1、2022-8-51第七章第七章 杂交育种杂交育种2022-8-52第一节第一节 杂交育种概述杂交育种概述第二节第二节 常规杂交育种常规杂交育种第三节第三节 原生质体融合育种原生质体融合育种主要内容主要内容2022-8-53第一节 杂交育种概述2022-8-54 杂交育种杂交育种(hybridization)：指通过：指通过基因重组基因重组的方的方法获得法获得新基因型新基因型的一项育种技术。的一项育种技术。杂交的目的：使双亲或多亲的遗传物质重新组杂交的目的：使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得合，以获得综合双亲优良性状综合双亲优良性状的新品种。的新品种。杂交育种杂交育种:2022-8-551.
2、可以获得新品种。可以获得新品种。可以提高菌株性能，避免诱变饱和现象。可以提高菌株性能，避免诱变饱和现象。3.可以总结遗传规律，促进遗传学理论发可以总结遗传规律，促进遗传学理论发展。展。杂交育种的意义杂交育种的意义2022-8-56原核生物原核生物(细菌和放线菌细菌和放线菌)杂交过程杂交过程:两个亲本菌株的染色体发生部分转移，形成两个亲本菌株的染色体发生部分转移，形成部分结合子部分结合子(merozygote)，最后经交换、重组，最后经交换、重组直致重组体产生。直致重组体产生。真菌真菌杂交过程：杂交过程：通过有性生殖通过有性生殖(sexual reproduction)或准性生或准性生殖殖(Pa
3、rasexual reproduction)来完成。来完成。一、微生物杂交理论基础一、微生物杂交理论基础2022-8-57原核微生物杂交方式：原核微生物杂交方式：接合接合(conjugation)转化转化(transformation)转导转导(transduction)（一）原核微生物杂交理论基础（一）原核微生物杂交理论基础2022-8-58接合接合(conjugation)接合：接合：指指供体菌供体菌（“”）通过性菌毛与）通过性菌毛与受体菌受体菌（“”）直接接触直接接触，通过，通过F因子因子转移遗传物质的重组过转移遗传物质的重组过程。程。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，称为通过接合而获
4、得新遗传性状的受体细胞，称为接合子接合子（conjugant）。）。E.coli接合电镜图性菌毛性菌毛2022-8-592022-8-510F-F+F+F+F-+FFF+F-HfrHfrF-（多数情况下）（多数情况下）F-+HfrHfrHfr（少数情况下）（少数情况下）含含F F质粒菌株杂交结果质粒菌株杂交结果2022-8-5112022-8-512（二）真核微生物杂交理论基础（二）真核微生物杂交理论基础 真核微生物杂交方式：真核微生物杂交方式：有性杂交、准性杂交和原生有性杂交、准性杂交和原生质体融合质体融合等。等。1.1.有性杂交有性杂交 一般指一般指性细胞性细胞间的接合和随之发生的染色体重
5、组，间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。并产生新遗传型后代的过程。凡凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都可通，原则上都可通过与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育过与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。种。2022-8-5132.2.准性杂交准性杂交(parasexual hybridization)(parasexual hybridization)准性生殖是一种类似于有性生殖，但更为原始的生准性生殖是一种类似于有性生殖，但更为原始的生殖方式，它可使同种生物殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞两个不同菌株的体细胞
6、发生融发生融合，且不以减数分裂的方式而发生合，且不以减数分裂的方式而发生低频率基因重组低频率基因重组并产并产生重组子。生重组子。准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌中。准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌中。2022-8-5142022-8-515二、微生物杂交育种基本程序二、微生物杂交育种基本程序选择原始亲本选择原始亲本诱变筛选直接亲本诱变筛选直接亲本直接亲本之间亲和力鉴定直接亲本之间亲和力鉴定直接亲本杂交直接亲本杂交分离与筛选重组体分离与筛选重组体重组体分析鉴定重组体分析鉴定2022-8-5162022-8-5171.原始亲本菌株的选择原始亲本菌株的选择 原始亲本：微生物杂交育种中具有不同
