1、生物学综合实验生物学综合实验 -细胞生物学部分细胞生物学部分张丽君基本目的基本目的v了解细胞培养的常规知识和无菌操作的基本原则了解细胞培养的常规知识和无菌操作的基本原则,v掌握贴壁细胞复苏、传代和冻存的方法；掌握贴壁细胞复苏、传代和冻存的方法；v了解外源了解外源 DNA导入哺乳动物细胞的实验原理导入哺乳动物细胞的实验原理,掌掌握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法。握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法。v加深对课堂学习知识的理解和印象，为进一步从加深对课堂学习知识的理解和印象，为进一步从事与本学科有关的科学研究打基础。事与本学科有关的科学研究打基础。实验内容：v实验一实验一 细胞复苏细胞复苏 v
2、实验二实验二 细胞的传代培养细胞的传代培养v实验三实验三 磷酸钙介导的外源基因导入哺乳动物细磷酸钙介导的外源基因导入哺乳动物细胞胞v实验四实验四 实验结果观察检测实验结果观察检测 v实验五实验五 细胞冻存细胞冻存 时间安排：v第一天第一天 细胞复苏。细胞复苏。v第二天第二天 观察细胞状态，包括成活情况和生长状况，观察细胞状态，包括成活情况和生长状况，决定是否给细胞换液。决定是否给细胞换液。v第三天第三天 细胞传代。细胞传代。v第四天第四天 用磷酸钙法将外源基因用磷酸钙法将外源基因GFP(TNFR)导入哺导入哺乳动物细胞。乳动物细胞。v第五天第五天 观察检测实验结果。冻存细胞。观察检测实验结果。
3、冻存细胞。1细胞培养概述细胞培养概述 体外培养体外培养器官培养器官培养 organ culture组织培养组织培养 tissue culture细胞培养细胞培养 cell culture 取自体内取自体内,模拟体内生模拟体内生理环境，在无菌、适当温度理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下生存和生和一定营养条件下生存和生长并维持其结构和功能。长并维持其结构和功能。基本概念基本概念v细胞系（细胞系（Cell line）：原代培养物经首次传）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。代成功后即为细胞系。v细胞株（细胞株（Cell strain）：通过选择法或克隆）：通过选择法或克隆法从原代培养物或细
4、胞系中获得的具有特殊法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。性质或标志的培养物称细胞株。v有限细胞系有限细胞系（finite cell line）：细胞系形成）：细胞系形成后仅能维持有限传代次数，最后死亡。后仅能维持有限传代次数，最后死亡。v连续或无限细胞系（连续或无限细胞系（continuous cell line or infinite cell line）：具有无限繁殖能力（获）：具有无限繁殖能力（获得不死性）和能反复进行传代的细胞系得不死性）和能反复进行传代的细胞系。细胞培养的细胞培养的优点：优点：1.可长时间监控、检测，定量评估一部分可长时间监控、检测，定量
5、评估一部分活细胞的情况。活细胞的情况。2.研究条件可人为的控制。研究条件可人为的控制。3.研究的样本可以达到比较均一性。研究的样本可以达到比较均一性。4.研究的内容便于观察、检测和记录。研究的内容便于观察、检测和记录。5.研究的范围比较广泛。研究的范围比较广泛。6.研究的费用相对较经济。研究的费用相对较经济。细胞培养的细胞培养的缺点：缺点：v生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，但仍有很大差异。环境，但仍有很大差异。细胞生存环境、条件和代谢细胞生存环境、条件和代谢环境：环境：v首要条件：培养环境无毒和无菌首要条件：培养环境无毒和无菌v基本条件：生存环境无
