1、作用机制研究的思路和方法 1.杀虫剂作用机制研究的思路和方法 n杀虫剂症状学(Symptomatology)是研究杀虫剂对靶标昆虫引起的中毒症状的科学。n从中毒症状可以推测其毒理作用,因此,症状学观察是研究杀虫剂作用机制最初的,然而也是最重要的一步。n必须指出的是同一杀虫剂对不同种类的昆虫乃至同种昆虫的不同虫态引起的症状可能不同。杀虫剂的作用机制乃是决定其症状的主要因杀虫剂的作用机制乃是决定其症状的主要因素。在某种程度上素。在某种程度上,我们可以通过观察其中毒症我们可以通过观察其中毒症状粗略地了解作用机制。状粗略地了解作用机制。1.1 症状学观察症状学观察神经毒剂 Example:DDT 按T
2、obias的描述,美洲蜚蠊中毒后典型症状表现为:足过度地伸张足过度地伸张,身体重心抬高身体重心抬高,站立不稳站立不稳;足及头部震颤足及头部震颤;步态失调步态失调,对外界刺激过度敏感对外界刺激过度敏感;腹部朝天仰卧腹部朝天仰卧,又努力翻身又努力翻身,多次重复进行多次重复进行;足痉挛足痉挛,包括两类动作包括两类动作,一是高频颤抖一是高频颤抖,二是大动作的屈、伸二是大动作的屈、伸;停止颤抖停止颤抖,只表现为跗节、触须、触角的孤立抽搐只表现为跗节、触须、触角的孤立抽搐;除心跳外除心跳外,完全静止不动直至真正死亡。完全静止不动直至真正死亡。有些昆虫自断式掉下的足有些昆虫自断式掉下的足(即自行离体的足即自
3、行离体的足)仍可继续进仍可继续进行特有颤抖。行特有颤抖。六六六和DDT症状大致相同,但作用更加迅速。按Pasguier(1947)的描述,沙漠蝗中毒后的症状为:n先兆期往往有腹部抬高的运动;n兴奋前期腹部收缩运动,并用后足摩擦;n过度兴奋及运动失调期对外界的刺激过度敏感,企图飞翔,但结果是不能飞而运动失调;n痉挛期仰卧或侧卧,肢体及口器抽搐,腹部伸长;n麻痹期;n昏迷期;n死亡。Example:BHC Example:有机磷杀虫剂TEPP Chadnick等以TEPP处理美洲蜚蠊:n先引起兴奋,试虫运动不停;n接着全身开始抽搐,足、翅及腹部颤抖;n然后进入麻痹状态,逐渐死亡 Example:天
4、然除虫菊酯 Klinger描述的鳞翅目幼虫的中毒症状:n背部隆起,迅速不停地爬动,头部左右摆动,口器咀嚼而不断地有食物吐出;n全身扭曲,翻滚,头尾收缩又伸直;n虫体侧卧静止,偶有微弱的抽搐,对外界刺激反应减少;n完全麻痹,但仍有心跳;n完全死亡。拟除虫菊酯杀虫剂,其对昆虫的中毒症状也是如此,只不过作用更加迅速。溴氰菊酯的中毒症状可划分为两个阶段,即兴奋期和抑制期。在兴奋期内,试虫乱爬乱动;到抑制期,活动逐渐减少直至麻痹。10多分钟后,试虫可能死亡亦可能复苏。呼吸毒剂 以鱼藤酮为代表,中毒症状主要是一个逐渐麻痹的过程,但对某些昆虫,可能先有一个兴奋过程,然后进入麻痹状态。Tischler对鱼藤酮
5、中毒的家蚕幼虫的症状作了如下的描述:n不活动,无明显反应(约35min);n短暂的兴奋期,频繁爬动(约10min);n运动失调、跌倒、侧卧(约5min);逐渐麻痹。肌肉毒剂 以尼亚那的杀虫有效成分ryanoid为代表,中毒症状：n不出现兴奋和抽搐,而是全身麻痹,肌肉松弛,对外界刺激无反应；n但在临近死亡时,肌肉又表现为强直性收缩状态。症状学观察应注意的问题不同的昆虫可能对同一种药剂有不同的症状表现，不同的昆虫可能对同一种药剂有不同的症状表现，应选择几种有代表性的不同的试虫进行症状学观察。应选择几种有代表性的不同的试虫进行症状学观察。同一药剂因剂量不同而对同一昆虫反应出来的症状同一药剂因剂量不同