7、遗传背景的原始亲本：微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质优质出发菌株出发菌株。选择：主要根据选择：主要根据杂交目的杂交目的。选择产量高、代谢快、产孢子能力强、无色素、泡沫少、选择产量高、代谢快、产孢子能力强、无色素、泡沫少、粘性小等发酵性能好的菌株为原始亲本。粘性小等发酵性能好的菌株为原始亲本。它们可以来自生产用菌或诱变过程中的某些符合要求的菌它们可以来自生产用菌或诱变过程中的某些符合要求的菌株，也可以是自然分离的野生型菌株。株，也可以是自然分离的野生型菌株。标记特征：原始亲本还应该具有标记特征：原始亲本还应该具有野生型遗传标记野生型遗传标记，如抗，如抗性标记等性状。性标记等性状。杂交育种中
8、亲本和培养基的选择杂交育种中亲本和培养基的选择2022-8-5182.直接亲本的选择直接亲本的选择 直接亲本：直接亲本：在杂交育种中在杂交育种中由原始亲本经诱变剂处理后选由原始亲本经诱变剂处理后选出出的具营养缺陷型标记或其他遗传标记，又通过亲和力测的具营养缺陷型标记或其他遗传标记，又通过亲和力测定的定的直接用于杂交的菌株直接用于杂交的菌株。要求：要求：a.a.各自的各自的性状优良、突出性状优良、突出，经过重组后产生，经过重组后产生杂种优势杂种优势；b.b.最好采用具有明显遗传性状差异的最好采用具有明显遗传性状差异的近亲菌株近亲菌株为直接亲本。为直接亲本。2022-8-5193.3.培养基培养基
9、 常用的培养基常用的培养基:完全培养基完全培养基(CM)(CM)、基本培养基、基本培养基(MM)(MM)、补充培、补充培养基养基(SM)(SM)和有限培养基和有限培养基(Limited medium(Limited medium，LM)LM)。有限培养基：是专供有限培养基：是专供异核体菌株异核体菌株生长使用的培养基。生长使用的培养基。通通常在基本培养基或蒸馏水中加入适量常在基本培养基或蒸馏水中加入适量(10(10-20-20)的完全培的完全培养基养基，加入的量只限两直接亲本菌株，加入的量只限两直接亲本菌株稍许生长稍许生长，以提供相互，以提供相互接触、吻合的菌丝体需要。加量过多，菌丝体也随之增多
10、，接触、吻合的菌丝体需要。加量过多，菌丝体也随之增多，会影响异核体菌株的检出。会影响异核体菌株的检出。2022-8-520一般杂交亲本用一般杂交亲本用营养缺陷型或抗药性突变型营养缺陷型或抗药性突变型等遗传等遗传标记标记，作为选择重组体的标准和依据。，作为选择重组体的标准和依据。此外，还要利用亲本菌株本身具有的某些特殊遗传此外，还要利用亲本菌株本身具有的某些特殊遗传性状作为性状作为辅助标记辅助标记，如，如温度敏感性、孢子颜色、代温度敏感性、孢子颜色、代谢产物产量高低谢产物产量高低等。等。杂交育种的遗传标记杂交育种的遗传标记2022-8-521（一）常规杂交育种（一）常规杂交育种细菌、放线菌细菌、
11、放线菌:接合接合(conjugation)(conjugation)、转化、转化(transfor-(transfor-mation)mation)、转导、转导(transduction)(transduction)等技术。等技术。真菌真菌:有性生殖、准性生殖有性生殖、准性生殖三、杂交育种方法三、杂交育种方法（二）原生质体融合（二）原生质体融合(protoplast fusion)(protoplast fusion)育种育种 通过酶解破除细胞壁后制备微生物原生质体，然后诱通过酶解破除细胞壁后制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲合力限制，甚至可打导原生质体融合杂交，双亲本
12、不受亲合力限制，甚至可打破种属间遗传障碍，获得远缘杂交重组体，这种特殊的杂破种属间遗传障碍，获得远缘杂交重组体，这种特殊的杂交方式称为原生质体融合育种。交方式称为原生质体融合育种。2022-8-522第二节 常规杂交育种（放线菌杂交育种）2022-8-523放线菌杂交育种放线菌杂交育种 1955 1955年在天蓝色链霉菌中最早发现。年在天蓝色链霉菌中最早发现。放线菌的放线菌的遗传结构与细菌相似遗传结构与细菌相似，所以，所以基因重组过程类似基因重组过程类似于细菌于细菌。通过供体菌向受体菌转移部分染色体，经过遗传物。通过供体菌向受体菌转移部分染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重组。质交换，最终
13、达到基因重组。但放线菌的但放线菌的细胞形态和生长习性与霉菌很相似细胞形态和生长习性与霉菌很相似，具有较，具有较复杂的形态分化，生长过程中产生菌丝体和分生孢子，所以复杂的形态分化，生长过程中产生菌丝体和分生孢子，所以育种操作方法与霉菌基本相同育种操作方法与霉菌基本相同。放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。2022-8-524一、放线菌杂交原理一、放线菌杂交原理2022-8-5251 1接合接合 由两个基因型不同的由两个基因型不同的直接亲本菌丝体混合培养，直接亲本菌丝体混合培养，体细胞间接触和融合，在双方细胞增殖过程中两个体细胞间接触和融合，在双