6、任何污染、代谢物及时清除。基本条件：生存环境无任何污染、代谢物及时清除。温度：温度：v人哺乳动物为人哺乳动物为3737 ，鸟类为鸟类为38.5。10 20 30 40 50最适温度最适温度最适温度最适温度温度对细胞生长的影响温度对细胞生长的影响温度对细胞生长的影响温度对细胞生长的影响细胞增殖数细胞增殖数温度温度气体：氧气和二氧化碳气体：氧气和二氧化碳v95空气空气+5二氧化碳二氧化碳vO2：氧气参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生：氧气参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。长、增殖和合成各种所需成分。vCO2：主要作用在于能维持培养基的主要作用在于能维持培养基的pH值。值
7、。vpH：大多数细胞的适宜：大多数细胞的适宜pH7.27.4，加缓冲剂来，加缓冲剂来维持培养液维持培养液pH的恒定。的恒定。细胞类型细胞类型和生长方式和生长方式贴壁细胞和悬浮细胞：贴壁细胞和悬浮细胞：根据是否附于支持物上生长的特性划分。根据是否附于支持物上生长的特性划分。贴壁细胞传代需要用胰酶处理。贴壁细胞传代需要用胰酶处理。细胞生长与增殖细胞生长与增殖传代传代(passage或或subculture)当培养细胞增殖到一定密度后，分离出一部当培养细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称之为过程称之为“传代传代”。
8、培养细胞的形态学方面检测培养细胞的形态学方面检测肉眼观察培养基的颜色变化肉眼观察培养基的颜色变化v桃红色：正常情况桃红色：正常情况v橙黄色橙黄色:细胞生长状态良好细胞生长状态良好v淡黄色淡黄色:培养时间过长培养时间过长,营养不足营养不足,死亡细胞过多死亡细胞过多v紫红色紫红色:细胞没有生长、生长状态不好、或已死细胞没有生长、生长状态不好、或已死亡亡相差显微镜观察活细胞相差显微镜观察活细胞v细胞生长状态良好：透明度大，细胞内颗粒少，没细胞生长状态良好：透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡，胞膜清晰。培养上清清澈透明，看不到悬有空泡，胞膜清晰。培养上清清澈透明，看不到悬浮的细胞或碎片。浮的细胞或碎片。
9、v细胞生长状态不良：胞质中常出现空泡、脂滴和颗细胞生长状态不良：胞质中常出现空泡、脂滴和颗粒物质，细胞形态可变得不规则，甚至失去原来特粒物质，细胞形态可变得不规则，甚至失去原来特点。点。细胞的储存细胞的储存v低温保护剂：低温保护剂：甘油和二甲亚砜甘油和二甲亚砜(DMSO)，常用浓度为，常用浓度为5-20。v 补加血清：补加血清：在冻存液中，另补加在冻存液中，另补加10-20左右的血清。左右的血清。v冻藏温度：冻藏温度：液氮罐，液氮液氮罐，液氮-196，可长期保存。，可长期保存。-80 低温冰箱，可保存一年或更长时间。低温冰箱，可保存一年或更长时间。培养细胞的运输培养细胞的运输v冷冻储存运输：冷
10、冻储存运输：液氮或干冰。液氮或干冰。v细胞悬液空运：冰盒。细胞悬液空运：冰盒。v充液法充液法长距离运输长距离运输(几天几天)：培养液至瓶颈部，放在携带者贴身口袋。培养液至瓶颈部，放在携带者贴身口袋。短距离运输短距离运输(几小时几小时)：培养液覆盖单层细胞，细胞面朝上带回。培养液覆盖单层细胞，细胞面朝上带回。细胞库及网址细胞库及网址中国科学院细胞库中国科学院细胞库/中国科学院上海生命科学研中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心究院细胞资源中心http:/ Type Culture Collection 网站网站 无菌操作技术无菌操作技术（一）实验前的准备（一）实验前的准备v根据实验的要求，将所
11、需物品及试剂灭菌消根据实验的要求，将所需物品及试剂灭菌消毒。毒。v清点所需用品，一并放人超净台内；清点所需用品，一并放人超净台内；（二）无菌室和操作野消毒（二）无菌室和操作野消毒 v实验前，将实验器材放人超净台内，实验前，将实验器材放人超净台内，v打开超净台紫外线灭菌灯，照射打开超净台紫外线灭菌灯，照射30分钟，分钟，v关闭紫外线灯，同时起动超净台风机关闭紫外线灯，同时起动超净台风机（三）无菌操作基本要求（三）无菌操作基本要求洗手、着装与外科临床要求相同；洗手、着装与外科临床要求相同；手指不能触及器材使用端手指不能触及器材使用端；一切操作都要在火焰周围进行，一切操作都要在火焰周围进行，瓶口要顺
