构与作用机制设计改造方案 选择适当修饰点，改造基因序列
21、改造后基因片段插入表达 分离纯化表达产物，功能检测 新的蛋白质(三)生物固氮 1、概况 氮是植物生长必需的主要营养元素，农业增产的关键。氮是人类赖以生存的蛋白质食物主要成份。植物氮来自：天然固N 工业合成 生物固N（微生物）工业生产氮肥：耗能费大 环境污染2、固氮菌类型（1）自生固氮微生物 （2）共生固氮微生物 （3）联合固氮微生物 在各类群中，以共生固氮微生物为多，其中又以根瘤菌和豆科植物共生固氮最重要。3、固氮菌固氮原因 氮分子是三个共价键将两原子联结而成，性质很稳定，要打开化学键特别是第一条键耗能最大，要转化成植物可吸收的NH3需耗很大能量。固氮微生物自然N2 NH3（细胞内外都 常温常
22、压固氮酶 可进行）固氮酶特点：极怕氧，无氧条件下才有固氮活性，遇氧中毒（蛋白变性）迅速失去活性。固氮微生物固氮遗传功能的单元是固氮 基因。4、当前生物固氮的研究方向 固氮细菌（如根瘤菌）感染非豆科植物，将自然界现有共生固氮体系扩大到非豆科作物上，创造新的共生固氮体系，使非豆科植物固氮。通过基因工程、细胞工程转移固氮基因，构建自身能固氮的植物。（1）将共生固氮根瘤菌引入非豆科植物，形成共生固氮体系。有植物激素诱导法、酶解法 激素诱导法：小麦砂培 23片叶接种根瘤菌 在含2，4D的培养液中培养 2，4D引导根瘤菌进入小麦根内酶解法：纤维素酶、果胶酶降解根毛细胞壁，引导根瘤菌进入。（2）通过基因工程
23、转移固氮基因 途径是首先将固氮基因转到一载体上，再将载体导入植物细胞：以叶绿体作载体 农杆菌作载体 现在进展是将固氮基因 大肠杆菌（属原核生物，转入固氮基因后产生固氮活性）酵母菌（属真核生物，失去固氮活性）（四）生产农药、生物肥料 生物农药：由生物体产生的具有防治病虫害和除草功能的一大类物质总称。他们的大多数是生物体代谢产物。生物农药包括：微生物杀虫剂 农田抗生素制剂 微生物除草剂 优点：对人畜及害虫的天敌，没有或有极小毒 害作用；有效控制病虫害和杂草；保持生态平衡，减少化学污染，可进行生 物降解。1、杀虫剂：病原微生物（细菌、病毒、真菌）及其产生的毒素，有微生物杀虫剂、动物杀虫剂。微生物杀虫
24、剂 病毒杀虫剂 核型多角体病毒 质型多角体病毒 颗粒体病毒 细菌杀虫剂：苏云金杆菌杀虫剂 金龟子芽孢杆菌 真菌杀虫剂 虫霉类真菌 造成僵病的真菌 动物杀虫剂 原生动物杀虫剂 线虫杀虫剂 新线虫 草线虫杀虫剂昆虫病毒基因工程改造：主要对杆状病毒改造，因其基因组较大（80-160Kb）插入外源容量大，插入外源基因表达水平高，表达产生正常糖基化，具与天然蛋白相似的抗原性和功能。1引入外源蛋白基因到杆状病毒，增其毒性，如非洲毒蝎的特异性神经毒素基因到杆状病毒，使昆虫麻痹，喂蜈虫残废率达55%。2引入于扰虫正常生活周期基因到杆病毒，虫食后未成熟状停取食或失水死亡减少作物受害。3修饰杆状病毒基因扩大宿主范
25、围，如：斜纹夜蛾核型复角体病毒x甜菜夜蛾核型复角体病毒 扩大宿主范围。2、杀菌剂 细菌和放线菌 真菌和病毒 抗生素 通过拮抗作用抑制植物病原物生长。基因工程改造抗病细菌：删除导致防病能力下降的基因 分离编码毒素基因，转移到：（1）植物根部生活或在植物内部寄生 的细菌中表达；（2）植物体内。3、生物除草剂 杂草的病原微生物有真菌、线虫、病毒等。4、生物肥料：人工选育某种“有益菌”，经发酵浓缩等工艺制作而成有：直接促植物生长 ：从大气中固氮 增加Fe、P矿质元素吸收 合成植物激素 间接促植物生长：有益微生物阻止有害微生物的生长（抗生现象这是由于有益微生物耗尽某种营养，或释放某种有害微生物生长的物质
