1、第五章第五章 酶学分析技术酶学分析技术 退出退出 主要内容 六、工具酶及其临床应用六、工具酶及其临床应用一、酶的一般特征一、酶的一般特征 二、酶促反应动力学二、酶促反应动力学三、酶活性浓度测定技术三、酶活性浓度测定技术四、四、酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定五、五、同工酶和亚型的测定同工酶和亚型的测定七、血清酶七、血清酶八、临床常用血清酶及其同工酶八、临床常用血清酶及其同工酶 第一节第一节 酶的一般特征酶的一般特征 返回章返回章 1.1.酶、核酶。酶、核酶。2.2.酶的催化特性酶的催化特性：极高的催化效率、高度的特异性、：极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。催化作用的可调节性。3
2、.3.酶促反应：酶促反应：酶所催化的反应。酶所催化的反应。酶活性：酶活性：酶催化反应的能力。酶催化反应的能力。酶活性单位：酶活性单位：在一定条件下使酶促反达到某一速在一定条件下使酶促反达到某一速度时所需要的酶量。度时所需要的酶量。底物底物(S)(S)：酶所作用的物质。酶所作用的物质。产物产物(P)(P)：酶促反应的生成物。酶促反应的生成物。酶的激活剂酶的激活剂:加速酶促反应的物质。加速酶促反应的物质。酶的抑制剂酶的抑制剂:减慢或终止酶促反应的物质。减慢或终止酶促反应的物质。一、基本概念一、基本概念 返回节返回节 二、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶单纯酶和结合酶 单纯酶：单纯酶：只含多肽链，
3、是单纯蛋白质。只含多肽链，是单纯蛋白质。结合酶：结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。由酶蛋白和辅因子组成。两者结合后形成的复合物称为全酶。两者结合后形成的复合物称为全酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。酶的活性中心酶的活性中心 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。一个特定区域。酶的催化作用机制酶的催化作用机制 诱导契合学说。诱导契合学说。返回节返回节 临床应用酶临床应用酶ECEC编号编号习惯用名习惯用名英语缩写英语缩写ECEC编号编号习惯用名习惯用名英语缩
4、写英语缩写1.1.1.271.1.1.27乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶LDLD、LDHLDH2.7.3.22.7.3.2肌酸激酶肌酸激酶CKCK、CPKCPK1.1.1.371.1.1.37苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶MDMD、MDHMDH3.1.1.33.1.1.3脂肪酶脂肪酶LPSLPS1.1.1.411.1.1.41异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶ICDICD、ICDHICDH3.1.1.83.1.1.8胆碱酯酶胆碱酯酶CHECHE1.1.1.491.1.1.496-6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDHG6PDH3.1.3.13.1.3.1碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALPALP、AKPAKP1.4.