6、而对同一昆虫反应出来的症状也不相同。如溴氰菊酯也不相同。如溴氰菊酯,在很低的剂量水平下在很低的剂量水平下,并无毒并无毒杀、击倒作用杀、击倒作用,而只表现拒食作用。因此而只表现拒食作用。因此,在观察症状在观察症状时时,应设置高、中、低几个剂量水平。应设置高、中、低几个剂量水平。天然产物杀虫剂的作用往往比化学合成杀虫剂的作天然产物杀虫剂的作用往往比化学合成杀虫剂的作用更复杂用更复杂,而且作用缓慢。因此而且作用缓慢。因此,在观察症状时不但要在观察症状时不但要观察试虫的急性中毒、死亡等症状观察试虫的急性中毒、死亡等症状,而且要较长时间而且要较长时间地观察其对行为的影响地观察其对行为的影响,观察其对生长
7、发育的影响。观察其对生长发育的影响。研究实例：苦皮藤素 菜青虫或粘虫幼虫取食少量染有苦皮藤素的叶片后,一般不再取食,有些试虫不断爬动,但大多数试虫静止不动。经过一段时间后,所有试虫都静止,但若用镊子触及幼虫腹部末端,试虫还会爬行。进入麻醉状态。触及腹部末端,试虫不再爬行,虫体瘫软,但反应并未完全消失,菜青虫个别试虫的头部还可微微扭动,但粘虫幼虫进入麻醉状态则对外界的刺激反应消失。有些试虫如果摄入毒物剂量小,则麻醉一段时间后试虫会苏醒,并可继续取食。另外苦皮藤素即使和微量的化学合成神经毒剂混用,试虫就不再表现上述这种麻醉作用。麻醉作用的选择性很强,即只对一部分鳞翅目幼虫起麻醉作用。一是物理的吸附
8、作用。二是可能是影响以谷氨酸为介质的神经肌肉接头的兴奋传导。三可能是一种肌肉毒剂,影响肌肉收缩。究竟作用机制如何,尚有待进一步研究。推测其作用机制推测其作用机制研究实例：苦皮藤素V试虫连续或间断取食一定量的染毒叶片后,一般不再继续取食。经过一段时间,试虫表现明显的兴奋症状,在培养皿内不断爬动,甚至翻滚;试虫虫体侧卧,前后弓缩,扭曲,抽搐。这段时间可持续2060min。一般在食毒后2h左右试虫失水,但不是体壁失水,而是表现为上吐下泻,乃至将试虫直肠挤出体外。这一阶段历时40160min。若试虫摄毒较多,失水多,则全部虫体呈水渍状,虫体极度缩短,体色不变,慢慢死亡;若摄毒较少,试虫失水不多,则可恢
9、复。另外另外 将苦皮藤素施于试虫体表,经HPLC检测,苦皮藤素可进入血淋巴中,但试虫却不表现任何中毒症状。苦皮藤素抑制或激活了中肠某些酶系,干扰了昆虫的正常代谢和生理功能。像霍乱毒素那样,活性亚基穿过肠细胞进入胞内,激活位于细胞膜内表面的腺苷酸环化酶,使环磷酸腺苷(cAMP)含量增加,刺激肠粘膜产生失水效应。像Bt的一内毒素那样直接作用于细胞膜上的受体,破坏了膜的结构,引起失水。推测其作用机制：是一个典型作用于昆虫消化系统的胃毒剂2 组织学观察组织学观察 n昆虫组织学是研究昆虫组织的细胞结构、组成和功能的科学。昆虫的组织是由细胞和非细胞结构所构成的,而若干组织又按各种形式组成器官。执行某些共同