14、方细胞增殖过程中两个遗传类型不一致的细胞核的遗传类型不一致的细胞核的部分染色体进行转移和部分染色体进行转移和遗传信息交换，形成部分结合子遗传信息交换，形成部分结合子。二、放线菌杂交过程二、放线菌杂交过程2022-8-526 部分结合子部分结合子是由一个是由一个供体供体细胞的部分染色体和一个细胞的部分染色体和一个受体受体细胞整套染色体相结合，同时存在于一个细胞质中。也有时细胞整套染色体相结合，同时存在于一个细胞质中。也有时两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。ab2022-8-5272 2杂合系和重组杂合系形成杂合系和重组杂合系形成部分结合子
15、形成后，在繁殖复制过程中，部分结合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不两种不同基因型的染色体进行一次交换，产生了杂合系，同基因型的染色体进行一次交换，产生了杂合系，交换后的染色体不是封闭的环状结构而是交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状呈线状，并且在染色体末端具有串连的重复体。并且在染色体末端具有串连的重复体。这种重复结构，这种重复结构，有的成为一个二体区，有的是两有的成为一个二体区，有的是两个二体区个二体区。2022-8-528 杂合系和重组杂合系形成杂合系和重组杂合系形成在复制过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，由在复制过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，由于位置不同而成为
16、杂合状态，产生了于位置不同而成为杂合状态，产生了各种不同基因型的重各种不同基因型的重组杂合系组杂合系。2022-8-5293 3重组体重组体以上产生的杂合系或重组杂合系，在以上产生的杂合系或重组杂合系，在以后进一步以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进行几次交换。行几次交换。根据交换的位置不同，所携带的基根据交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不一致，因种类、数量也不一致，形成了一系列基因型的形成了一系列基因型的环状染色体细胞环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类，从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子。型重组分离子。杂合系是形成
17、重组体所必须的阶段。杂合系是形成重组体所必须的阶段。2022-8-530放线菌杂交技术：放线菌杂交技术：混合培养法混合培养法 玻璃纸法玻璃纸法 平板杂交法平板杂交法三、放线菌杂交技术三、放线菌杂交技术2022-8-531混合培养法混合培养法1 准备直接亲本准备直接亲本2斜面混合接种斜面混合接种5 杂合系分析杂合系分析4 检出重组体检出重组体3 制备单孢子悬液制备单孢子悬液2022-8-532P平板杂交法平板杂交法2022-8-533第三节 原生质体融合育种2022-8-534一、原生质体育种与原生质体融合育种一、原生质体育种与原生质体融合育种 19531953年，年，weibullweibul
18、l等首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌细胞获等首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌细胞获得原生质体，并首先提出原生质体概念。得原生质体，并首先提出原生质体概念。19551955年，年，McquillenMcquillen首次发现巨大芽孢杆菌原生质体的再生首次发现巨大芽孢杆菌原生质体的再生方法，使之恢复成正常细胞并能继续生长繁殖。方法，使之恢复成正常细胞并能继续生长繁殖。2020thth 70s 70s以来，各种原生质体操作技术已成为工业微生物育以来，各种原生质体操作技术已成为工业微生物育种的重要手段，并取得了较大成就。种的重要手段，并取得了较大成就。细胞壁被酶水解剥离，剩下由原生质膜包围着的原生质细胞壁被酶
19、水解剥离，剩下由原生质膜包围着的原生质部分成为原生质体。部分成为原生质体。2022-8-535原生质体再生育种原生质体再生育种原生质体诱变育种原生质体诱变育种原生质体转化育种原生质体转化育种原生质体融合育种原生质体融合育种常见原生质体育种方法：常见原生质体育种方法：2022-8-536 原生质体原生质体再生育种是将微生物制备原生质体后再生育种是将微生物制备原生质体后直接再生直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。得到优良性状提高的正变菌株。原生质体再生育种原生质体再生育种不用任何诱变剂处理，而能产生比常规诱变还高的不用任何诱变
