1、第十章 紫外-可见分光光度法第十章第十章第十章 紫外-可见分光光度法紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(UV-vis)研究物质在紫外研究物质在紫外-可见光区（可见光区（200800nm）分分子吸收光谱子吸收光谱的分析方法。的分析方法。灵敏度高灵敏度高:10-410-6g/L最低浓度最低浓度 准确度较高准确度较高:(25%)相对误差相对误差操作简便、快速操作简便、快速应用广泛应用广泛第十章 紫外-可见分光光度法1、定性上可以、定性上可以鉴别不同官能团、化学结鉴别不同官能团、化学结构的化合物构的化合物；可以；可以鉴别结构相似的不同鉴别结构相似的不同化合物化合物2 2、定量上可以对、定量上可以对
2、单一组分单一组分或或多种混合组多种混合组分进行测定分进行测定3 3、推断、推断化合物的分子结构化合物的分子结构第十章 紫外-可见分光光度法第一节第一节 第十章 紫外-可见分光光度法电子 饱和的键 电子 不饱和的键 n电子紫外紫外-可见吸收光谱是分子中的可见吸收光谱是分子中的价电子价电子在不同在不同的的分子轨道分子轨道之间跃迁而产生的。之间跃迁而产生的。第十章 紫外-可见分光光度法两个原子的原子轨道以线两个原子的原子轨道以线性组合成两个分子轨道。较低能量的为成键轨道，性组合成两个分子轨道。较低能量的为成键轨道，较高能量的为反键轨道较高能量的为反键轨道第十章 紫外-可见分光光度法*n*n*饱和烃（
3、甲烷，乙烷）饱和烃（甲烷，乙烷）如：乙烷的如：乙烷的max=135nm第十章 紫外-可见分光光度法*n*n*含杂原子饱和基团含杂原子饱和基团（OH，NH2）第十章 紫外-可见分光光度法*n*n*不饱和基团不饱和基团（CC，C O）如：如：丁二烯的丁二烯的max=217nm第十章 紫外-可见分光光度法*n*n*n*跃迁跃迁含杂原子不饱和基团含杂原子不饱和基团（C N，C O）如：丙酮的如：丙酮的max=279nm第十章 紫外-可见分光光度法 用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁；电荷迁移跃向与接受体相联系的轨道上跃迁；电荷迁移跃迁实
4、质是一个迁实质是一个内氧化内氧化-还原过程还原过程，相应的吸收，相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱光谱称为电荷迁移吸收光谱-hvNRR12电子 接受体给予体电子NRR摩尔吸收系数较大摩尔吸收系数较大,灵敏度高灵敏度高第十章 紫外-可见分光光度法 对于能量不等的对于能量不等的d轨道和轨道和f轨道，当它们的轨道，当它们的离子吸收光能后，低能态的离子吸收光能后，低能态的d电子或电子或f电子可以电子可以分别跃迁至高能态的分别跃迁至高能态的d或或f轨道，这两类跃迁分轨道，这两类跃迁分别称为别称为d-d 跃迁和跃迁和f-f 跃迁。跃迁。由于这两类跃迁必须在配体的配位场作由于这两类跃迁必须在配体的配位场作用
5、下才可能发生，因此又称为配位场跃迁。用下才可能发生，因此又称为配位场跃迁。与电荷迁移跃迁比较与电荷迁移跃迁比较,摩尔吸收系数较小摩尔吸收系数较小第十章 紫外-可见分光光度法曲线上吸光度曲线上吸光度最大的地方，最大的地方，对应对应峰与峰之间吸峰与峰之间吸光度最小的部光度最小的部位，对应位，对应吸收峰旁产生吸收峰旁产生的曲折的曲折短波端呈现强短波端呈现强吸收而不成峰吸收而不成峰形的部分形的部分第十章 紫外-可见分光光度法能吸收紫外能吸收紫外-可见光的基团可见光的基团有机化合物：具有有机化合物：具有不饱和键不饱和键和和未成对电子未成对电子的基团的基团 具有具有n 电子电子和和电子电子的基团的基团 例