10、机能的器官彼此组合在一起,形成器官系统,如神经系统、消化系统等等。n组织学的观察就是进行细胞学观察和器官组织学观察,其目的在于了解药剂对病变器官细胞的作用,包括对细胞膜(质膜)、细胞核及细胞质中各种细胞器,如线粒体、内质网、溶酶体等的观察,目的在于了解药剂的作用部位。组织学观察的方法组织学观察的方法 n光学显微镜观察光学显微镜观察 n光学显微镜的最大分辨能力约为0.2m,在这种分辨能力的显微镜下可以观察细胞内的结构,如线粒体、中心体、核仁等细胞内的显微结构。n核心的技术是制作高质量的石蜡切片。n电子显微镜观察电子显微镜观察n指透射电镜,主要用于观察各细胞器的细微结构病变。n电镜的基本结构和光学
11、显微镜差不多,所不同的是以电子束代替了照明光线,以特殊的电极或磁极代替了光学显微镜的聚光镜、物镜和目镜的作用。n核心技术是制作电镜标本。石蜡切片制作n取材、固定。取材、固定。将试虫迅速杀死,解剖后取出所要观察的组织,浸入固定液(如用波因氏或卡诺氏固定液),使细胞形态、结构尽可能保持活体时的状态。n冲洗、脱水。冲洗、脱水。固定一定时间后将材料取出用水将组织中的固定液彻底冲洗干净。然 后 再 脱 去 组 织 中 的 水 分。最 常 用 的 脱 水 剂 是 乙 醇。通 常 从30%50%70%80%90%100%逐级脱水。n透明、透蜡。透明、透蜡。脱水后的材料中含有脱水剂,不能与石蜡混溶,只能与透明
12、剂混溶。因此,脱水后应用透明剂(最常用的是二甲苯),以取代材料中的脱水剂。然后再以石蜡取代材料中的透明剂。n包埋。包埋。将透蜡后的材料浸入熔化了的石蜡中。石蜡冷固后就将材料包埋其中,便于切片和保存。n切片、贴片。切片、贴片。将被包埋的材料连同包埋块用切片机切片(厚度57m),并用明胶粘片剂将切片平整地粘在玻片上,干燥。n染色。染色。切片必须经染色才能清楚地显示细胞结构,便于观察。根据所用的固定液和显色的需要,选用合适的染料(如苏木精伊红)染色。石蜡切片经染色后就可进行显微观察。制作电镜标本 n将试虫快速杀死、将试虫快速杀死、解剖。解剖。以缓冲溶液冲洗后取出所需组织,切下材料块,体积应小于1mm
13、3。n将材料投入4%戊二醛中,在低温条件下作前固定处理固定处理。n取出材料,以缓冲溶液冲洗后用1%锇酸进行后固定处理后固定处理。n取出材料,用缓冲溶液冲洗后经系列丙酮脱水脱水,通常从50%70%80%90%100%。n脱水后以包埋剂,最常用的是环氧树脂(如Epon812)浸透包浸透包埋埋,在35,45,60各聚合1天。n超薄切片机切片切片,厚度大约500600nm。n以醋酸铀和柠檬酸铅双重染色双重染色。+苦皮藤素苦皮藤素对昆虫中肠细胞对昆虫中肠细胞 对照组处理组n对照组粘虫中肠柱状细胞顶膜微绒毛排列整齐有序(图1)，n线粒体双层膜完整，内嵴清晰可见(图5)，n细胞质密度高细胞器排列有序(图1)
14、，n粗面内质网排列整齐，表面附着大量的核糖体(图4)，n杯状细胞杯腔面突起呈排列整齐的微绒毛(图7)。n取食苦皮藤素V后，抽搐期柱状细胞顶膜微绒毛虽无明显变化(图2)，n但细胞器已开始瓦解密度降低(图2)；n线粒体肿胀，出现空白亮区(图6)；n内质网小池扩张，粗面内质网减少(图5)。n杯状细胞杯腔面微绒毛减少(图8)。n失水期，细胞及细胞器进一步瓦解(图3)，柱状细胞微绒毛数量减少、零乱(图3)，至失水末期几乎消失(图4)；n线粒体被严重破坏，外室水肿，嵴紊乱、模糊不清，双层膜亦不清晰(图7)。n内质网池扩张，囊泡化，粗面内质网大量减少(图6)。杯状细胞杯腔变大，微绒毛进一步减少(图9)。n苦