20、剂处理，而能产生比常规诱变还高的正变率。正变率。原生质体原生质体再生再生育种育种2022-8-537是以微生物是以微生物原生质体原生质体为育种材料，为育种材料，采用物理或化采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。并从再生菌落中筛选高产突变菌株。19831983年，年，KimKim等首先采用该法诱变玫瑰色小单孢等首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌菌 (Micromonospora rosariaMicromonospora rosaria)取得成功以来，取得成功以来，应用逐渐广泛，已在抗生素、酶制剂、有机酸及应用逐
21、渐广泛，已在抗生素、酶制剂、有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。原生质体原生质体诱变诱变育种育种2022-8-538原生质体原生质体转化转化育种育种 是将是将整条染色体整条染色体DNADNA或片断或片断DNADNA或质粒或质粒DNADNA转化转化原生质体原生质体的技术，转化育种为实现定向育种的目的技术，转化育种为实现定向育种的目标和原生质体育种技术开拓了一个更广阔的领域。标和原生质体育种技术开拓了一个更广阔的领域。一般来说，用染色体一般来说，用染色体DNADNA或其他线状或其他线状DNADNA转化转化原生质体效率较低，而原生质体效率较低，
22、而用质粒用质粒DNADNA能得到高频转化能得到高频转化率率，完整质粒、单链质粒和重组质粒都能成功地，完整质粒、单链质粒和重组质粒都能成功地转化。转化。2022-8-539原生质体原生质体融合融合育种育种 用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成由原生质膜包被的细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞裸细胞，然后用，然后用物理、化学或生物学方法，诱导物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的遗传特性不同的两亲本两亲本原生质体融合原生质体融合，经染色体交换、重组而达经染色体交换、重组而达到杂交的目的到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一，经筛选获得集双亲优良性
23、状于一体的体的稳定融合子稳定融合子。近年来，该技术已成为生物界颇受瞩目的研近年来，该技术已成为生物界颇受瞩目的研究领域，是细胞生物学中迅速发展的方向之一。究领域，是细胞生物学中迅速发展的方向之一。2022-8-540研究表明，由研究表明，由聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)诱导诱导的原生质体的原生质体融合是微生物获得高频重组的主要方法，融合是微生物获得高频重组的主要方法，种内种内的融合频率可高达的融合频率可高达2727，种间的融合频率也可，种间的融合频率也可达达1010，比常规的杂交重组频率提高数千倍以，比常规的杂交重组频率提高数千倍以上。上。最近出现的最近出现的电场诱导融合电场诱导融合又将
24、融合率提高又将融合率提高1010倍。倍。2022-8-541原生质体融合育种的优缺点：原生质体融合育种的优缺点：第一，第一，大幅度提高亲本之间大幅度提高亲本之间重组频率重组频率。不少链霉菌通过原生质体融合，其后代的不少链霉菌通过原生质体融合，其后代的重组率重组率达达1 1左右，比准性重组率高左右，比准性重组率高20202000020000倍。倍。如果如果融合前结合紫外线处理，重组频率可达融合前结合紫外线处理，重组频率可达20203030。2022-8-542第二，第二，扩大重组的亲本范围扩大重组的亲本范围。常规杂交的亲本间必须具有感受态，有常规杂交的亲本间必须具有感受态，有些菌株由于其表面结构
25、缘故而无法用常规方些菌株由于其表面结构缘故而无法用常规方法进行杂交重组。法进行杂交重组。原生质体由于完全或部分去除了细胞壁，原生质体由于完全或部分去除了细胞壁，因此，实现常规杂交无法做到的种间、属间、因此，实现常规杂交无法做到的种间、属间、门间等门间等远缘杂交远缘杂交。2022-8-543第三，原生质体融合时亲本第三，原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组较多，集中双亲本优良性状遗传物质转移和重组较多，集中双亲本优良性状机会更大机会更大。第四，与常规诱变育种途径相比，还具有第四，与常规诱变育种途径相比，还具有定向育定向育种种的特点。的特点。2022-8-5