12、风斜放在支架上，试剂使用后立即封闭瓶口；瓶口要顺风斜放在支架上，试剂使用后立即封闭瓶口；细胞培养各用液要专管专用，并要勤换吸管细胞培养各用液要专管专用，并要勤换吸管 瓶口液滴不能再进入瓶内；瓶口液滴不能再进入瓶内；动作要准确敏捷，尽量避免空气流动；动作要准确敏捷，尽量避免空气流动；在实验过程中，不要面向操作野讲话或咳嗽。在实验过程中，不要面向操作野讲话或咳嗽。（四）实验后的要求（四）实验后的要求v关闭超净台风机和电源；关闭超净台风机和电源；v用过的玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳用过的玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳成束分类归放；成束分类归放；v最后用酒精纱布或棉球擦拭工作台面。最
13、后用酒精纱布或棉球擦拭工作台面。v第一天 细胞复苏 v第二天 观察细胞状态，决定是否给细胞换液。v第三天 细胞传代v第四天 用 磷酸钙法将外源基因GFP，TNFR）导入哺乳动物细胞v第五天 观察检测实验结果。v第六天 细胞冻存细胞复苏细胞复苏 快速融化快速融化v将细胞投入到将细胞投入到3737 C C水浴，使其水浴，使其快速融化。快速融化。v细胞外结晶在很短时间内即融化，能避免由细胞外结晶在很短时间内即融化，能避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内再结晶对细胞于缓慢融化使水分渗入细胞内再结晶对细胞造成损害。造成损害。实验材料及仪器实验材料及仪器一材料：一材料：人胚肾细胞系人胚肾细胞系293 细胞营养
14、液（细胞营养液（DMEM液体培养基液体培养基,10胎牛血清胎牛血清,双抗双抗100单位单位/ml）消化液（消化液（0.05胰酶，胰酶，0.53mM EDTANa）Hanks液液 细胞培养皿细胞培养皿 50ml、15ml一次性离心管一次性离心管 10ml玻璃吸管（灭菌）玻璃吸管（灭菌）与玻璃吸管配套的吸球及胶管与玻璃吸管配套的吸球及胶管二仪器：二仪器：二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱 倒置显微镜倒置显微镜 v方法：将冻结细胞瓶从液氮中取出，立即投方法：将冻结细胞瓶从液氮中取出，立即投入入3738水浴中融化。离心，去上清，用水浴中融化。离心，去上清，用新的培养基悬浮细胞，移至细胞培养皿中，新的培养基悬
15、浮细胞，移至细胞培养皿中，放入二氧化碳培养箱放入二氧化碳培养箱37 培养。培养。v第二天观察细胞状态，包括成活情况和生长状况，第二天观察细胞状态，包括成活情况和生长状况，决定是否给细胞换液。决定是否给细胞换液。v第三天第三天 细胞传代细胞传代倒去培养液，用倒去培养液，用HankS液洗一次，加入液洗一次，加入0.5ml胰酶，胰酶，37 消化消化5min。加培养基将细胞吹散，传至两个。加培养基将细胞吹散，传至两个6cm的的dish中，培养箱中培养。中，培养箱中培养。v第四天第四天 观察细胞生长状态和铺展情况，用观察细胞生长状态和铺展情况，用 磷酸钙磷酸钙法将外源基因法将外源基因GFP，TNFR）导
16、入哺乳动物细胞。）导入哺乳动物细胞。v第五天第五天 观察检测实验结果。冻存细胞。观察检测实验结果。冻存细胞。磷酸钙介导的外源基因的导入磷酸钙介导的外源基因的导入实验目的实验目的 掌握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法掌握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法实验原理实验原理 造成一种使造成一种使DNA附着细胞表面的化学环境，附着细胞表面的化学环境，DNA即被内吞而进入细胞。即被内吞而进入细胞。磷酸钙转染法特点：经济、简便、快速。特点：经济、简便、快速。转化效率：转化效率：10-20，因细胞型别而不同。，因细胞型别而不同。应用：应用：稳定转化细胞以及瞬时表达克隆化稳定转化细胞以及瞬时表达克隆化DNA
17、。在大量细胞中瞬时表达外源在大量细胞中瞬时表达外源DNA时首选。时首选。磷酸钙转染法（续）v磷酸钙介导的转染方法的几种变通方案：磷酸钙介导的转染方法的几种变通方案：将将DNA导入贴壁细胞；导入贴壁细胞；将将DNA导入用胰蛋白酶从器壁上消化下来的贴导入用胰蛋白酶从器壁上消化下来的贴壁细胞；壁细胞；将将DNA导人非贴壁细胞。导人非贴壁细胞。化学方法：磷酸钙转染法、利用化学方法：磷酸钙转染法、利用DEAE-葡聚糖转葡聚糖转染法、脂质体介导的转染法染法、脂质体介导的转染法;物理方法：电穿孔转染法、细胞核的直接微注射物理方法：电穿孔转染法、细胞核的直接微注射法、基因枪粒子轰击法法、基因枪粒子轰击法;生物