5、1.31.4.1.3谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶GLDGLD、GLDHGLDH3.1.3.23.1.3.2酸性磷酸酶酸性磷酸酶ACPACP1.4.3.41.4.3.4单氨氧化酶单氨氧化酶MODMOD3.1.3.53.1.3.55-5-核苷酸酶核苷酸酶5-NT5-NT2.1.3.32.1.3.3鸟氨酸氨甲酰基转移酶鸟氨酸氨甲酰基转移酶OCTOCT3.2.1.13.2.1.1-淀粉酶淀粉酶AMYAMY、AMSAMS2.3.2.22.3.2.2-谷氨酰基转移酶谷氨酰基转移酶-GT-GT、GGTGGT3.2.1.303.2.1.30-N-N-乙酰乙酰(基基)-)-D D氨基葡萄糖苷酶氨基葡萄糖苷酶NAGN
6、AG2.4.1.12.4.1.1糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶GPGP3.2.1.513.2.1.51-L-L-岩藻糖苷酶岩藻糖苷酶-FU-FU、AFUAFU2.5.1.182.5.1.18谷胱甘肽转移酶谷胱甘肽转移酶GSTGST3.4.23.13.4.23.1亮氨酸氨基肽酶亮氨酸氨基肽酶LAPLAP2.6.1.12.6.1.1门冬氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨基转移酶ASTAST、GOTGOT4.1.2.134.1.2.13果糖二磷酸醛缩酶果糖二磷酸醛缩酶ALDALD2.6.1.22.6.1.2丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶ALTALT、GPTGPT三、酶的命名、分类及编号三、酶的命名、分类及编号 返
7、回节返回节 酶促反应动力学酶促反应动力学 返回章返回章 MichaelisMichaelis 和和MentenMenten提出的酶作用的中间产物学说提出的酶作用的中间产物学说:maxSKmSVV一、米曼氏方程一、米曼氏方程 E+SK1K2K3 返回节返回节 19131913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式，即米方程式，即米-曼氏方程曼氏方程(Michaelis-Menten(Michaelis-Menten equation):equation):E+PES二、Km与Vmax KmKm值：值：等于酶促反应的初速率为最大速率等于酶促反应
8、的初速率为最大速率VmaxVmax一半一半 时的底物浓度，即时的底物浓度，即V VVmaxVmax时，则时，则KmKmSS。KmKm 在临床上的应用：在临床上的应用：反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的百分率。大反应速度的百分率。根据根据KmKm值选择酶的最适底物。值选择酶的最适底物。确定工具酶用量。确定工具酶用量。确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。据。VmaxVmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代
9、表了在一酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量下的最大反应速率定酶量下的最大反应速率。返回节返回节 三、酶促反应进程曲线 如将酶反应过程中测得的产物如将酶反应过程中测得的产物PP或底物或底物SS变化量对时间作图，可得酶促反变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中产物应时间进程曲线。图中产物PP或底物或底物SS变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。延滞期延滞期线性反应期线性反应期底物耗尽期底物耗尽期必须根据线性反应期必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。出酶活性浓度。返回节返回节 四、影响酶促反应的因素 底
10、物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响（1 1）当）当SKmSKmSKm时时，反应速率，反应速率与底物浓度与底物浓度SS无关，无关，V VVmaxVmaxK EK E 称为称为零级反应零级反应，反应速率反应速率与酶浓度与酶浓度EE成正比成正比。酶学测。酶学测定时一般底物浓度可选择为定时一般底物浓度可选择为KmKm的的10102020倍。倍。返回节返回节 常见酶温度转化系数 252530303737CKCK0.640.641.001.001.561.56LDLD0.750.751.001.001.441.44ALTALT0.760.761.001.001.381.38ASTAST0.73