15、皮藤素V对细胞核、溶酶体及肌细胞无明显影响。3 生理生化研究生理生化研究 结合症状学和组织学观察的结果,我们可以粗略推测样品作用于昆虫的哪个系统,如神经系统,呼吸系统,消化系统,或体壁结构。在此基础上,针对某一系统与药剂毒理学密切相关的一些昆虫生理生化问题进行深入的研究。3.1体壁结构的生理生化指标测定体壁结构的生理生化指标测定 几丁质是高分子的含氮多聚糖,由乙酰胺基葡萄糖聚合而成,用以支撑体壁系统,一般占表皮干重的20%50%。测定体壁几丁质含量,就可以知道药物是否直接或间接地影响了昆虫表皮中几丁质的沉积。如果处理组试虫表皮几丁质含量显著降低,则进一步研究其作用机制,如测定几丁质酶、几丁质合
16、成酶等活性的变化。3.1.1 体壁几丁质含量的测定体壁几丁质含量的测定 测定昆虫表皮几丁质含量最简单的方法测定昆虫表皮几丁质含量最简单的方法重量法 Mayer测定厩螫蝇(Stomoxys calcitrans)蛹几丁质的方法:n将5头蛹放入试管,用玻棒捣碎。加入2ml 50%的KOH(W/W),在105条件下加热1h，KOH消化液经过干燥的、预先称重的25mm直径玻璃纤维滤纸过滤。滤渣在过滤器中先用100ml蒸馏水洗,然后用100ml 95%的乙醇洗,再用100ml蒸馏水洗。滤纸转入一称重的称量瓶内,100条件下干燥至恒重。这样测得的是几丁糖的量。n几丁糖的重量=干燥至恒重的重量-称量瓶重量-
17、滤纸重量 幼虫幼虫 n可将35头一组以蒸馏水冲洗体表,剪去头、尾和足,再沿腹中线剪开,除去附着于体壁的肌肉和脂肪体,以蒸馏水冲洗干净,再经95%、100%乙醇脱水,干燥。称取这种干燥体壁约300mg,放入消化试管,加入8ml饱和的KOH溶液,在甘油浴中加热到160,保持1520min。将消化后的试管内容物小心地倒在滤纸上,以缓慢流动的流水冲洗,然后以95%、100%乙醇脱水,烘干,称重。n体壁几丁质的相对含量(%)=消化后的体壁重/消化前的体壁重1.26100n式中,1.26为转换系数=乙酰基葡糖的分子量/胺基葡糖的分子量。3.1.2酪氨酸含量和酚氧化酶活性测定酪氨酸含量和酚氧化酶活性测定 n
18、新蜕皮的昆虫表皮新蜕皮的昆虫表皮,质地柔软质地柔软,经数小时后表皮变硬经数小时后表皮变硬,这这个过程称为表皮鞣化或骨化、硬化。这个过程往往总个过程称为表皮鞣化或骨化、硬化。这个过程往往总是伴随着表皮颜色加深是伴随着表皮颜色加深,由乳白色逐步变为褐色或黑色由乳白色逐步变为褐色或黑色,这个过程称为表皮的黑化或暗化。这个过程称为表皮的黑化或暗化。n如果蜕出的新表皮不及时地鞣化和暗化如果蜕出的新表皮不及时地鞣化和暗化,昆虫表皮就极昆虫表皮就极易破裂易破裂,昆虫将会死亡。昆虫将会死亡。n酪氨酸是昆虫表皮鞣化和暗化过程中起主要作用的氨酪氨酸是昆虫表皮鞣化和暗化过程中起主要作用的氨基酸。基酸。n昆虫中酪氨酸