26、）。（五）分子育种1、意义、概念：通过杂交育、诱变育种等方法使基因重组、基因突变、染色体数目变化，引起作物产生变异，传统的常规育种方法存在以下问题：同源性限制远缘杂交 重组分离难得到双亲性状 在个体水平上，根据表型进行选择分子育种：在分子水平上按预先设计的蓝图，借助实验室技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，培育新品种。2、内容分子育种包括二个层次的生物工程技术：（1）外源DNA导入技术第一层次 将带有目的基因的DNA片段导入植物，筛选获得目的性状的后代；（2）基因工程技术第二层次 将目的基因分离出来，构造重组分子导入植物筛选获得目的基因表达的后代、培
27、育新的品种；第二层次的工程技术，技术高、复杂、难度大，要有一定财物力。3、外源DNA导入技术 其步骤有DNA获得及外源DNA导入。（1）DNA获得：DNA特性：细胞内的DNA、RNA都是以核旦白的 形式存在；不稳定易高热、强酸、强碱、紫外光、电离辐射影响而变性或降解；细胞内的RNA酶、DNA酶在分离提取 DNA过程中，DNA、RNA会被降解。抽提植物总DNA的原理：先用机械的方法使组织和细胞破碎；加入离子表面活性剂溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂；进入核内的表面活性剂解聚核中的核蛋白，并与蛋白质形成混合物，使核DNA释放出来；加入表面活性剂，使蛋白变性，离心除去上清液，加入无水乙醇使D
28、NA析出絮状沉淀。步骤：研磨抽提蛋白质变性DNA沉淀缓冲液溶解去RNA总DNA溶液。（2）导入方法a、以花粉作为DNA载体导入 花粉萌发时吸收DNA溶液后授粉或外源DNA溶液与花粉混合授粉，通过授粉作用外源DNA导入受精卵中。b、微量注射法 用玻璃毛细针借助微量进样器，将外源DNA注入自花授粉后的 胚珠 中轴胎座 禾谷类作物乳熟期硕果c、花粉管途径法 受体植物自花授粉后一定时间，将供体DNA 从雌花柱头引入子房，使其沿着花粉管生长时在花柱中开辟的通道进入胚囊，转化受精前后的卵细胞。d、浸苗法 4、导入技术的验证 外源DNA导入棉花、水稻、小麦等作物，可见形态特征生理特性变异，为更确切了解其技术
29、的效果，进行分子验证。5、导入技术评价优点：转化率高 不需细胞、原生质体等组培、诱导再 生植株 方法简便，易掌握 育种时间短缺点：可能带入非目的性状 限开花时期进行 有一定随机性(六)转基因作物的安全性评价（GMC）1.GMC作物的种植情况:a.通过基因工程可将单个或一小簇基因转入植物体，获得转基因植物，对作物进行改良。b.1986年获得第一株抗除草剂榻基因烟草植株。c.最常改良的性状：抗除草剂、抗虫、品质、抗病毒、抗真菌，抗逆（寒冷，盐碱）。d.到1997年底全球12个作物6类性状批准了48个转基因作物种商业化生产。第一个被批准商业化生产的品种是美国的 Calgene公司开发的延熟番茄。19
30、96年全球种转基因作物面积 280公顷;1997年全球种转基因作物面积 1280公顷;1998年全球种转基因作物面积 2780公顷;1999年全球种转基因作物面积 3990公顷。主要种植国家：美国、中国、阿根廷、加拿大、澳洲和墨西哥。由于转基因作物广泛种植产量增加，减少使用农药除草剂，带来了巨大的经济效益。国际农业生物技术应用机构统计和预测全球转基因作物获利：2000年30亿美元；2005年达到80亿美元；2010年280亿美元。今后转基作物将继续发展，长远研究主要是基因控制的，非生物性的胁迫性状。如：抗旱、耐盐、耐铝性等。我国农业基因工程研究于80年代初期后开始启动，到1996年底我国正在研