11、0.731.001.001.521.52ALPALP0.780.781.001.001.301.30GGTGGT0.730.731.001.001.311.31CHECHE0.810.811.001.001.261.26HBDHHBDH0.850.851.001.001.101.10 酶活性浓度测定就是要使酶促反应酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（的初速度（v v）达到最大速度）达到最大速度VmaxVmax，即在过，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度应速度与酶浓度EE之间存在线性关系。之间存在线性关系。第二节第二节 酶活性浓度
12、测定技术酶活性浓度测定技术 返回章返回章 1.1.按反应时间分类按反应时间分类:定时法定时法 连续监测法连续监测法2.2.按检测方法分类按检测方法分类：量气法、分光光度法、荧光法量气法、分光光度法、荧光法 其它方法（其它方法（放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、极谱法、HPLCHPLC或生物发光法等）。或生物发光法等）。一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法 返回节返回节 测定项目测定项目方法原理方法原理测定手段测定手段胆碱酯酶胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根电位滴定法电位滴定法脂肪酶脂肪酶三油酸甘油酯悬乳液
13、做底物，生成油酸甘油一三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一酯，浊度下降酯，浊度下降浊度法浊度法淀粉酶淀粉酶淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足以淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足以使碘呈兰色使碘呈兰色时间滴定法时间滴定法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶赖氏法赖氏法比色法比色法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶IFCCIFCC推荐法推荐法分光光度法分光光度法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过氧化氢电极氧化氢电极生物传感器生物传感器N-N-乙酰乙酰-氨基葡萄糖苷酶氨基葡萄糖苷酶4-4-甲基伞形酮甲基伞形酮N-N-
14、乙酰乙酰-D-D-氨基葡萄糖苷做底物氨基葡萄糖苷做底物荧光荧光葡萄糖葡萄糖6 6磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶NADPHNADPH在在365nm365nm激发下产生荧光激发下产生荧光荧光荧光 返回节返回节 定时法（固定时间法）定时法（固定时间法）测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。的总量，计算酶促反应平均速度。优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。对酶活性的影响。
15、缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。性期。利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。差。返回节返回节 连续监测法连续监测法 又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间 的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活 性浓性浓度的方法。度的方
16、法。优点：优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察 到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活 性，结果准确可靠。性，结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。动生化分析仪都能达到这些要求。返回节返回节 连续监测法的种类 直接法直接法 是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质，是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的
17、仪器直接检测。然后通过特殊的仪器直接检测。u 基于基于NADHNADH或或NADPHNADPH的反应原理的反应原理 ：LDLD、-HBD-HBD等等u 基于人工合成色素原底物基于人工合成色素原底物 ：ALP ALP、GGTGGT、AMSAMS等等 u 基于氧的消耗基于氧的消耗 ：各种氧化酶：各种氧化酶 间接法间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类明显特征理化性质的另一个化合物