19、有多种代谢途径昆虫中酪氨酸有多种代谢途径,其中之一是酪氨酸其中之一是酪氨酸多多巴巴多巴胺多巴胺N-N-乙酰多巴胺乙酰多巴胺,而而N-N-乙酰多巴胺是昆虫表乙酰多巴胺是昆虫表皮鞣化剂。皮鞣化剂。方法A 游离酪氨酸测定n在幼虫接近蜕皮或化蛹时,可测定血淋巴中游离酪氨酸含量,从而了解对表皮硬化的影响。n测定血淋巴中游离酪氨酸可用氨基酸自动分析仪,不但测酪氨酸,同时也测了其它氨基酸。B 测定酚氧化酶活性 酪氨酸N-乙酰多巴胺的反应过程中,必须有酚氧化酶的参与。因此,测定血淋巴中酚氧化酶的活性同样可以了解表皮鞣化和暗化。Ishaaya等的方法表皮酶源制备(家蝇幼虫)。酚氧化酶活性测定。3.2呼吸系统生理
20、生化指标测定呼吸系统生理生化指标测定 3.2.1 呼吸节律的测定呼吸节律的测定 陆生昆虫气门的开闭陆生昆虫气门的开闭,经常是有节律经常是有节律地进行地进行,以保证体内正常的呼吸代谢。以保证体内正常的呼吸代谢。不同种类的昆虫以及不同的虫态、不同种类的昆虫以及不同的虫态、龄期龄期,其呼吸节律有很大的变化其呼吸节律有很大的变化,但用相但用相同的标准试虫同的标准试虫,作药剂处理和不处理作药剂处理和不处理,测测定其呼吸节律作平行比较定其呼吸节律作平行比较,对于了解杀虫对于了解杀虫剂的作用机制还是很有意义的。剂的作用机制还是很有意义的。测定方法n测定昆虫呼吸节律采用红测定昆虫呼吸节律采用红外线二氧化碳分析
21、仪。外线二氧化碳分析仪。n红外线二氧化碳分析仪采红外线二氧化碳分析仪采用自动记录。用自动记录。n从记录仪上可以看出呼吸从记录仪上可以看出呼吸节律节律,当当COCO2 2含量上升时即含量上升时即为气门开启为气门开启,反之反之,为关闭为关闭,从而可算出开与关的周期。从而可算出开与关的周期。n还可算出单位试虫体重的还可算出单位试虫体重的呼吸量呼吸量,以便平行比较。以便平行比较。原理是原理是:nCOCO2 2可吸收红外线。可吸收红外线。n通过滤波片获得的通过滤波片获得的4.264.26mm波长的红外线穿过气室波长的红外线穿过气室,若若气室中无气室中无COCO2 2,则无红外线吸则无红外线吸收收,此时指
22、示值为零此时指示值为零;n若昆虫呼出若昆虫呼出COCO2 2,则则COCO2 2吸收吸收一部分红外线。一部分红外线。n红外线的变化将引起光电红外线的变化将引起光电池电信号的变化。记录这池电信号的变化。记录这种信号就可测得种信号就可测得COCO2 2浓度的浓度的变化。变化。3.2.2活体呼吸强度测定活体呼吸强度测定 n昆虫的呼吸强度反映了昆虫在某种状态下的生理代谢强度昆虫的呼吸强度反映了昆虫在某种状态下的生理代谢强度,通常以单位试虫体重在单位时间内的耗氧量来表示。通常以单位试虫体重在单位时间内的耗氧量来表示。n测定呼吸强度测定呼吸强度,广泛使用的是瓦勃呼吸仪测定法。广泛使用的是瓦勃呼吸仪测定法。
23、n由于昆虫的呼吸包括吸收氧气和释放二氧化碳两个过程由于昆虫的呼吸包括吸收氧气和释放二氧化碳两个过程,所以直接测定的结果是两种气体体积变化的总和。所以直接测定的结果是两种气体体积变化的总和。n如果在反应瓶中加入氢氧化钠以吸收释放的如果在反应瓶中加入氢氧化钠以吸收释放的COCO2 2,则测得的则测得的就是氧气体积的变化。就是氧气体积的变化。n呼吸强度呼吸强度=耗氧的体积耗氧的体积(l)/l)/试虫体重试虫体重(g)g)呼吸时间呼吸时间(min)min)1反应瓶 2侧管 3侧管塞4中央小杯 5三通活塞6“U”形管7橡皮管 8螺旋夹瓦勃呼吸仪的检压计和反应瓶瓦勃呼吸仪的检压计和反应瓶 n瓦勃呼吸仪是利