31、究的转基植物种类达47种，涉及各类103个。商品化生产6种转基植物：1.华中农大 转基耐烂番茄2.北京大学 转查尔酮合成酶基因矮牵牛 抗病毒甜椒 抗病毒番茄。3.中国农科院 抗虫棉花 美国 抗虫棉 4.广东省农科院 华农大2000抗青枯病 辣 椒株系。5.广东（科院单位高校）获水稻、沙田柚、马铃 薯10个作物转基成功。2.转基因植物安全性的提出 随着转基因作物商品化发展，转基因作物的生态风险，可能带来的环境问题，GMC产品的遗传学或营养成分的非预期的改变，对人类健康是否产生潜在危害，产品贴标签问题，运输，国际贸易问题，知识产权问题等已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。对GM食品安全性担忧有几
32、方面：GM食品携带的抗抗生素基因是否使动物，人的肠道病原微生物产生耐药性；抗虫作物是否有残留的抗虫内毒素，对人健康有害否；抗除草剂的GMC是否导致除草剂用量增多（农药残留造成污染）抗基因是否飘移到杂草上；抗病毒GMC引入病毒外壳蛋白基因是否对人体有毒，GMC是否存在过敏原。3.GMC及GM食品安全性的评价：对于以上问题有些是需要澄清，有些需要严 格试验，有些需要有效监测。对抗虫GMC的内毒性对人体的毒害。GM食品所有的抗生素标记是否对人体产生抗药性问题。对于除草剂抗性问题。抗病毒GMC引入病毒外壳蛋白基因。GMC是否存在过敏原。常见过敏食物 过敏食物分 不常见过敏食物 对GMC和GM 食品的安
33、全评价应达到以下共识：1 GMC广泛种植已带来巨大经济效益，社会效益，对解决世界人口对粮食增长40%的需求发挥巨大作用。2 GMC，GM食品安全性应着重从宿主、供体（提供、接受GM的分类、基因型、表型）、载体、插入基因、基因表达产物对食品营养影响等进行考察，考虑鉴定，并与传统食品比较。食用后人体、生物体生长发育、繁殖有无障碍。3.建立对GMC、GM食品安全性的评估标准及正确 评估方法。4 加强对GMC的长期效应跟踪研究。5 完善加强对GMC、GM食品的安全管理。凡从事农业生物基因工程的单位和个人，本着对我国生态环境、人类健康高度负责物精神加强对农业生物基因工程安全管理，未经申报批准的农业生物遗
34、传工程体不得进行环境释放，已批准释放的要草按按照批准的时间、地点，范围实施。第二章细胞工程及其应用一、细胞工程内容及其发展（一）定义：应用细胞培养、细胞融合等细胞生物学方法，以改善品种，生产生物产品及其组分的技术。其内容广泛包括：植物器官培养和快繁 茎尖培养和无毒苗生产 胚胎培养和胚挽救技术（包括胚乳培养、试管受 精）花药培养和单倍体育种 细胞培养和次生代谢产物的工业化生产 植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异 原生质体培养和融合 人工种子 单克隆抗体技术（二）发展史：源远流长 18381839年提出细胞学说；1902年提出细胞全能性；细胞全能性：植物细胞具有原植物的全 部遗传性，单细胞经人工
35、培养，通过细胞分 裂而恢复成完整植株。1904年用胡萝卜胚培养成株，三十年代获愈伤组织。1948年发现腺嘌呤，生长素对芽形成的影响，建立腺嘌呤/生长素的比例控制芽根分化。1956年发现激动素促芽形成效果高，促组培工 作研究；六十年代从曼陀萝花药培养获植株建花培技术；1972年细胞融合成功；1912年培养动物细胞；1958年获细胞融合（种间、腹水癌细胞+病毒）六十年代初换核术成功；1975年获杂交瘤；我国70年代中开始细胞融合；现有40多种花粉植株，在我国首次成功。二、应用（一）植物组织培养技术及其应用1、概念及其内容(1)概念广义：愈伤组织培养，离体器官、组织、细胞、原生质体的离体无菌培养。狭
36、义：以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳 组织、薄壁组织、髓部）或已诱导的愈伤组 织为外植体的离体无菌培养，外植体：第一次接种用的植物材料。(2)内容:广义的组织培养包括：植株培养 胚胎培养 器官培养 组织培养 细胞培养 原生质体培养 植物细胞大量培养生产有用物质（3）意义：无性系快速繁殖 植物脱毒应用 植物遗传育种应用 组织培养生产有用物质 植物种质保存 科学研究 2、实验室设置及仪器 植物组织培养技术性很强，无菌条件很高，要求有最基本的实验设备条件及熟悉一般操作技术才可以进行。植物组织培养通常是外植体 愈伤组织 植株。整个操作核心是无菌操作。要点：