18、。用直接法来测定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用间接法。非常有限，很多情况下不得不使用间接法。l化学法化学法：如如ChEChE的丁酰硫代胆碱测定法。的丁酰硫代胆碱测定法。l酶偶联法酶偶联法 返回节返回节 用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲来讲V V、v v和和L L均为固定值，均为固定值，为常数，则将公式为常数，则将公式 简化为简化为 如如LDLD活性浓度，已知活性浓度，已知NADHNADH的的 为为6.226.22 10103 3cmcm-1-1.mol.mol-1-1，血，血清量为清量为5050 l l，底物液为，底物液
19、为1ml1ml，比色杯光径为，比色杯光径为1cm1cm，则，则 F=1.05F=1.05 10106 6/6.22/6.22 10 103 3 0.050.05 1=33761=3376FALUmin/LvVF610LvVALU610min/五、系数五、系数K K值的计算与应用值的计算与应用 返回节返回节 连续监测法中常数连续监测法中常数K K值的设置值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限测定酶的判断值或参考范围上限，保证测定的可靠，所，保证测定的可靠，所 以转氨酶的常数以转氨酶的常数K K一般在一般在30003000左右，不少人宁愿在左右，不少人宁愿在15001500 左右。左右。应考虑到测
20、定时间，应考虑到测定时间，测定时间短到测定时间短到0.50.5分，此时分，此时0.0010.001嗓嗓 音对每分钟音对每分钟A A误差将是误差将是0.0020.002，反之，测定时间延长，反之，测定时间延长 到到2 2分钟，误差也小一半。即测定时间长，则分钟，误差也小一半。即测定时间长，则K K值可以值可以 设置大一些，如测定时间只有设置大一些，如测定时间只有0.50.5分钟，分钟，K K值一般不超值一般不超 过过40004000。改变改变K K值最方便的途径值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数就是改变标本稀释度，稀释倍数 愈大，愈大，K K值愈大。值愈大。返回节返回节 第七节第七节 工
21、具酶及其临床应用工具酶及其临床应用 返回章返回章 概念概念 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。工具酶参与的指示反应工具酶参与的指示反应 偶联偶联H H2 2O O2 2工具酶及指示反应：工具酶及指示反应：如常用的如常用的TrinderTrinder反应。反应。NAD(P)+NAD(P)+或或NAD(P)HNAD(P)H偶联的脱氢酶及其指偶联的脱氢酶及其指示反应：示反应：利用氧化利用氧化-还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)H的正的正/逆反应后，直接测定逆反应后，直接测定N
22、AD(P)HNAD(P)H的变化量。的变化量。一、工具酶一、工具酶 返回节返回节 工具酶的其他应用工具酶的其他应用n酶循环法酶循环法n固相酶固相酶酶循环法测定胆汁酸酶循环法测定胆汁酸 返回节返回节 多酶体系中酶促偶联反应分析多酶体系中酶促偶联反应分析 二、代谢物的酶法测定 终点法终点法概念：概念：在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变
23、化的总量，即终点法（又称平衡法）。点法（又称平衡法）。测定的基本条件：测定的基本条件：待测物浓度待测物浓度SS应远小于其米氏常数应远小于其米氏常数KmKm，此时任何时刻的，此时任何时刻的反应速度反应速度 v=VS/Kmv=VS/Km，呈一级反应。，呈一级反应。反应配方中所用酶量（反应配方中所用酶量（V V）应足够大，而）应足够大，而KmKm应小，以保证应小，以保证有较快的反应速度完成测定。有较快的反应速度完成测定。返回节返回节 直接法直接法 待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，这种是最简单的代谢物浓度测定方法。异，这种是最简单的代谢物浓度
24、测定方法。如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在293nm293nm有有特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿素造成素造成450nm450nm处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可以直接测定，关键是需要相对应的酶。以直接测定，关键是需要相对应的酶。返回节返回节 酶偶联法酶偶联法 与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测方法。方法。如甘油