18、学方法：病毒载体介导的基因转移生物学方法：病毒载体介导的基因转移.脂质体介导的转染法原理：原理：v用脂质体将用脂质体将DNA包裹，然后通过与细胞膜融包裹，然后通过与细胞膜融合而导入细胞。合而导入细胞。特点：特点：v转染率高，重复性好。转染率高，重复性好。电穿孔法DNA转染原理：原理：v利用脉冲电场将利用脉冲电场将DNA导人培养细胞的方法称。导人培养细胞的方法称。特点：特点：v效率极高，方法简便；效率极高，方法简便；v可用于瞬时表达又可用于稳定转化；可用于瞬时表达又可用于稳定转化；v受受DNA的浓度影响小；的浓度影响小；v适用于其他技术不能奏效的细胞系适用于其他技术不能奏效的细胞系 实验材料及仪
19、器实验材料及仪器TNF-R1,pEGFP(绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白),pGFP-Tub 哺哺乳动物细胞表达质粒乳动物细胞表达质粒2HBS液（液（280 mM NaCl,10 mM KCl,1.5mM NaHPO42H2O,12mM葡萄糖，葡萄糖，50mM Hepes，pH7.05,0.2过滤除菌）过滤除菌）CaCl2（2.5M，0.2过滤除菌）溶液过滤除菌）溶液超纯水（灭菌）超纯水（灭菌）1.5ml离心管（灭菌）离心管（灭菌）20l，200l，1ml微量移液器微量移液器 实验步骤1.1.观察昨日传代培养的观察昨日传代培养的293293细胞培养液颜色的变化，显细胞培养液颜色的变化，显微镜观察细胞
20、的生长状态和生长密度，以及细胞是微镜观察细胞的生长状态和生长密度，以及细胞是否污染。否污染。2.2.转染转染TNF-RTNF-R和和GFPGFP哺乳动物细胞表达载体。哺乳动物细胞表达载体。用微量移液器在用微量移液器在1.5ml1.5ml离心管中依次加入离心管中依次加入4l4l（1g 1g/l/l）质粒）质粒DNADNA，175l175l超纯水，超纯水，20l CaCl2(2.5M)20l CaCl2(2.5M)溶溶液，混匀。液，混匀。在在1.5ml1.5ml离心管中加入离心管中加入200l 2200l 2HBSHBS，将，将A A液分三次缓慢液分三次缓慢加入，每次加入加入，每次加入A A液后用
21、吹气泡的方法混匀。室温静置液后用吹气泡的方法混匀。室温静置2 2分钟。分钟。将将A A，B B混合液均匀地滴加在待转染的混合液均匀地滴加在待转染的293293细胞培养液中，细胞培养液中，轻轻晃动使混匀。将培养皿置于轻轻晃动使混匀。将培养皿置于3737C C二氧化碳培养箱中。二氧化碳培养箱中。结果观察1.观察转染观察转染TNFR的实验组细胞与对照组（可用转的实验组细胞与对照组（可用转染染pEGFP的做对照）的细胞状态差异，估计实验的做对照）的细胞状态差异，估计实验组细胞凋亡的比例。组细胞凋亡的比例。2.用荧光显微镜观察转染用荧光显微镜观察转染pEGFP的培养皿中绿色细的培养皿中绿色细胞所占总细胞
22、的百分比，估算转染效率。胞所占总细胞的百分比，估算转染效率。细胞凋亡的概念、特征及生理意义细胞凋亡的概念、特征及生理意义细胞凋亡的信号途径细胞凋亡的信号途径 死亡受体（TNFR1）介导的细胞凋亡信号途径 细胞凋亡形态学检测方法1 光学显微镜和倒置显微镜光学显微镜和倒置显微镜凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。圆、脱落。2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判
23、细胞凋一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。亡的进展情况。常用的常用的DNA特异性染料有：特异性染料有：Hoechst，DAPI。紫外光。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。激发时发射明亮的蓝色荧光。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：分为三期：期的细胞核呈波纹状（期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，期的细胞核裂解为碎块