6、：例：CC；CO；CN；NN 本身无紫外吸收，但可使生色团吸收峰加强本身无紫外吸收，但可使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：例：OH，OR，NH，NR2，X第十章 紫外-可见分光光度法由于化合物结构变化（共轭、由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂引起引入助色团取代基）或采用不同溶剂引起红移（长移）：红移（长移）：吸收峰位置向长波方向的移动吸收峰位置向长波方向的移动蓝移（短移）蓝移（短移）：吸收峰位置向短波方向移动：吸收峰位置向短波方向移动 增色效应：增色效应：吸收强度增强的效应吸收强度增
7、强的效应 减色效应：减色效应：吸收强度减小的效应吸收强度减小的效应 Max104 强带强带 Max102 弱带弱带第十章 紫外-可见分光光度法第十章 紫外-可见分光光度法跃迁类型跃迁类型波长（波长（nm）max其他特征其他特征250-500104230-270200180（E1）200（E2）104103精细结构：电子自旋轨道相互作用引精细结构：电子自旋轨道相互作用引起的原子能级多重分裂结构起的原子能级多重分裂结构第十章 紫外-可见分光光度法苯的苯的B带吸收光谱带吸收光谱电子自旋轨道相互作用引起的原子电子自旋轨道相互作用引起的原子能级多重分裂结构能级多重分裂结构第十章 紫外-可见分光光度法第十
8、章 紫外-可见分光光度法核心核心:对分子中电子共轭结构的影响对分子中电子共轭结构的影响第十章 紫外-可见分光光度法如如:顺式结构有立体阻碍顺式结构有立体阻碍,苯环不能苯环不能与乙烯双键在同一平面上与乙烯双键在同一平面上,不易不易产生共轭产生共轭第十章 紫外-可见分光光度法如如:284nm 出现一出现一R带带 max238nm C=O的的轨道与轨道与S杂原子杂原子的的P轨道能有效交盖轨道能有效交盖 第十章 紫外-可见分光光度法对吸收光谱精细结构影响对吸收光谱精细结构影响：第十章 紫外-可见分光光度法对对max影响：影响：第十章 紫外-可见分光光度法激发态的极性比基态极性大，激发态与极性溶激发态的
9、极性比基态极性大，激发态与极性溶剂之间相互作用所降低的能量大剂之间相互作用所降低的能量大,故向长移故向长移基态极性大，基态极性大，n电子与极性溶剂之间形成较强电子与极性溶剂之间形成较强的氢键，使基态能量降低大于反键轨道与极性溶剂相互的氢键，使基态能量降低大于反键轨道与极性溶剂相互作用所降低的能量，因而越迁所需能量变大，故向短移作用所降低的能量，因而越迁所需能量变大，故向短移第十章 紫外-可见分光光度法影响物质存在型体，影响吸收波长影响物质存在型体，影响吸收波长第十章 紫外-可见分光光度法描述物质对单色光吸收强弱与描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度液层厚度和和待测物浓度待测物浓度的关系的关系CA
10、BeerlALamber定律：定律：第十章 紫外-可见分光光度法当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其其吸光度吸光度与与光通过的液层厚度光通过的液层厚度成正比成正比 A=E2l（适用于所有均匀介质）（适用于所有均匀介质）当一适当波长的单色光通过溶液时，若当一适当波长的单色光通过溶液时，若液层厚液层厚度一定度一定，则，则吸光度吸光度与与溶液浓度溶液浓度成正比成正比 A=E1C（仅适用单色光）（仅适用单色光）第十章 紫外-可见分光光度法吸光度吸光度(absorbance):A=-lgT=EClA=-lg I/I0 =-lg T =EClT=10-
11、A=10-EClLambert-Beer定律定律E:吸收系数吸收系数第十章 紫外-可见分光光度法Lambert-Beer定律定律1、入射光为单色光、入射光为单色光2、溶液是稀溶液、溶液是稀溶液 Lambert-Beer定律定律A=-lgT=EClT=10-A=10-ECl第十章 紫外-可见分光光度法单位浓度、单位厚度的吸光度单位浓度、单位厚度的吸光度温度，溶剂，温度，溶剂，AEC l 第十章 紫外-可见分光光度法1、1%110cmMEE1%1cm第十章 紫外-可见分光光度法例：已知例：已知Fe2+C：0.5mg/L l：2 cm A：0.19(508nm）求：求：，E1%?1cm解：解：C(F