25、三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反应主要分两大类：应主要分两大类：NADNAD（P P）H H和过氧化物酶（和过氧化物酶（PODPOD）系）系统。统。返回节返回节 Ex Ex 为待测酶，为待测酶，A A为底物，为底物，B B为中间产物。为中间产物。A A、B B二物质的变二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(Ei(为指示酶为指示酶)，其，其底物为底物为B B，反应产物为，反应产物为P P可直接测定。可直接测定。PBAEiEx二、酶偶联法二、酶偶联法 返回节返回节 酶偶联反应酶偶联反应 最简单的模式为：最简单的
26、模式为：辅助反应辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：模式为：PCBAEiEaEx 返回节返回节 其中，其中，B B、C C均为中间产物，均为中间产物，EaEa、EiEi都为工具酶。都为工具酶。最后最后一个酶称指示酶一个酶称指示酶EiEi，其他外加的酶都为辅助酶（其他外加的酶都为辅助酶（EaEa）。）。酶偶联反应原理酶偶联反应原理 (1)(1)当用酶偶联法测
27、定时，在偶联反应中存在几个当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个时期：时期：预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。(2)(2)延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。不能代表测定酶量多少。(3)(3)设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越好，测定时间要避开此期。好，测定时间要避开此期。
28、返回节返回节 对酶偶联反应的要求对酶偶联反应的要求 指示酶反应必须是一级反应指示酶反应必须是一级反应 酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。工具酶工具酶 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为
29、工具酶。酶。返回节返回节 酶偶联法测定ALT的吸光度变化图 返回节返回节 动力学法动力学法概念：概念：根据米氏方程，当根据米氏方程，当SKmSKm，一般，一般S/Km0.2S/Km0.2，最好，最好0.050.05，S+KmKmS+KmKm，此时呈一级反应，反应初速，此时呈一级反应，反应初速度度v=kSv=kS。如果能准确测定反应的初速度（。如果能准确测定反应的初速度（v v），采用标），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。准浓度对照法即可求得待测物的浓度。实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只要此期间待测物消耗要此期间待测物消耗5%5%，
30、就可以采用标准浓度对照法计，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。返回节返回节 与终点法相比，动态法与终点法相比，动态法测定中待测物无需完全转化，故工具酶测定中待测物无需完全转化，故工具酶的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的KmKm应足够应足够大。大。两者对于测定仪器的要求不同两者对于测定仪器的要求不同。终点法测定对于仪器的电噪声。终点法测定对于仪器的电噪声和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读准到
31、准到0.00010.0001，温度变化，温度变化0.1%20ULN)(20ULN)的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。返回节返回节 二、-谷氨酰转移酶及其同工酶 生化特性生化特性 -GT-GT或或GGT GGT 是一种含巯基的线粒体酶。是一种含巯基的线粒体酶。组织分布组织分布 分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织中，其中以肾脏含量最多。中，其中以肾脏含量最多。GGTGGT在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲水型）两种。水型）两种。血清中血清中GGTGGT主要来源于肝胆系统。主