37、设备设施、培养基、培养条件。再分化再分化培养基去分化培养去分化培养基去分化（脱分化）：植物细胞在生长激素作用下，失去原来分化的状态而不断地分裂为愈伤组织的过程。再分化：愈伤组织在激素作用下，分化成为各种器官的过程。愈伤组织：一团分化程度低的薄壁细胞团。(1)实验室的设计 组培的实验室有化学实验室、无菌室、培养室、细胞学实验室、摄影室、灭菌室等，以化学实验室、无菌室、培养室、灭菌室为主必不可少。（如下图）水槽天平冰箱仪器药品柜工作台培养瓶架烘箱 化学实验室 无菌室培养室 缓冲间超净工作台培养架培养架推拉门灭菌待用培养瓶架 、化学实验室 用途：药物放置、称取、配制 仪器存放、洗涤、干燥、灭菌 培养
38、基配制、消毒 制蒸馏水接种材料：准备、培养 要求：干净、便于工作 放置的仪器：药物框、天平、烘箱、培养箱、高压灭菌器、无离子水发生器、蒸馏水器水槽、电炉B、无菌操作室 用途：接种外植体、转移培养物，原生质体的游离、放灭菌后用的培养基。要求：关键保持较长时间无菌状态。要做到以下几点：墙壁地面光滑平整无缝隙；空气不对流，空气净化后入室内，一天换 一次空气或装排气扇；控制温度；装日光灯照明，紫外光灯消毒，工作台装 紫外灯消毒。设缓冲间 作用：防工作人员带入杂菌，约2即可。设洗手池、装消毒液、衣架，供工作人员换衣、鞋、帽、口罩。定期消毒：2%新洁尔灭溶液擦地板，每天甲醛、KMNO4消毒。设置：培养架：
39、放灭菌后待接种的培养基；照明灯、消毒紫外光、排气扇。超净工作台或接种箱，接种箱有单人、双人操作两种。(如图2）55cm40cm 60cm18cm玻璃灯（照明、紫外线）单人接种箱单人接种箱双人接种箱双人接种箱C.培养室 用途：离体组织、原生质体和试管苗生 长发育的场所，相当于作物的大田。要求：墙壁地面光滑保温、保湿，窗装双层 玻璃透光保温，顶高2.6m易控温湿；恒温灯25-27,日光灯照明；保持干燥清洁：定期2%新洁尔灭溶液消毒，定期熏蒸，喷70%酒精降尘。设置：光培养室：培养物上方装日光灯，用于分化培养。暗培养室：用于诱导培养或紫外检测。培养架：用于固体培养，用3*3cm或2.5*2.5cm万
40、用角铁搭成46层，最低一层离地40cm左右，每层间隔30cm，一般1.3m长，宽50cm，每层装2支40w日光灯。摇床、转床D:细胞学实验室 用途：观察组培过程 普通显微摄影 细胞学、形态学解剖 切片、制片观察 要求：洁净、干燥、明亮，台面平整稳固。设施：体视显微镜 倒置显微镜摄影装置 解剖镜切片机、染色设备E:摄影室F:灭菌室 用途：器皿、培养基高温高压灭菌、消毒、制蒸馏水。要求：防潮、耐高温、室内排供水良好，通气、易排蒸气、热量。设备：水、电、煤气、高温高压消毒仪器、制蒸馏水器。(2)仪器设备及玻璃器皿仪器设备:A、天平 B、烘箱 C、恒温箱 D、冰箱 E、酸度计F、超净工作台 使用：台面
41、摆放接种工具。接种前紫外光灯照射20分钟、操作人员入室后关灯，开动超净台10分钟后（风机鼓风）才开始接种。使用前、后台面用棉花酒精点火擦拭灭菌。G、灭菌器：有手提式、立体和卧式三种。H、离心机I、显微镜及显微摄影J、摇床和转床玻璃器皿和用具:A、玻璃器皿：种类多、规格多 常用的有：三角瓶、容量瓶、试管、培养皿、量筒、吸管、烧杯等。B、用具：镊子、剪刀、解剖刀、酒精等。C、器皿、用具洗涤：目的：防有毒有害物质（重金属离子、酸、碱）影响培养物生长。洗涤顺序：去除油渍、培养基、霉菌等脏物 洗衣粉或洗洁精洗刷，使内壁不挂水珠 清水冲洗数次 晾、烘干备用较脏的玻璃器皿：肥皂水清洗晾干 洗液浸几分钟至几天
