1、COOHCHH2NR-氨基酸氨基酸不变部分不变部分可变部分可变部分手性手性-碳原子碳原子苏氨酸半胱氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸赖氨酸精氨酸天冬氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氨酰胺八种必需氨基酸:八种必需氨基酸:Thr,Lys,Val,LeuIle,Met,Tyr,Phe苏赖缬亮异亮,甲硫酪苯丙。Gly,Ala,Val,Leu.Ile,Phe,Met,Pro,TrpGly,Ala,Val,Leu.Ile,Phe,Met,Pro,Trp带电荷带电荷Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,CysSer,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys带正电带正电:His,Lys,Arg His,Lys,Arg带负电荷
2、带负电荷:Asp,GLuAsp,GLu.不带荷不带荷:极性氨基酸极性氨基酸非极性氨基酸非极性氨基酸 OH-OH-RCHCOOH RCHCOO-RCHCOO-H+H+NH3+NH3+NH2 pH pI PkPk2 2是是AAAA的的-NH-NH3 3+被滴定一半时的被滴定一半时的pHpH(NHNH3 3+释放释放H H+)PkPk1 1是是AAAA的的-coo-coo-被滴定一半时的被滴定一半时的pHpH(coo-coo-结合结合H H+)氨基酸的解离曲线等电点的推导等电点的推导Ala+=AlaH+K1移项:移项:Ala-=Ala K2H+根据等电点的定义根据等电点的定义:Ala+=Ala-Al
3、aH+K1Ala K2H+=整理:K1 K2 Ala=Ala H+H+K1 K2=H+2两端取对数:-lg H+2=-lg K1-lg K2-lg K1=pk1 -lg K2=pk2 2(-lg H+)=pk1+pk2 根据pH 的定义得:pH=lg 1/H+=-lg H+2 pH=pk1+pk2pI=1/2(pk1+pk2)中性氨基酸:中性氨基酸:pIpI=(pK=(pK1 1+pK+pK2 2)/2)/2 酸性氨基酸:酸性氨基酸:pIpI=(pK=(pK1 1+pK+pKR R-COO-COO-)/2)/2 碱性氨基酸:碱性氨基酸:pIpI=(pK=(pK2 2+pK+pKR-NH2 R-
4、NH2)/2)/2 p pK K 1 1指指-羧基离解常数的负对数值;羧基离解常数的负对数值;p pK K 2 2指指-氨基离解常数的负对数值氨基离解常数的负对数值p pK K R R指侧链指侧链R R基基离解常数的负对数值。离解常数的负对数值。3.3.紫外吸收性质:紫外吸收性质:色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。光吸收。其吸收峰在其吸收峰在280nm280nm左右,左右,以以色色氨酸氨酸吸收最强。吸收最强。可采用紫外分分光度法测定蛋白质的含可采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。量。氨基酸的紫外吸收光谱4.4.氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应(1)茚三
5、酮反应 AA+水合茚三酮 蓝紫色化合物(2)甲醛反应 AA+甲醛 二羟甲基氨基酸(3)亚硝酸反应 AA+亚硝酸 -羟氨基酸+氮气+水pH8.3 NaHCO3 pH8-9、室温pH9.7无水HF用途用途:常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。CCCOOOCCCOOOHOHH2OH2O水合茚三酮水合茚三酮CO2NH2RCHO+CCCOOHOHH2NCHCOOHRCCCOOOHOH+2NH3CCCOOCCCOO-NH4+NH2O2+CCCOOOCCCOOHHO用途用途:O2NFNO2+H2N CH CROHN CH CROO2NNO2H+H2OO2NNO2HN CH CROOH
6、+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸用途用途:N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸(一)肽的概念(一)肽的概念氨基酸残基与肽单位氨基酸的顺序:氨基酸的顺序:指从指从“N”N”端端“C”“C”端端氨基酸的排列氨基酸的排列顺序。顺序。肽的表示法肽的表示法:按氨基酸的顺序依次读为某按氨基酸的顺序依次读为某氨酰氨酰某氨酰某氨酰某氨酸。某氨酸。如:谷氨酰半胱氨酰甘氨酸如:谷氨酰半胱氨酰甘氨酸.简称:谷胱甘肽简称:谷胱甘肽简式:简式:GluCysGly