24、用反应瓶与U形检压计构成一个固定体积的恒温密闭系统。n试虫的呼吸在反应瓶中进行,呼吸引起的气体体积的改变,导致气压的改变,而这种气压的改变可利用U形管中胆酸钠溶液液柱的升降来检测。3.2.3 离体线粒体呼吸强度的测定离体线粒体呼吸强度的测定 n样品明显地影响呼吸节律或明显地降低呼样品明显地影响呼吸节律或明显地降低呼吸强度吸强度,但这并不一定就是样品直接作用于但这并不一定就是样品直接作用于活体昆虫的呼吸代谢活体昆虫的呼吸代谢,这是因为一些非呼吸这是因为一些非呼吸毒剂也可影响气门的开闭毒剂也可影响气门的开闭,从而影响呼吸节从而影响呼吸节律和呼吸强度。律和呼吸强度。n要证实样品是否对昆虫的呼吸代谢有
25、直接要证实样品是否对昆虫的呼吸代谢有直接的影响的影响,则应以离体的线粒体来测定其呼吸则应以离体的线粒体来测定其呼吸强度。强度。昆虫线粒体的制备可参考昆虫线粒体的制备可参考Lewis等采用的方法等采用的方法n30头5龄后期的玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼虫在冰冷的分离缓冲液中解剖。n缓冲液:蒸馏水含250mmolL-1蔗糖,1molL-1 EDTA、1mmolL-1 EGTA、10mmolL-1 HEPES和1%BSA。n取出中肠,除去围食膜等,以缓冲液洗涤3次后放入匀浆管,加入1ml分离介质,手动匀浆。n匀浆液在4条件下2500g离心10min。n收集悬浮物,在4、10000
26、g离心10min。n倾去上清液将沉淀中加入2.5ml冷缓冲液,搅起沉淀,同样条件下再离心10min,倾去上清液。n将沉淀悬浮在2.1ml分离介质中-12冷冻保存。瓦勃呼吸仪来测定离体线粒体的呼吸强度瓦勃呼吸仪来测定离体线粒体的呼吸强度及药物对线粒体呼吸的抑制作用及药物对线粒体呼吸的抑制作用 n在反应瓶中加入1.0ml上述线粒体制备液;0.1ml以2%葡萄糖溶解的己糖激酶;0.1ml 1.0molL-1的葡萄糖;0.1ml含有3.0molml-1 ATP、0.3molml-1 NADH、150molml-1葡萄糖、15molml-1 MgCl2和3.0molml-1 EDTA溶液,最后以Tris
27、缓冲液补充至总体积为3.5ml。n在反应瓶中央的小杯中放入浸有0.1ml 6.0MKOH的515mm的滤纸条。n在侧管中加入0.05ml 5.0molL-1的琥珀酸钠,待用。n将反应瓶在32水浴中平衡15min后,将侧管中的琥珀酸钠倾入反应瓶混合,开始测定,每5min记录一次,测定30min。这样测得正常线粒体的呼吸强度。n测定药物(样品)对呼吸的抑制,则应将样品以0.1ml 0.1 molL-1的Tris缓冲液(pH=7.4)溶解后加入反应瓶,测呼吸强度。n如果样品对离体线粒体呼吸确有明显的抑制作用,则可研究是影响了线粒体中三羧酸循环呢,还是影响了呼吸链的电子传递;亦或两者都受影响，进一步研