42、 取出滴干洗液 清水冲干净后 晾干备用。长形器皿（吸管、移液管）：洗液浸 滴干 清水洗净。盖载玻片：分开洗、水洗后 洗液浸几小时或稀洗液中煮沸半小时 清水洗净 软 布擦干 放95%酒精溶液中（滴少量浓盐酸）浸 用时取出，烧或擦干。新的玻璃器皿：有游离碱性物质。用1%盐酸溶液浸一昼夜 肥皂水洗 清水洗 蒸馏水淋一遍 干燥备用。3、灭菌及无菌操作：灭菌：物理灭菌：高温高压灭菌 干热灭菌、湿热灭菌 射线辐射 过滤灭菌 化学灭菌：熏蒸灭菌 消毒液灭菌（酒精、氯化汞、次氯酸钠（钙）溶液）。（1）灭菌A、高温高压灭菌 适于器皿、工具、衣物、培养基灭菌。方法：加热到0.5kg/cm2放掉冷空气,再加热到1.
43、1kg/cm2，121，保持1520分钟降压取出。效果：杀死一切微生物的营养体及其孢子。B、干热灭菌、湿热灭菌 适于玻璃器皿灭菌。烘箱：150 40分钟或120 2小时。金属用具：使用前浸在70%酒精中，用的时候 酒精灯上面烧，冷却后再用。或烘箱 120灭菌2小时湿热灭菌：用于培养基、工作服、口罩、帽子 用具、无菌水灭菌 C、过滤灭菌 超净台：筛网过滤空气 液体：激素，培养液 D、射线灭菌 室内：紫外光照20分钟可达灭菌效果。玻璃器皿、培养基：3万伦60Co r射线。E、化学灭菌 熏蒸灭菌法：甲醛+高锰酸钾 消毒液：种类多，各种效果不同。7075%酒精溶液：适于各种灭菌，杀菌效 果好，易挥发，
44、渗透力强，灭菌时间不宜长。外 植体有伤口时，易受损伤。氯化汞：多用作接种材料消毒，用0.1%溶液消毒 1020分钟，去除较难，但效果最好。杀菌力强。新洁尔灭溶液：地板、手消毒。(2)各种设施、用品、材料消毒过程。无菌室：清水拖地 新洁尔灭溶液拖地 前一天晚上甲醛高锰酸钾熏蒸 紫外光照20分钟后才进入工作。超净台：紫外光照20分钟 酒精溶液烧擦 开动510分钟 工作。器皿：洗涤 烘干灭菌 培养基：高温高压锅加热0.5kg/cm2放冷空气 1.1kg/cm2保持1520分钟，排气后取出 倒干锅内水。外植体：清水洗净或肥皂水洗或经无菌培养的材料 用70%酒精溶液（浸几秒钟）无菌水洗23次 饱和漂白粉
45、上清液浸1520分钟 无菌水洗23次 0.1%升汞815分钟 无菌水洗34次，滤纸吸干备用。（3）接种无菌操作过程：新洁尔灭溶液拖地板 甲醛、高锰酸钾熏蒸 工作前开紫外光灯20分钟 开动超净台105分钟 新洁尔灭洗手，70%酒精擦手 烧超净台面 点燃酒精灯 烧培养瓶口灭菌 烧工具 酒精灯上无菌区内接种 烧瓶口 盖上盖。5、培养基的配制及培养方法（1）培养基的成分及其作用 组成：水 无机盐：大量元素 微量元素 有机化合物：碳源 维生素 氨基酸 植物激素 天然提取物 琼脂 其它：PH值、活性炭、抗生素、抗酚类物质污染的添加剂、生长抑制剂、染色剂A、水：培养基大部分是水来源：不含或少含某些离子的重蒸
46、水（双蒸水）或去离子水。目的：保持培养基成分完全人为控制。作用：起媒介作用 组成作物体（占7580%）提供O、H元素 运输物质、调节渗透压B、无机盐、大量元素、微量元素大量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以上。微量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以下。大量元素：O、H、N、C、P、K、Mg、S、CaN：来源：硝态或氨态氮，或两者混用。作用：N吸收转化氨基酸蛋白质；蛋白质主要组分是N，核酸含N，酶本身是蛋白质；细胞生长分化需N。P：来源：NaH2PH4或KH2PO4作用：是植物体必需元素之一；与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降；高能磷酸键的化合物，供能ATP；与生命活动关系大，形成核蛋白、含P 化合