26、44不足之处：不足之处：原生质体融合后原生质体融合后DNADNA交换和重组随机发生，增加重交换和重组随机发生，增加重组体分离筛选的难度。组体分离筛选的难度。细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频率，使率，使远缘融合杂交远缘融合杂交存在较大困难。存在较大困难。2022-8-545原理：原生质体融合本质是二亲本菌株原理：原生质体融合本质是二亲本菌株去除细胞壁后去除细胞壁后的的一种一种体细胞杂交育种体细胞杂交育种方法。方法。两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的
27、水解酶去除细两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶去除细胞壁后，在促融剂诱导作用下，两个裸露的原生质体接胞壁后，在促融剂诱导作用下，两个裸露的原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组目的，最后对重组体进行生产性能、生理生化和因重组目的，最后对重组体进行生产性能、生理生化和遗传特性分析。遗传特性分析。二、原生质体融合育种的原理二、原生质体融合育种的原理 2022-8-546三、原生质体融合育种的步骤三、原生质体融合育种的步骤一
28、）直接亲本及其遗传标记选择一）直接亲本及其遗传标记选择二）双亲本原生质体制备与再生二）双亲本原生质体制备与再生三）亲本原生质体诱导融合三）亲本原生质体诱导融合四）融合重组体四）融合重组体(称为融合子称为融合子)分离分离五）遗传特性分析与测定五）遗传特性分析与测定六）生产性能筛选六）生产性能筛选2022-8-547一）直接亲本及其遗传标记的选择一）直接亲本及其遗传标记的选择 从育种角度，一般把诱变系谱中筛选获得的从育种角度，一般把诱变系谱中筛选获得的不同不同“正正突变株突变株”作为直接亲本作为直接亲本进行融合，通过交换、重组，进行融合，通过交换、重组，使优良性状集中于重组体中，以加快育种速度。使
29、优良性状集中于重组体中，以加快育种速度。现在一般认为原生质体融合的亲本应采用现在一般认为原生质体融合的亲本应采用具有较大遗具有较大遗传差异的近亲菌株传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种，重组后的新个体具有更大的杂种优势。优势。2022-8-548遗传标记除常用的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热遗传标记除常用的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热致死致死(灭活灭活)、孢子颜色和菌落形态等作为标记。、孢子颜色和菌落形态等作为标记。1.1.如果目的是为了进行如果目的是为了进行遗传分析遗传分析，应该采用，应该采用带隐性基因带隐性基因的营养缺陷型菌株或抗性菌株的营养缺陷型菌株或抗性菌株。2.2
30、.如果从如果从育种角度育种角度进行原生质体融合，由于多数营养缺进行原生质体融合，由于多数营养缺陷型菌株都会影响代谢产物的产量陷型菌株都会影响代谢产物的产量(尤其对一些抗生素产尤其对一些抗生素产生菌生菌)，选择营养标记时，选择营养标记时，应尽量避免采用对正常代谢有应尽量避免采用对正常代谢有影响的营养缺陷型。影响的营养缺陷型。2022-8-5493.3.采用采用灭活标记灭活标记。把双亲中任何。把双亲中任何一方一方的原生质体用的原生质体用热热灭活灭活(如如50 2h 50 2h 或或60 5min)60 5min)或用紫外线、药物灭活或用紫外线、药物灭活，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化，然后和另一方
31、具使细胞内的某些酶或代谢途径钝化，然后和另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。前者为供有正常活性的原生质体融合而获得重组体。前者为供体，后者为受体，这样可以省去营养缺陷型的遗传标体，后者为受体，这样可以省去营养缺陷型的遗传标记。记。采用灭活标记融合频率较低，但重组体产量较高。采用灭活标记融合频率较低，但重组体产量较高。2022-8-550二）原生质体制备与再生二）原生质体制备与再生 1 1 原生质体制备原生质体制备 活性原生质体制备过程活性原生质体制备过程包括原生质体的分离、收集、包括原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤纯化、活性鉴定和保存等操作步骤。细胞去壁后，原生质