7、(二)肽结构的表示(二)肽结构的表示 重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。激素等。1.1.谷胱甘肽(谷胱甘肽(GSHGSH):全称为全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。G lu-C ys-G ly G lu-C ys-G ly S H S S G lu-C ys-G ly 还原型(还原型(GSH)氧化型(氧化型(GSSG)-C y sT y rI L eG l nA s nC y sP r oL e uG l yN H2SS牛催产素C y sT y rG l nA s nC y sP r oSSP h eA r gG l yN H2牛加压素2.2
8、.多肽类激素:多肽类激素:种类较多,生理功能各异。主要见于下种类较多,生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。丘脑及垂体分泌的激素。+H H3 3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-N-Tyr-Gly-Gly-Phe-MetMet-COO-COO-+H H3 3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-N-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuLeu-COO-COO-3 3、神经肽、神经肽脑啡肽脑啡肽LeoLeo脑啡肽脑啡肽有镇痛麻醉作用。有镇痛麻醉作用。一级结构一级结构-基本结构基本结构空间结构空间结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构胰岛素(胰岛素(InsulinInsuli
9、n):):2 2、蛋白质一级结构的测定、蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从化学研究的基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来,现在已测定了胰岛素的一级结构以来,现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。定。细胞色素细胞色素c c的一级结构与生物进化的关系的一级结构与生物进化的关系3一级结构测定的程序一级结构测定的程序 异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯用途用途:N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2
10、SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸NH2-NH2NH-NH2羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的的C-C-端逐个的水解。端逐个的水解。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基;末端氨基酸残基;根据不同的反应时间测出酶水解所释放出根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,从而知道蛋白质的的氨基酸种类和数量,从而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。羧肽酶羧肽酶B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为
11、为C-C-末端残基的末端残基的肽键。肽键。蛋白质的特异裂解确定肽段在多确定肽段在多肽链中的次序肽链中的次序蛋白质空间结构(构象):蛋白质空间结构(构象):指蛋白质指蛋白质分子中原子和基团在空间的排列分布和分子中原子和基团在空间的排列分布和肽链的走向。肽链的走向。乙烷的构象蛋白质的二级结构:蛋白质的二级结构:指一级结构进一指一级结构进一步盘绕折叠,其主链形成的局部构象。步盘绕折叠,其主链形成的局部构象。二级结构的类型:二级结构的类型:主要有主要有-螺旋、螺旋、-折折叠、叠、-转角、转角、无规卷曲。无规卷曲。维持二级结构的力:维持二级结构的力:主要是氢键主要是氢键。R R基分布在螺旋的外侧,并基分
12、布在螺旋的外侧,并且影响着螺旋的形成。且影响着螺旋的形成。主链围绕中心轴呈有规律螺主链围绕中心轴呈有规律螺旋式上升,形成右旋式上升,形成右手手螺旋;螺旋;旋转一周为旋转一周为3.63.6个氨基酸残基;个氨基酸残基;螺距为螺距为0.54nm0.54nm;其结构靠第一个肽平面上的其结构靠第一个肽平面上的-NHNH基与第四个肽平面上的基与第四个肽平面上的-COCO基形成的氢键维持,氢键基形成的氢键维持,氢键的取向几乎与轴平行;的取向几乎与轴平行;角角蛋蛋白白分分子子中中的的二二硫硫键键影响影响-螺旋稳定的因素螺旋稳定的因素极大的侧链基团(存在空间位阻);极大的侧链基团(存在空间位阻);连续存在的侧链