28、究具体影响了哪个环节。n进一步需测定ATP酶的活性、ATP的合成、电子传递等。3.3神经系统的生理生化指标测定神经系统的生理生化指标测定 n现有的商品化杀虫剂现有的商品化杀虫剂,绝大多数都是神经毒剂。绝大多数都是神经毒剂。生物活性天然产物生物活性天然产物,也有不少是神经毒剂也有不少是神经毒剂,像烟像烟碱、天然除虫菊素、毒扁豆碱、河豚毒素等。碱、天然除虫菊素、毒扁豆碱、河豚毒素等。n就目前已知的知识而论就目前已知的知识而论,神经毒剂主要有两个神经毒剂主要有两个方面的作用机制。一是干扰某种或某几种对神方面的作用机制。一是干扰某种或某几种对神经兴奋传导起关键作用的酶经兴奋传导起关键作用的酶(如乙酰胆
29、碱酯酶如乙酰胆碱酯酶),),二是干扰神经细胞离子的穿透平衡。二是干扰神经细胞离子的穿透平衡。n生理生化指标的测定方法一是酶学的方法生理生化指标的测定方法一是酶学的方法,二二是电生理的方法。是电生理的方法。神经冲动和杀虫剂作用示意图神经冲动和杀虫剂作用示意图（Bloomquist J.R.，1999）3.3.1 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定活性测定 测定乙酰胆碱酯酶测定乙酰胆碱酯酶(AChEAChE)的方法较多，常用的方法较多，常用EllmanEllman(1961)(1961)的方法。的方法。n此法具有灵敏度高、简便此法具有灵敏度高、简便,有一定专一性等特点；有一定专一性等特点
30、；n但由于硫代胆碱但由于硫代胆碱(ASChASCh)和二硫双对硝基苯甲酸和二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)DTNB)的的反应受介质反应受介质pHpH的的影响的的影响,测定测定pHpH限制在限制在6.56.58.58.5范围范围;n由于蛋白质游离由于蛋白质游离SHSH基和基和DTNBDTNB的干扰反应的干扰反应,对于粗酶源亦对于粗酶源亦不适用；不适用；n此外此外,以毒扁豆碱作为酶反应的终止剂以毒扁豆碱作为酶反应的终止剂,对于变构的对于变构的 AChE AChE,毒扁豆碱不能完全抑制其活性；毒扁豆碱不能完全抑制其活性；n为此为此,GorunGorun等等(1978)(1978)将将EllmabEll
31、mab法进行了修改法进行了修改,使之更完善。使之更完善。具体方法 n酶反应体系的最终体积为酶反应体系的最终体积为0.20.2ml,ml,含含2020m molm molL L-1-1磷酸盐磷酸盐缓冲液缓冲液(pH=7.6)pH=7.6)、0.10.10.8m mol0.8m molL L-1-1底物底物(AschAsch)、酶酶源量依具体材料而定源量依具体材料而定,一般调节蛋白质含量在一般调节蛋白质含量在40408080gg即可。即可。n25253030条件下保温条件下保温10103030min,min,反应结束。反应结束。n加入加入1818mlDTNBmlDTNB磷酸盐磷酸盐乙醇试剂乙醇试剂