32、体从中释放出来，此过程为原生细胞去壁后，原生质体从中释放出来，此过程为原生质体分离。质体分离。去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法。去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法。2022-8-551酶法分离原生质体：酶法分离原生质体：首先选择原始亲株，经过遗传标记首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸法或摇瓶筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸法或摇瓶振荡法培养，振荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下酶解细胞壁关水解酶，在一定条件下酶解细胞壁。注意：不同的微生物选择不同的酶。注意：不同的
33、微生物选择不同的酶。细菌、放线菌：溶菌酶细菌、放线菌：溶菌酶真菌：蜗牛酶、纤维素酶、葡聚糖酶真菌：蜗牛酶、纤维素酶、葡聚糖酶2022-8-552酶法分离原生质体的影响因素酶法分离原生质体的影响因素(1)培养基组成培养基组成(2)菌体培养方式菌体培养方式(3)菌体菌龄菌体菌龄(4)稳定剂稳定剂(5)酶解前的预处理酶解前的预处理(6)酶系和酶的浓度酶系和酶的浓度(7)酶的作用温度和作用酶的作用温度和作用pH值值(8)菌体密度菌体密度(9)酶解方式酶解方式 2022-8-5532原生质体的观察原生质体的观察 水解酶作用于菌体后，必须定时取样水解酶作用于菌体后，必须定时取样观察原生质体观察原生质体分离
34、的程度，以确定酶解终点分离的程度，以确定酶解终点。(1)(1)低渗爆破法：低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体在低渗溶直接在显微镜下观察原生质体在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。液中吸水膨胀、破裂的过程。细胞壁去除完全的原生质体吸水破裂后细胞细胞壁去除完全的原生质体吸水破裂后细胞彻底解体，没彻底解体，没有残骸有残骸；如果原生质体破壁不完全，还有部分剩余细胞壁，；如果原生质体破壁不完全，还有部分剩余细胞壁，则原生质体从无细胞壁处吸水，膨胀破裂并留下一个则原生质体从无细胞壁处吸水，膨胀破裂并留下一个残存残存的细胞形态的细胞形态；对于那些正常细胞或酶解程度不彻底的细胞，；对于那些正常细胞或酶解程度
35、不彻底的细胞，吸水后由于细胞壁的保护作用，不会胀裂，能维持吸水后由于细胞壁的保护作用，不会胀裂，能维持正常形正常形态态。2022-8-554(2)(2)荧光染色法：原生质体混悬液用荧光染色法：原生质体混悬液用0.050.050.10.1的荧的荧光增白剂光增白剂(VBL)(VBL)染色染色，离心弃染料、洗涤后在荧光显微镜，离心弃染料、洗涤后在荧光显微镜下观察下观察(波长用波长用360360440nm)440nm)，如发出红色光则为完全原如发出红色光则为完全原生质体生质体，如发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在如发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。2022-8-5553原生质体的收集和纯化原生质体的
36、收集和纯化(1)(1)过滤法：过滤法：适用于丝状微生物适用于丝状微生物(如放线菌、霉菌及丝状如放线菌、霉菌及丝状微藻等微藻等)，根据细胞大小，选用，根据细胞大小，选用孔径略小于细胞的砂芯孔径略小于细胞的砂芯漏斗，过滤漏斗，过滤。原生质体由于外层细胞膜柔软可变形，可。原生质体由于外层细胞膜柔软可变形，可以由比它小的微孔中穿过，而未酶解细胞或细胞团却不以由比它小的微孔中穿过，而未酶解细胞或细胞团却不能，由此原生质体和正常细胞分离而得到纯化。对一些能，由此原生质体和正常细胞分离而得到纯化。对一些细胞较大的微生物细胞较大的微生物(如微藻如微藻)，也可采用，也可采用微孔径网筛微孔径网筛来过来过滤原生质体
37、。滤原生质体。2022-8-556(4)(4)漂浮法：漂浮法：适用于一些细胞较大的微生物，原生质体适用于一些细胞较大的微生物，原生质体的比重小于细胞，能在一定渗透浓度的溶液中漂浮在的比重小于细胞，能在一定渗透浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。液面上，从而得到纯化。(3)(3)界面法：界面法：将原生质体分离液置于两种液体的混悬液中，将原生质体分离液置于两种液体的混悬液中，这这两种液体密度有区别两种液体密度有区别，上层密度小于下层密度，离心，上层密度小于下层密度，离心后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。(2)(2)密度梯度离心法：密度梯度离