47、物、核酸组合；碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互 转化需磷。Mg、S：来源：MgSO4.7H2O满足硫镁的需要。镁是叶绿素组分。S是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺S影 响蛋白质合成、影响叶绿素形成。K：来源：KCL、KNO3、KH2PO4 作用：酶促反应活化剂。Ca：来源：CaCL2.H2O或Ca(NO3)2.4H2O、作用：影响酶的活性方向。决定新陈代谢的过程。构造细胞壁，影响细胞分裂。微量元素：Na、Cu、Zn、Fe、B、Mn、Mo、I 稍过量会发生中毒，但对生命活动很重要Fe：来源：Na2EDTA螯合剂加FeSO4.7H2O和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）螯合铁，PH7.68。作用：植物组织
48、延长生长有作用。Cu：促离体根生长。Na：酶的组成成分，防叶绿素破坏。Mn：与植物呼吸作用、光合作用有关。B：影响蛋白质合成。注意：不同培养基无机盐浓度相差有的高达10倍；高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，使生长加快；生根要求无机盐浓度低些。C、有机化合物 包括C、维生素、氨基酸、植物激素。a、碳来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽 糖、纤维二糖或多糖类的可溶性淀 粉、糊精及果胶,一般23%的蔗糖。作用：维持培养基的合适渗透压；构造植物体；参与新陈代谢。注意:不同浓度影响细胞的增殖分化。b、维生素类：总的作用：直接参与生物催化剂酶的形 成及蛋白质、脂肪的代谢。维生素C（抗坏血酸）：强还原能力，
49、防组 织氧化变褐。B1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤 组织活力有关。B2（烟酸或维生素PP）：促代谢，促胚的 发育，高浓度会抑制生长。B6（吡哆醇）：促根生长。肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥作用。c、氨基酸 来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合水 解酪蛋白，水解乳蛋白等。作用：是蛋白质的组分；促进器官增殖；可作有机氮源。d、植物激素低浓度：促细胞分裂、生根、开花、结果。高浓度：有抑制作用一般两大类：生长素、细胞分裂素。生长素：促细胞伸长、分裂、增大，主要有 吲哚乙酸、奈乙酸、2，4D等。吲哚乙酸（IAA）：特性：天然生长素 作用：促离体组织生长、促愈伤组织形成。萘乙酸（
50、NAA）：特性：人工合成的化学物质。作用：利发根，但根较细弱，IAA+IBA处 理使根生长健壮。2，4D（二氯苯氧乙酸）：作用：促愈伤组织形成，诱导作用比IAA高10倍。抑器官、绿芽、根形成，特别是高浓度时抑制作用更强。细胞分裂素：促细胞分裂分化，能显著改变其 他激素作用。6糠基氨基嘌呤（激动素、KT）：特性：化学合成物质。作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加KT能改善器官发生状况。6苄基氨基嘌呤（6BA）：特性：人工合成 作用：广泛诱导芽的形成，BA效力比KT大。玉米素（ZT）：特性：天然产物 作用：对某些植物有特效。腺嘌呤（AD）：作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。D、