12、e2+)=8.910-6mol/LA=Cl0.510-355.85=ACl=1.1104(L/mol.cm)=0.19/(28.910-6)E1%1cm=10=2.0 103(ml/g.cm)1.110455.85第十章 紫外-可见分光光度法依据Beer定律，A与C关系为经过原点的直线（一）化学因素（一）化学因素（二）光学因素（二）光学因素AE C l偏离Beer定律的主要因素为第十章 紫外-可见分光光度法（一）化学因素（一）化学因素离解、缔合、溶剂化、形成新化合物等因素发生偏离Cr2O72-+H2O 2HCrO-4 2H+2CrO42-例：例：橙色橙色黄色黄色第十章 紫外-可见分光光度法随单
13、体浓度随单体浓度增大增大,660nm660nm处吸收峰处吸收峰减弱减弱；610nm610nm处吸收峰处吸收峰增强增强；吸收光谱；吸收光谱形状改变形状改变。第十章 紫外-可见分光光度法（二）光学因素（二）光学因素 照射物质的光经单色器分光后并照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光，而是具有一定波非真正单色光，而是具有一定波长范围的光，长范围的光，物质对不同波长的物质对不同波长的光有不同的吸收系数光有不同的吸收系数，产生，产生偏离偏离波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定或光栅的分辨率决定第十章 紫外-可见分光光度法12010212IIII设入射光由波长为
14、 和 的光组成入射光光强分别为和对应的透过光光强分别为 和010EC lII12211010212010201020102010210101010E C lE C lEEC lE C lIIIITIIIIIIII（）又2101021010210lglgEEC lIIATE C lII （）第十章 紫外-可见分光光度法2101021010210lglgEEC lIIATE C lII （）入射光谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状入射光谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状 结论：结论：选择较纯单色光（选择较纯单色光（，单色性，单色性）1211221EEAEC lEEACBeerEEAC成线性
15、关系与 不成线性关系，偏离定律（）与 偏离线性关系越严重第十章 紫外-可见分光光度法 仪器本身缺陷仪器本身缺陷 光学元件污染光学元件污染使吸收光谱变形，吸光度变值使吸收光谱变形，吸光度变值 在末端吸收处出现假峰在末端吸收处出现假峰第十章 紫外-可见分光光度法 散射和反射使散射和反射使T，A，吸收光谱变形，吸收光谱变形一般可用空白对比校正消除一般可用空白对比校正消除使光程使光程，A，吸收光谱变形，吸收光谱变形第十章 紫外-可见分光光度法(三三)透光率的测量误差透光率的测量误差T影响测定结果的相对误差两个因素：影响测定结果的相对误差两个因素：T和和T 1）暗噪音）暗噪音(与光讯号无关与光讯号无关)
16、2）散粒噪音）散粒噪音(随光讯号强弱而变化随光讯号强弱而变化)1lglgAATE C lCE lE lT 0.434lgCTCTT浓度的相对误差第十章 紫外-可见分光光度法不同不同T(或或A)值浓度测量的相对误差值浓度测量的相对误差(T=0.5%)0.434lgCTCTT浓度的相对误差1）暗噪音）暗噪音与与检测器和放大电路不确切检测器和放大电路不确切性有关性有关,与光讯号无关与光讯号无关第十章 紫外-可见分光光度法暗噪音暗噪音()与讯号噪音与讯号噪音(-)的的误差曲线误差曲线说明：吸光度测量的适宜读数范围说明：吸光度测量的适宜读数范围A值：值：0.20.7T值：值：0.200.62当当 T=0