13、带有相同电荷的氨基酸连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基(同种电荷的互斥效应残基(同种电荷的互斥效应)有有脯氨酸、羟脯氨酸的脯氨酸、羟脯氨酸的存在(不能形成存在(不能形成氢键)。氢键)。由若干条肽段或肽由若干条肽段或肽链平行或反平行排列链平行或反平行排列组成片状结构;组成片状结构;主链骨架主链骨架上下折叠上下折叠呈锯齿状;呈锯齿状;借相邻主链之间的借相邻主链之间的氢键维系。氢键维系。R R基交替分布在片基交替分布在片层的上下方。层的上下方。-折迭包括平行式和反平行式两种类型折迭包括平行式和反平行式两种类型丝蛋白的丝蛋白的结构结构丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维
14、轴平行排列成反向反向-折叠结构。分子中不含折叠结构。分子中不含-螺旋。丝蛋螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为:这六肽的氨基酸顺序为:-(Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-AlaGly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n n-主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约180180回折回折;回折部分通常由四个回折部分通常由四个氨基酸残基构成氨基酸残基构成;构象依靠第一残基的构象依靠第一残基的-CO-CO基与第四残基的基与第四残基的-NHNH基之间形成氢键来基之间形成氢键来维系。维系。RNaseRNase的分子结构的分子
15、结构-螺旋螺旋-折迭折迭-转角转角无规卷曲无规卷曲锌指结构:螺旋锌指结构:螺旋-折迭折迭-折迭模序折迭模序结构域结构域 与分子整体以共价键相连,这是与分子整体以共价键相连,这是它与亚基的区别。它与亚基的区别。结构域结构域domain多肽链在超二级结构基础上进一步盘曲多肽链在超二级结构基础上进一步盘曲折叠为折叠为紧密的近似球状的结构紧密的近似球状的结构。在空间上彼此分隔,各自具有部分生物在空间上彼此分隔,各自具有部分生物学功能的结构。学功能的结构。图示:假设具有图示:假设具有2个结构域的蛋白质的线性折叠途径个结构域的蛋白质的线性折叠途径蛋白质的三级结构:蛋白质的三级结构:是指蛋白质分子是指蛋白质
16、分子在二级结构基础上进一步盘曲折叠而形在二级结构基础上进一步盘曲折叠而形成的整体构象,也就是一条多肽链全部成的整体构象,也就是一条多肽链全部原子在三维空间的排布位置。原子在三维空间的排布位置。维系三级结构的力:维系三级结构的力:主要是非共价主要是非共价键(次级键),如疏水键、氢键、盐键(次级键),如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等,但也有共价键,如键、范氏引力等,但也有共价键,如二硫键等。二硫键等。疏水作用是维持蛋白质结构最主要疏水作用是维持蛋白质结构最主要的稳定力。疏水基团因疏水作用而聚的稳定力。疏水基团因疏水作用而聚向分子内部,亲水基团多分布在分子向分子内部,亲水基团多分布在分子表面。因此,
17、表面。因此,具有三级结构的蛋白质具有三级结构的蛋白质都是亲水的。都是亲水的。蛋白质的四级结构:蛋白质的四级结构:由两条或两条以上具有三级结构的多肽链由两条或两条以上具有三级结构的多肽链相互缔结在一起的聚合体。相互缔结在一起的聚合体。其中每条具有三级结构的多肽链为一个亚其中每条具有三级结构的多肽链为一个亚基基sub-unitsub-unit。维系蛋白质四级结构的力是次级键。维系蛋白质四级结构的力是次级键。由多个亚基聚集而成的蛋白质称为由多个亚基聚集而成的蛋白质称为寡聚蛋寡聚蛋白。白。(一)(一)1 1、(二)(二)1 1、2 2、血红蛋白血红蛋白超离心沉降法超离心沉降法凝胶电泳法凝胶电泳法凝胶过
18、滤法凝胶过滤法渗透压法渗透压法超离心沉降法:超离心沉降法:把蛋白质溶液放在把蛋白质溶液放在25-50万倍重力场的离心万倍重力场的离心作用下,使蛋白质颗粒从溶液中沉降下来。作用下,使蛋白质颗粒从溶液中沉降下来。应用光学方法观察蛋白质的沉降行为,从应用光学方法观察蛋白质的沉降行为,从而判断出蛋白质的沉降速率,计算出蛋白质而判断出蛋白质的沉降速率,计算出蛋白质的分子的分子 量。量。一般把单位(厘米)离心场中的沉降速率,一般把单位(厘米)离心场中的沉降速率,称为称为沉降系数,沉降系数,用用S S表示。表示。一个一个S单位等于单位等于110-13秒。秒。蛋白质的分子量可以直接用蛋白质的分子量可以直接用S
19、表示。表示。(二)蛋白质的两性解离与等电点(二)蛋白质的两性解离与等电点由于蛋白质分子中氨基酸残基的由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基,因此羧基,因此蛋白质与氨基酸一样蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质,因而也具具有两性解离的性质,因而也具有特定的等电点。有特定的等电点。在不同的在不同的pHpH环境下,蛋白质的电学性质环境下,蛋白质的电学性质不同。不同。当溶液当溶液pH=pH=等电点时,蛋白质粒子净电等电点时,蛋白质粒子净电荷为零,在电场中不移动;荷为零,在电场中不移动;当溶液当溶液pHpH等电点时,蛋白质粒子带负等电点时,蛋白质粒子带负