32、要来源于肝胆系统。返回节返回节 GGTGGT的测定方法的测定方法 以往国内多以以往国内多以L-L-谷氨酰谷氨酰-萘胺或萘胺或L-L-谷氨酰谷氨酰-对硝基苯胺等人工合成底物进行比色法测定（即重氮对硝基苯胺等人工合成底物进行比色法测定（即重氮试剂法）。由于底物水溶性差，缓冲液和试剂法）。由于底物水溶性差，缓冲液和 pH pH 对结果对结果影响较大，现已较少应用。目前国内外多采用连续监影响较大，现已较少应用。目前国内外多采用连续监测法测定血清测法测定血清-GT-GT活性。活性。返回节返回节 IFCCIFCC参考方法参考方法 采用采用L-L-谷氨酰谷氨酰-3-3-羧基羧基-对硝基苯胺对硝基苯胺(GCN
33、A)(GCNA)作为底物，作为底物，以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为-谷氨酰基的受体。在谷氨酰基的受体。在pH7.7pH7.7的条件下，的条件下，-GT-GT催化底物生成催化底物生成-谷氨酰双甘肽和黄谷氨酰双甘肽和黄色的色的2-2-硝基硝基-5-5-氨基苯甲酸，在氨基苯甲酸，在410nm410nm波长处直接连续监测，波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与吸光度的增高速率与-GT-GT活性成正比关系。活性成正比关系。甘氨酰甘氨酸谷氨酰氨基苯甲酸硝基双甘肽LGCNAGGT52 返回节返回节 GGTGGT测定的临床意义测定的临床意义(1)(1)胆道疾病胆道疾病 胆石症、胆道炎
34、症、肝外梗阻等升高明显。胆石症、胆道炎症、肝外梗阻等升高明显。(2)(2)肝实质疾病肝实质疾病 肝炎、脂肪肝、肝硬化时中度升高。肝炎、脂肪肝、肝硬化时中度升高。慢性肝炎活动期慢性肝炎活动期GGTGGT多增高，非活动期则多正常。多增高，非活动期则多正常。原发性或转移性肝癌时不同程度的增高。原发性或转移性肝癌时不同程度的增高。(3)(3)诱导作用诱导作用 对乙醇性中毒的判断有一定的价值。对乙醇性中毒的判断有一定的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者升高。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者升高。(4)(4)同工酶同工酶 用醋酸纤维薄膜电泳可将用醋酸纤维薄膜电泳可将GGTGGT同工酶分
35、为同工酶分为GGTGGT1 1、GGTGGT2 2、GGTGGT3 3和和 GGTGGT4 4四种，正常人只有四种，正常人只有GGTGGT2 2和和GGTGGT3 3。重症肝胆疾病和肝癌时有重症肝胆疾病和肝癌时有GGTGGT1 1出现；乙醇性肝坏死、胆总管结出现；乙醇性肝坏死、胆总管结 石及胰腺炎时石及胰腺炎时GGTGGT2 2增加；增加；GGTGGT4 4与胆红素增高相关。与胆红素增高相关。返回节返回节 三、肌酸激酶及其同工酶 生化特性生化特性 肌酸激酶为巯基酶，易受金属离子肌酸激酶为巯基酶，易受金属离子CaCa2 2、CuCu2 2、ZnZn2 2、MnMn2 2等的抑制，等的抑制，MgM
36、g2 2是是CKCK的必需激活剂。由两种不同亚基（的必需激活剂。由两种不同亚基（M M和和B B亚基）组成的二聚体。亚基）组成的二聚体。按电泳速率的快慢分为：按电泳速率的快慢分为：CK-BBCK-BB（CKCK1 1）、）、CK-MBCK-MB（CKCK2 2）、）、CK-MMCK-MM（CKCK3 3）和）和CKMt(CKCKMt(CK4 4)四种同工酶。四种同工酶。组织分布组织分布 广泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑组广泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑组织。织。CK-BBCK-BB在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶。分为氧化在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶。分为氧
37、化型、中间型和还原型型、中间型和还原型3 3种亚型。种亚型。CK-MBCK-MB主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶。分为主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶。分为CK-MB1CK-MB2CK-MB1CK-MB2亚型。亚型。骨骼肌中几乎全部为骨骼肌中几乎全部为CK-MMCK-MM，称为肌型同工酶。分为，称为肌型同工酶。分为CK-MM1CK-MM2CK-MM3CK-MM1CK-MM2CK-MM3亚型。亚型。返回节返回节 CKCK的测定方法的测定方法 有比色法、紫外分光光度法和荧光法等。由于以磷酸有比色法、紫外分光光度法和荧光法等。由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快，约为正向反应速度的肌酸为底物的逆