17、.368（A=0.434）时，）时，浓度测量的相对误差最小浓度测量的相对误差最小控制方法：控制方法：（1）调节被测液的浓度）调节被测液的浓度 （2）选择不同厚度的吸收池）选择不同厚度的吸收池0.368第十章 紫外-可见分光光度法0)lg()lg434.0(434.0)lg434.0(2TTTTTTTdTd对应最小的测量误差，%80.36434.0lgTT第十章 紫外-可见分光光度法2）讯号噪音）讯号噪音与光讯号有关与光讯号有关表明测量误差较小的范表明测量误差较小的范围一直围一直可延至较高吸光可延至较高吸光度区度区，对测定有利，对测定有利 0.43411lgCKCTT第十章 紫外-可见分光光度法
18、第二节第二节 第十章 紫外-可见分光光度法光源光源单色单色器器检测器检测器吸收池吸收池讯号处理讯号处理及显示器及显示器分光光度计主要部件方框示意图分光光度计主要部件方框示意图：以以可见光可见光作光源，经单色光作光源，经单色光器分光后，以器分光后，以所需波长的单色光作入射光所需波长的单色光作入射光，通过，通过测定溶液吸光度来计算被测物质含量的一种方法测定溶液吸光度来计算被测物质含量的一种方法第十章 紫外-可见分光光度法0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示第十章 紫外-可见分光光度法光源光源光源稳定，足够光强度光源稳定，足够光强度钨灯钨灯：3203200nm入射光的光源要
19、求：入射光的光源要求：氘灯氘灯：150400nm第十章 紫外-可见分光光度法单色器单色器组成：组成：光栅或棱镜、狭逢、准直器光栅或棱镜、狭逢、准直器准直镜准直镜棱镜棱镜出光狭缝出光狭缝入光狭缝入光狭缝单色器示意图单色器示意图白光白光入光狭缝入光狭缝准直镜准直镜棱镜或光栅棱镜或光栅 色散后的光色散后的光准直镜准直镜出光狭缝出光狭缝 转动棱镜或光栅转动棱镜或光栅 出光狭缝处获出光狭缝处获单色光单色光第十章 紫外-可见分光光度法600棱镜对光的色散棱镜对光的色散单色光器单色光器波长越短，传播速度愈慢，波长越短，传播速度愈慢，折射率就愈大折射率就愈大狭逢宽度应适中，太宽，单色光纯度差狭逢宽度应适中，太
20、宽，单色光纯度差 太窄，光通量小，影响灵敏度太窄，光通量小，影响灵敏度第十章 紫外-可见分光光度法吸收池吸收池吸收池吸收池石英，玻璃石英，玻璃 比色皿比色皿玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于光，仅适用于可见光区可见光区石英石英不能吸收紫外光，适用于不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区紫外和可见光区第十章 紫外-可见分光光度法检测器检测器光电管光电管两极间加电压，线路中产生电流两极间加电压，线路中产生电流光电流大小与照射光强度成正比光电流大小与照射光强度成正比光光 光敏阴极光敏阴极 阴极表面放电子阴极表面放电子光电管工作线路示意图光电管工作线路示意图入射光入射光放大器放大器记录器记录器+-阳极
21、阳极阴极阴极(光敏材料如氧化铯光敏材料如氧化铯)高电阻高电阻第十章 紫外-可见分光光度法 图图12-11 光电倍增管的结构和原理示意图光电倍增管的结构和原理示意图（2）光电倍增管）光电倍增管第十章 紫外-可见分光光度法讯号处理讯号处理及显示器及显示器吸光度与百分透光度标度吸光度与百分透光度标度2.0 1.00.7 0.6 0.50.40.30.2 0.15 0.10.050 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100AT(%)721型分光光度计采用指针式的微安表型分光光度计采用指针式的微安表A的刻度不均等?第十章 紫外-可见分光光度法图图12-5 721分光光度计光学系统示意
22、图分光光度计光学系统示意图产生电信号产生电信号微安表微安表标尺上读标尺上读A光源光源聚光镜聚光镜反射镜反射镜吸收池吸收池光电管光电管狭缝狭缝准直镜准直镜棱镜棱镜第十章 紫外-可见分光光度法第三节第三节 第十章 紫外-可见分光光度法（一）定性鉴别（一）定性鉴别 吸收光谱的形状吸收光谱的形状 吸收峰的数目吸收峰的数目 吸收峰的位置（波长）吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度吸收峰的强度 相应的吸光系数相应的吸光系数第十章 紫外-可见分光光度法同一测定条件下，与标准对照物同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较谱图或标准谱图进行对照比较如果两者完全相同，如果两者完全相同，可能是同一种化合物