20、电荷,在电场中向正极移动;电荷,在电场中向正极移动;当溶液当溶液pHpH等电点时,蛋白质粒子带正等电点时,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动。电荷,在电场中向负极移动。1 1、蛋白质的变性:、蛋白质的变性:在某些物理或在某些物理或化学因素的作用下,蛋白质严格的化学因素的作用下,蛋白质严格的空间结构被破坏(不包括肽键的断空间结构被破坏(不包括肽键的断裂),从而引起蛋白质若干理化性裂),从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变,称为蛋白质和生物学性质的改变,称为蛋白质的变性质的变性(denaturation(denaturation)。(1 1)变性蛋白质的特征:)变性蛋白质的特征:物理性
21、质:物理性质:旋光性改变旋光性改变 溶解度下降溶解度下降 沉降率升高沉降率升高 光吸收度增加光吸收度增加化学性质:化学性质:官能团反应性增加官能团反应性增加易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解 生物学性质:生物学性质:原有生物学活性丧失原有生物学活性丧失抗原性改变抗原性改变(2 2)引起蛋白质变性的因素)引起蛋白质变性的因素物理因素:物理因素:高温、高压、紫外线、高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等电离辐射、超声波等.化化学因素:学因素:强酸、强碱、有机溶剂、强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、去污剂、尿素重金属盐、去污剂、尿素2.2.蛋白质变性的复性蛋白质变性的复性沉淀:沉淀:蛋白质分子相互聚集而从蛋
22、白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为溶液中析出的现象称为沉淀沉淀。变性的蛋白质不一定沉淀,变性的蛋白质不一定沉淀,沉淀的蛋白质不一定变性。沉淀的蛋白质不一定变性。凝固:凝固:加热使蛋白质变性并凝加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为聚成块状称为凝固凝固。层析层析 电泳电泳1 1、盐析与有机溶剂沉淀:、盐析与有机溶剂沉淀:盐析:盐析:概念:概念:在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析。析出,称为盐析。常用的中性盐有:常用的中性盐有:硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。硫酸铵、氯化钠、硫
23、酸钠等。盐析时,溶液的盐析时,溶液的pHpH在蛋白质的等电点处在蛋白质的等电点处效果最好。效果最好。盐析沉淀蛋白质时,通常不会引起蛋白盐析沉淀蛋白质时,通常不会引起蛋白质的变性。质的变性。凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可用于沉淀如乙醇、甲醇、丙酮等,均可用于沉淀蛋白质。蛋白质。沉淀原理是:沉淀原理是:A A、脱水作用;、脱水作用;B B、使水的、使水的介电常数降低,蛋白质溶解度降低。介电常数降低,蛋白质溶解度降低。有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质带电粒子在电场中移动的现象称为带电粒子在电场中移动的现象称为电泳电泳。蛋白质分子在溶
24、液中可带净的负电荷或带净蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷,故可在电场中发生移动。的正电荷,故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同,且分子不同的蛋白质分子所带电荷量不同,且分子大小也不同,故在电场中的移动速度也不同,大小也不同,故在电场中的移动速度也不同,据此可互相分离据此可互相分离.主要方法有聚丙烯酰胺电泳,等电聚焦,毛主要方法有聚丙烯酰胺电泳,等电聚焦,毛细管电泳等。细管电泳等。层析:层析:是一种利用混合物中各组分理化是一种利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相(固定性质的差异,在相互接触的两相(固定相与流动相)之间的分布不同而进行分相与流动相)之间的分布不同而进行分离的方法。离的方法。主要的层析技术有离子交换层析,凝胶主要的层析技术有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等。层析,吸附层析及亲和层析等。(a)琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素);(b)亲和层析的基本步骤n亲和层析利用物质分子量、密度、形利用物质分子量、密度、形状的不同,经超速离心后分布于不同的状的不同,经超速离心后分布于不同的液层而分离。液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数蛋白质的分子量与其沉降系数S S成成正比。正比。