38、向反应速度快，约为正向反应速度的6 6倍，倍，所以采用逆向反应进行测定较为普及。如肌酸显色法和酶偶所以采用逆向反应进行测定较为普及。如肌酸显色法和酶偶联法，其中以后者最常用，有两种工具酶及指示酶参与反应。联法，其中以后者最常用，有两种工具酶及指示酶参与反应。IFCCIFCC测定测定CKCK的参考方法为酶偶联法。的参考方法为酶偶联法。HNADPHPDGNADPADPHKATPATPCKADP磷酸葡萄糖内酯葡萄糖磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖肌酸磷酸肌酸6666 返回节返回节 CKCK同工酶和亚型的测定方法同工酶和亚型的测定方法 临床常规测定临床常规测定CKCK同工酶多用电泳和免疫抑制同工酶多用电泳和免疫抑
39、制法，但二法均会受溶血和巨法，但二法均会受溶血和巨CKCK的干扰，免疫抑制的干扰，免疫抑制法还会受到法还会受到CK-BBCK-BB的干扰。的干扰。现推荐用免疫化学方法直接测定现推荐用免疫化学方法直接测定CK-MBmassCK-MBmass，可不受溶血和巨可不受溶血和巨CKCK的干扰。的干扰。CKCK同工酶亚型（同工酶亚型（CK-MMCK-MM亚型和亚型和CK-MBCK-MB亚型）多亚型）多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。返回节返回节 正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析血清CK同工酶可能出现的酶带 返回节返回节 CKCK及其同工酶测定的临床意义及其同工
40、酶测定的临床意义主要用于早期诊断主要用于早期诊断AMIAMI（1 1）血清血清CKCK总活力总活力 AMIAMI后后2 24h4h开始升高，开始升高，101024h24h达峰值，达峰值，3 34 4天恢复正天恢复正常。常。（2 2）CKCK同工酶及亚型同工酶及亚型 AMIAMI胸痛发作后，血清胸痛发作后，血清CK-MBCK-MB的上升先于其的上升先于其CKCK总活性，总活性，CK-MB/CKCK-MB/CK0.030.03可诊断为可诊断为AMIAMI。CK-MMCK-MM亚型的测定：以亚型的测定：以CK-MMCK-MM3 3/CK-MM/CK-MM1 11.01.0作为诊断作为诊断AMIAMI
41、的的标准。标准。CK-MBCK-MB2 2亚型：在亚型：在AMIAMI早期诊断和判断有无再灌注上同样有很早期诊断和判断有无再灌注上同样有很高的灵敏度和特异性。一般以高的灵敏度和特异性。一般以CK-MBCK-MB2 21.9U/L1.9U/L或或CK-MBCK-MB2 2/CK-MB/CK-MB1 11.51.5作为作为AMIAMI的诊断标准。的诊断标准。返回节返回节 四、乳酸脱氢酶及其同工酶 生化特性生化特性 乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的一种重要酶。乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的一种重要酶。LDLD除催除催化化L-L-乳酸外还可催化乳酸外还可催化-羟丁酸、羟丁酸、-酮丁酸进行脱氢反酮丁酸进行脱氢反应
42、。应。组织分布组织分布 LDLD位于细胞质中，是一种含锌的糖酵解酶。位于细胞质中，是一种含锌的糖酵解酶。LDLD是是由由H H（心型）和（心型）和M M型（肌型）两种不同亚基组成的四聚体。型（肌型）两种不同亚基组成的四聚体。5 5种同工酶。种同工酶。若用若用-羟基丁酸作为底物，可测定羟基丁酸作为底物，可测定H H亚基的活性亚基的活性。返回节返回节 LDLD的测定方法的测定方法目前多用连续监测法。目前多用连续监测法。nLD-PLD-P法：以丙酮酸为底物（反应方向法：以丙酮酸为底物（反应方向P PL L）的逆向反应）的逆向反应（称（称LD-PLD-P法）。法）。nLD-LLD-L法：以乳酸为底物（
43、反应方向法：以乳酸为底物（反应方向L LP P）的顺向反应（称）的顺向反应（称LD-LLD-L法）。为法）。为IFCCIFCC参考方法（参考方法（pHpH为为9.49.4）。通过在）。通过在340nm340nm波波长处监测长处监测NADNAD+还原成还原成NADHNADH吸光度的增加速率而计算吸光度的增加速率而计算LDLD活性。活性。HNADHNADLLD丙酮酸乳酸)(返回节返回节 LDLD同工酶的测定方法同工酶的测定方法 常用电泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以琼脂糖凝胶常用电泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以琼脂糖凝胶电泳法更多用。一般成年人存在如下规律：电泳法更多用。一般成年人存