38、心法：用蔗糖或氯化铯等制成浓度梯度用蔗糖或氯化铯等制成浓度梯度溶液，由于密度差别，经离心后原生质体漂浮于上部，溶液，由于密度差别，经离心后原生质体漂浮于上部，未酶解细胞和细胞碎片沉于溶液下部。未酶解细胞和细胞碎片沉于溶液下部。2022-8-5574原生质体的活力鉴定原生质体的活力鉴定 染色鉴定法：染色鉴定法：荧光素双醋酸酯荧光素双醋酸酯(FDA)染色法染色法，FDA本身不发荧光，本身不发荧光，被细胞被细胞吸收酯解后产生具有荧光的极性物质吸收酯解后产生具有荧光的极性物质。荧光物质不能透过质。荧光物质不能透过质膜，存在于活细胞内，这样就可通过观察原生质体是否发生膜，存在于活细胞内，这样就可通过观察
39、原生质体是否发生荧光来判断其活性有无，荧光来判断其活性有无，能发出荧光的原生质体具有活性能发出荧光的原生质体具有活性。2022-8-5585 原生质体的保存原生质体的保存 低温下保存：低温下保存：在在一般冷藏一般冷藏条件下保存时间很短，有些种类条件下保存时间很短，有些种类几小时几小时就失活。就失活。在在液氮液氮中超低温状态下保存时间可长些。方法是加中超低温状态下保存时间可长些。方法是加入入5的二甲亚砜的二甲亚砜(DMS)或甘油等或甘油等其他保护剂，迅速其他保护剂，迅速降温保藏。降温保藏。2022-8-5596 原生质体再生原生质体再生 原生质体具有细胞全能性，但本身不能立即进行分裂、增殖，原生
40、质体具有细胞全能性，但本身不能立即进行分裂、增殖，必须首先重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能必须首先重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能进一步生长、分裂和增殖，这就是原生质体的再生。进一步生长、分裂和增殖，这就是原生质体的再生。（1）原生质体再生的过程）原生质体再生的过程 大分子合成与原生质体生长大分子合成与原生质体生长，这一时期原生质体主要是合，这一时期原生质体主要是合成细胞器成分，表现为成细胞器成分，表现为原生质体的体积增大原生质体的体积增大；细胞壁合成与再生细胞壁合成与再生，此时期主要合成细胞壁物质，组装、，此时期主要合成细胞壁物质，组装、恢复成完整细胞恢复成完整细胞；
41、分裂能力恢复分裂能力恢复并开始分裂繁殖成为并开始分裂繁殖成为正常的细胞形态和菌落正常的细胞形态和菌落。2022-8-560（2）原生质体再生的影响因素原生质体再生的影响因素 菌体生理状态菌体生理状态稳定剂稳定剂 细菌、放线菌和酵母菌多用细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统糖醇系统的稳定的稳定液，如放线菌常用液，如放线菌常用1015蔗糖溶液；霉菌常蔗糖溶液；霉菌常用用盐溶液系统盐溶液系统，如，如NaCl、KCl、MgSO4等组成的等组成的稳定液，浓度为稳定液，浓度为0.3-1.0mo1/L；酶浓度和酶作用时间酶浓度和酶作用时间2022-8-561再生培养基组成再生培养基组成残存菌体的分离残存菌体的分
42、离原生质体密度原生质体密度排除再生培养基上的冷凝水排除再生培养基上的冷凝水2022-8-562（3）再生方法）再生方法一般采用双层平板法：其下层为再生培养基，琼一般采用双层平板法：其下层为再生培养基，琼脂含量约脂含量约2，制成平板后除去冷凝水，制成平板后除去冷凝水，取原生质取原生质体悬浮液体悬浮液0.1ml加到平板上，加到平板上，然后上层加入含然后上层加入含0.8琼脂或琼脂或0.4琼脂糖的半固体同一成分的培养基琼脂糖的半固体同一成分的培养基3-10 ml，迅速摊布均匀，迅速摊布均匀，使原生质体植于固体培养使原生质体植于固体培养基中，有利于再生。基中，有利于再生。2022-8-563（4）再生率
43、）再生率 通过再生率测定，可以检验并进一步找出最佳的原生通过再生率测定，可以检验并进一步找出最佳的原生质体制备和再生条件及再生培养基。质体制备和再生条件及再生培养基。再生频率再生频率()(再生培养基上总菌落数再生培养基上总菌落数-酶处理后未原生质酶处理后未原生质体化菌落数体化菌落数)/)/原生质体总数原生质体总数100100(C-B)/(A-B)(C-B)/(A-B)100100。式中，式中，A A：总菌落数，未经酶处理的菌悬液涂布于平板生长的：总菌落数，未经酶处理的菌悬液涂布于平板生长的菌落。菌落。B B：未原生质体化细胞，酶解混合液加蒸馏水破坏原生：未原生质体化细胞，酶解混合液加蒸馏水破坏
44、原生质体，涂布平板后生长的菌落。质体，涂布平板后生长的菌落。C C：再生菌落数，酶解混合液加高渗溶液，涂布于再生：再生菌落数，酶解混合液加高渗溶液，涂布于再生培养基上生长的菌落。培养基上生长的菌落。2022-8-564三）原生质体融合三）原生质体融合 原生质体融合过程（以霉菌为例）原生质体融合过程（以霉菌为例）两亲株原生质体两亲株原生质体混合混合于高渗透压的稳定液中，在于高渗透压的稳定液中，在PEG的诱导下，两个或两个以上的诱导下，两个或两个以上凝聚凝聚成团，相邻原生质体紧成团，相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失质膜消失，细胞，细胞质融质融合合，