23、可能是同一种化合物；如两者有差别，如两者有差别，则则肯定不是同一种化合物肯定不是同一种化合物max1%14(240)(390)(1.57 10)cmnmE第十章 紫外-可见分光光度法1%max1maxnmicmE，第十章 紫外-可见分光光度法例：例：122783615503613612785501.70 1.883.15 3.45VBAAAA药典规定定性鉴别：，三处最大吸收，111222AEClEAE ClE第十章 紫外-可见分光光度法 不同化合物中可以有很类似、甚至不同化合物中可以有很类似、甚至雷同的吸收光谱，所以得到相同的吸收雷同的吸收光谱，所以得到相同的吸收光谱，也可能是另一物质。光谱，
24、也可能是另一物质。第十章 紫外-可见分光光度法找找使主成分无吸收，杂质有吸收使主成分无吸收，杂质有吸收直接考察杂质含量直接考察杂质含量如：乙醇中含有杂质苯，苯在256nm处有吸收，而乙醇无吸收杂质强吸收杂质强吸收 主成分吸收主成分吸收与纯品比较，与纯品比较，E，光谱变形，光谱变形第十章 紫外-可见分光光度法-0.05mol/L的HCL溶液，下测定 规定 即符合要求的杂质限量1%14330.05435 11.1 10/1001.1 10/1.1 10%1000.06%2cmACElgmlmg ml肾上腺酮第十章 紫外-可见分光光度法（一）单组分的定量方法（一）单组分的定量方法1吸光系数法吸光系数
25、法 2标准曲线法标准曲线法 3对照法：外标一点法对照法：外标一点法AEC l第十章 紫外-可见分光光度法()/(/)EiW giC g mLAC 稀释已知过程：样 含求/100iACgmLE l/iACmol Ll或例：维生素例：维生素B B12 12 的水溶液在的水溶液在361nm361nm处的百分吸光系数为处的百分吸光系数为207207，用，用1cm1cm比色池测得某维生素比色池测得某维生素B B1212溶液的吸光度是溶液的吸光度是0.4140.414，求该溶液的浓度，求该溶液的浓度解：解：0.4140.00200/10020.0/207 1gmLg mClLAE第十章 紫外-可见分光光度
26、法配制配制-系列标准溶液系列标准溶液显色显色分别测定其分别测定其A值（值（max）绘制标准曲线绘制标准曲线测测A待测待测(条件同上条件同上)从标准曲线上求从标准曲线上求c待测待测AcAxcx第十章 紫外-可见分光光度法第十章 紫外-可见分光光度法cx=AxAs cs配制标准溶液配制标准溶液cs测测As同条件下测被测液同条件下测被测液 Ax按上式求算按上式求算cx注意注意：（1）溶液符合朗伯）溶液符合朗伯-比尔定律比尔定律 （2）cs和和cx尽量接近尽量接近第十章 紫外-可见分光光度法例：例：维生素维生素B B1212的含量测定的含量测定 精密吸取精密吸取B B1212注射液注射液2.50mL2
27、.50mL，加水稀释至，加水稀释至10.00mL10.00mL；另；另配制对照液，精密称定对照品配制对照液，精密称定对照品25.00mg25.00mg，加水稀释至，加水稀释至1000mL1000mL。在。在361nm361nm处，用处，用1cm1cm吸收池，分别测定吸光度吸收池，分别测定吸光度为为0.5080.508和和0.5180.518，求，求B12B12注射液注射液的浓度以及标示注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该量的百分含量（该B12B12注射液的标示量为注射液的标示量为100g/mL100g/mL）解：解：2.50.50825.00 100098.1/100.5181000iiCCg mL12%100%98.1%iCB标示量标示量cx=AxAs cs第十章 紫外-可见分光光度法第十章作业第十章作业第第13,20题题