24、，产生凋亡小体产生凋亡小体。3 透射电子显微镜观察透射电子显微镜观察 磷脂酰丝氨酸外翻分析（磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）法）磷脂酰丝氨酸（磷脂酰丝氨酸（PhosphatidylserinePhosphatidylserine,PS,PS）正常位于）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PSPS可从细胞膜的内可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图图3)3)。AnnexinAnnexin-V-V是一种分子量为是一种分子量为353536KD36KD的的Ca2+Ca2+依赖性磷依赖性磷脂结
25、合蛋白，能与脂结合蛋白，能与PSPS高亲和力特异性结合。将高亲和力特异性结合。将AnnexinAnnexin-V-V进行荧光素（进行荧光素（FITCFITC、PEPE）或）或biotinbiotin标记，以标记了的标记，以标记了的AnnexinAnnexin-V-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶碘化丙啶(propidine(propidine iodide,PI)iodide,PI)是一种核酸染料，是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细它不能透过完整的细胞膜，但在凋
26、亡中晚期的细胞和死细胞，胞，PIPI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinAnnexin-V V与与PIPI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。区分开来。DNA片断化检测片断化检测 v细胞凋亡时其染色质发生浓缩细胞凋亡时其染色质发生浓缩,染色质染色质DNA在核在核小体单位之间的连接处断裂小体单位之间的连接处断裂,形成形成50300kbp长长的的DNA大片段大片段,或或180200bp整数倍的寡核苷酸整数倍的寡核苷酸片段片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(
27、DNA ladder)。采用常规方法分离提纯。采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的到典型的DNA ladder。凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析v免疫荧光v免疫印记线粒体膜势能的检测线粒体膜势能的检测 Protease cascade 实验步骤实验步骤v荧光显微镜观察转染绿色荧光蛋白的细胞。荧光显微镜观察转染绿色荧光蛋白的细胞。v显微镜观察过量表达显微镜观察过量表达TNF-R1（实验组）和对照组（实验组）和对照组293细胞形态上的差异细胞形态上的差异v用细胞刮子
28、将实验组和对照组培养皿中的细胞轻轻刮下来，收集到用细胞刮子将实验组和对照组培养皿中的细胞轻轻刮下来，收集到15ml离心管中离心管中v2000rpm离心离心5分钟分钟v沉淀用沉淀用1ml PBS重悬，转移到重悬，转移到1.5ml离心管中离心管中v4000rpm离心离心3分钟分钟v去除上清液，加入去除上清液，加入200l PBS(0.2mg/ml 蛋白酶蛋白酶 K)，重悬细胞，再加入，重悬细胞，再加入200l PBS（2NP40），颠倒混匀，冰上作用），颠倒混匀，冰上作用30分钟，期间颠倒数次分钟，期间颠倒数次v12,000rpm离心离心2分钟分钟v吸出上清，加入吸出上清，加入1ml乙醇，颠倒混匀，乙醇，颠倒混匀，20C静置静置10分钟分钟v12,000rpm离心离心10分钟，沉淀溶于分钟，沉淀溶于30l水中，加入水中，加入1l RNaseA(10mg/ml)，37C静静置置20分钟分钟v在在DNA溶液中加入溶液中加入6l DNA上样缓冲液，将全部样品进行上样缓冲液，将全部样品进行1.2琼脂糖凝胶电泳，紫外琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪拍照凝胶成像仪拍照