45、形成一个异核体细胞，异核体的细胞在繁殖过程中，形成一个异核体细胞，异核体的细胞在繁殖过程中发生发生核融合核融合，形成杂合二倍体，通过，形成杂合二倍体，通过染色体交换染色体交换，产生，产生各种重组体，称各种重组体，称融合子融合子(fusant)。2022-8-565原生质体融合的影响因素原生质体融合的影响因素 现在普遍采用的融合手段是现在普遍采用的融合手段是PEG介导介导的化学融合法。的化学融合法。有学者研究认为有学者研究认为低浓度低浓度PEG有稳定原生质体和促进核分有稳定原生质体和促进核分裂作用，也有利于细胞壁的形成和再生裂作用，也有利于细胞壁的形成和再生。（1）融合剂）融合剂化学融合剂化学融
46、合剂2022-8-566促融机制：促融机制：PEG本身是一种特殊的脱水剂，它以本身是一种特殊的脱水剂，它以分子桥分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用，进而改变质膜的形式在相邻原生质体膜间起中介作用，进而改变质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的镶嵌蛋白流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的镶嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白颗粒的磷酯双易于融合的无蛋白颗粒的磷酯双分子层区分子层区。在在Ca2存在下，引起存在下，引起细胞膜表面的电子分布的改变细胞膜表面的电子分布的改变，从，从而使接触点的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生而使接触点的质膜形成局部融合，出现
47、凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体全部融合。全部融合。2022-8-567PEG相对分子量：相对分子量：真菌一般采用真菌一般采用40006000，放线菌常用放线菌常用10001500，细菌用细菌用15006000。PEG常用浓度：常用浓度：3050真菌在真菌在30左右效果较好，低于左右效果较好，低于20失去稳定性，导致失去稳定性，导致原生质体破裂，高于原生质体破裂，高于30会引起原生质体皱缩，过高还会引起原生质体皱缩，过高还会产生中毒现象。会产生中毒现象。2022-8-568物理融合剂物理融合剂电场电场 电融合：主要分
48、为两个阶段：电融合：主要分为两个阶段：在交流在交流(AC)电场作用下电场作用下，细胞受到电介质电泳力，细胞受到电介质电泳力F的作的作用，根据电泳现象，原生质体向电极的方向泳动。与此同用，根据电泳现象，原生质体向电极的方向泳动。与此同时，细胞内产生偶极化，促使时，细胞内产生偶极化，促使原生质体相互粘连原生质体相互粘连，并使细，并使细胞沿电力线方向排列成串，待融合细胞之间形成紧密接触；胞沿电力线方向排列成串，待融合细胞之间形成紧密接触；在外加瞬间高频在外加瞬间高频直流强电压直流强电压作用下，以作用下，以50 s的时程脉冲的时程脉冲冲击原生质体粘连点，冲击原生质体粘连点，扰乱原生质体膜的分子排列，使
49、之扰乱原生质体膜的分子排列，使之穿孔穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，相连接的原生质体，然后发生原生质体膜复原过程，相连接的原生质体发生融合。发生融合。2022-8-569 温度和时间温度和时间丝状真菌适宜融合的温度约为丝状真菌适宜融合的温度约为30；放线菌通常在常温放线菌通常在常温(约约20)下进行融合。下进行融合。细菌原生质体融合的适温往往偏低，据认为细菌原生质体融合的适温往往偏低，据认为4或或20比比37更好。更好。总的来说在总的来说在2030下进行融合效果较理想。下进行融合效果较理想。融合处理时间从融合处理时间从l min到到1h，但绝大多数微生物在，但绝大多数微生物在110min，处
50、理时间过长，原生质体因脱水而失活，时间，处理时间过长，原生质体因脱水而失活，时间过短则融合率低。过短则融合率低。2022-8-570 亲株的亲和力和原生质体的活性亲株的亲和力和原生质体的活性 亲合力是指双亲亲缘关系，最好是亲缘关系近些，亲合力是指双亲亲缘关系，最好是亲缘关系近些，远缘融合染色体交换后重组体不稳定，易分离，影响远缘融合染色体交换后重组体不稳定，易分离，影响融合效果。融合效果。2022-8-571 无机离子无机离子 在在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和和Mg2+，能更有效地促进融合。通常所用浓度为能更有效地促进融合。通常所用浓度为CaCl