44、在如下规律：LDLD2 2LDLD1 1LDLD3 3LDLD4 4LDLD5 5，部分正常儿童血中可见，部分正常儿童血中可见LDLD1 1LDLD2 2。返回节返回节 LDLD及其同工酶测定的临床意义及其同工酶测定的临床意义心肌梗死心肌梗死 LDLD心肌酶中升高最晚，持续时间长。心肌酶中升高最晚，持续时间长。急性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌急性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌(尤其转移性肝癌尤其转移性肝癌)时，时，LDLD明显明显升高。升高。LDLD同工酶主要用于同工酶主要用于AMIAMI和肝病的诊断和肝病的诊断 AMI LDAMI LD1 1升高最为显著，升高最为显著，LDLD1 1/LD/LD2
45、 21 1，视为诊断，视为诊断AMIAMI的一个特异指的一个特异指标。标。肝胆疾病肝胆疾病 LDLD5 5升高常表示有肝细胞坏死。肝细胞性黄疸时升高常表示有肝细胞坏死。肝细胞性黄疸时LDLD5 5LDLD4 4，阻塞性黄疽时，阻塞性黄疽时LDLD4 4LDLD5 5。肿瘤肿瘤 肝癌肝癌(尤其转移癌尤其转移癌)时可伴有时可伴有LDLD4 4和和LDLD5 5明显增高；白血病、明显增高；白血病、胶原病时以胶原病时以LDLD3 3、LDLD4 4增高为主。增高为主。恶性贫血恶性贫血 LDLD活性极度升高活性极度升高(原始巨幼红细胞可产生并释放原始巨幼红细胞可产生并释放LD)LD)，伴有伴有LDLD1
46、 1明显升高，明显升高，LDLD1 1LDLD2 2。返回节返回节 返回节返回节 五、碱性磷酸酶及其同工酶 生化特性生化特性 碱性磷酸酶是一组底物特异性较低碱性磷酸酶是一组底物特异性较低,在碱性条件下（最适在碱性条件下（最适pHpH为为1010左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。组织分布组织分布 ALPALP广泛分布定位于细胞膜表面，其含量依次为肝、肾、广泛分布定位于细胞膜表面，其含量依次为肝、肾、胎盘、小肠、骨骼等。胎盘、小肠、骨骼等。血清中的血清中的ALPALP主要来自肝脏和骨骼，是胆汁淤滞的酶学指主要来自肝脏和骨骼，是胆汁淤滞的酶学指标。标。根据根据A
47、LPALP的来源不同可以的来源不同可以3 3大类，即胎盘大类，即胎盘ALPALP、肠、肠ALPALP和和肝肝/骨骨/肾肾ALPALP同工酶。在病理时还可能出现肝同工酶。在病理时还可能出现肝ALPALP和胆汁和胆汁ALPALP等等“高分子高分子ALP”ALP”，以及一些和肿瘤有关的变异，以及一些和肿瘤有关的变异ALPALP，如，如ReganRegan、Nagao ALPNagao ALP等。等。返回节返回节 ALPALP的测定方法的测定方法(1)(1)磷酸苯二钠比色法：磷酸苯二钠比色法：测定测定ALPALP水解底物产生的酚。水解底物产生的酚。(2)(2)连续监测法：连续监测法：我国及我国及IFC
48、CIFCC的推荐方法。的推荐方法。PiAMPPNPAMPPNPPALP 返回节返回节 ALPALP测定的临床意义测定的临床意义肝胆疾病肝胆疾病 各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾病，病，ALPALP明显升高，且明显升高，且ALPALP升高与胆红素平行升高与胆红素平行甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、PagetsPagets病、骨折病、骨折、指端肥大、指端肥大症所致骨损伤等，均可引起症所致骨损伤等，均可引起ALPALP活性升高，尤其是骨活性升高，尤其是骨ALPALP同同工酶的增高工酶的增高妊娠后期妊娠后期及儿童生长期及儿童生长期ALPA
49、LP增高增高血清血清ALPALP活性降低：活性降低：主要见于呆小病、维生素主要见于呆小病、维生素C C缺乏症、甲缺乏症、甲状腺功能低下、恶性贫血等。状腺功能低下、恶性贫血等。返回节返回节 六、酸性磷酸酶及其同工酶 生化特性生化特性 酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强、在酸性条件下水酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强、在酸性条件下水解各种正磷酸单酯的酶。解各种正磷酸单酯的酶。组织分布组织分布 ACPACP主要存在于体内所有细胞的溶酶体中。主要存在于体内所有细胞的溶酶体中。血清中血清中ACPACP主要来源于前列腺，称为前列腺主要来源于前列腺，称为前列腺ACPACP（PAPPAP），它），它可被酒石酸抑
50、制；其活性约为其他组织中酶活性的可被酒石酸抑制；其活性约为其他组织中酶活性的100100倍。非前倍。非前列腺列腺ACPACP，不被酒石酸抑制。，不被酒石酸抑制。正常男性血清中的正常男性血清中的ACPACP约有约有1/31/31/21/2来自前列腺，其余则与来自前列腺，其余则与女性血中的女性血中的ACPACP一样可能来自血小板或破骨细胞。一样可能来自血小板或破骨细胞。返回节返回节 ACPACP的测定方法的测定方法 ACPACP的测定底物、原理和方法与的测定底物、原理和方法与ALP ALP 相似，只是反应相似，只是反应pHpH为为酸性。如利用磷酸苯二钠法和磷酸对硝基酚法等在酸性条件下酸性。如利用磷