32、(12.4(12.4mgDTNBmgDTNB,加入加入120120ml 96%ml 96%乙醇乙醇,80,80mlml蒸馏水蒸馏水,用用pH=7.6pH=7.6的的0.1 0.1 molmolL L-1-1的的磷酸盐缓冲液定容至磷酸盐缓冲液定容至250250ml)ml)显色并终止酶反应显色并终止酶反应,在在412412nmnm波长下测定光密度。波长下测定光密度。n调节透光度调节透光度100%100%的空白管在加入显色剂后应加入与测的空白管在加入显色剂后应加入与测定管等量的酶液定管等量的酶液,以消除酶液本身对光吸收的影响。以消除酶液本身对光吸收的影响。3.3.2 乙酰胆碱含量乙酰胆碱含量(ACh
33、)测定测定 n测定测定ACh ACh 的方法有多种的方法有多种,如生物测定法、气相色谱质谱如生物测定法、气相色谱质谱联用法、放射酶法及放射免疫分析法。联用法、放射酶法及放射免疫分析法。n但生物测定法费时且特异性差但生物测定法费时且特异性差;n气质联用价格昂贵不适于一般实验室气质联用价格昂贵不适于一般实验室;n放射免疫测定法受抗体来源限制且有放射性污染等缺点。放射免疫测定法受抗体来源限制且有放射性污染等缺点。n因此因此,自自1983 1983 年年Potter Potter 等建立高效液相色谱等建立高效液相色谱电化学电化学检测器测定检测器测定AChACh方法以后方法以后,国外多采用此方法。国外多
34、采用此方法。n目前国内已改进建立了一种适合国内推广应用的高效液目前国内已改进建立了一种适合国内推广应用的高效液相相柱后衍生化柱后衍生化电化学检测器测定电化学检测器测定ACh ACh 的方法。的方法。具体方法 基本原理基本原理 n乙酰胆碱是胆碱和乙酸形成的酯,含季铵离子,呈强碱性,在任何pH 都呈离子状态,但它本身不能产生氧化还原反应。n样品流经反相高效液相色谱柱后分离得到乙酰胆碱,相继发生以下两个酶促反应后的终产物过氧化氢在玻碳电极表面氧化,氧化电流的大小可以反映乙酰胆碱的量。n胆碱经过第2步反应也可生成 H2O2,因此该方法可同时测定乙酰胆碱和胆碱。乙 酰 胆 碱 +H2O 胆 碱 +乙 酸
35、 胆 碱 酯 酶胆 碱 +H2O +2 O2 2H2O2 +甜 菜 碱 胆 碱 氧 化 酶 H2O2玻 碳 电 极+7 5 0 m VO2 +2 H+2 e方法方法 段文贞段文贞 屈志炜屈志炜 张均田张均田.用反相高效液相色谱用反相高效液相色谱柱后衍生化柱后衍生化电化学检测电化学检测器测定乙酰胆碱器测定乙酰胆碱.药学学报药学学报1997,32(12)920-9231997,32(12)920-923n衍生化酶柱的制备衍生化酶柱的制备 溴化氰活化的 Sepharose 4B 凝胶作为酶共价结合的支持介质。称取一定量的凝胶置G23 玻璃滤器内,按每克凝胶200 ml HCl 的量加入1 mmolL
36、-1HCl 膨胀和冲洗凝胶后,加少量键合缓冲液(0.1 molL-1 NaHCO3,含0.5 molL-1 NaCl,pH 8.3)冲洗凝胶。然后按酶活性单位(U)21 的量称取胆碱氧化酶和胆碱酯酶,溶于少量键合缓冲液中,将凝胶和酶混匀置于一小烧杯中避光,4 过夜,使酶共价结合到凝胶上。次日用一注射器均匀装入0.46 cm 5 cm(筛板5m)的不锈钢柱中。n组织样品处理组织样品处理 动物用微波照射或断头处死后,立即取脑称重,加入适量含内标的0.1 molL-1HClO4 匀浆,45000g 离心20 min,上清液即可进样。整个过程在冰浴中操作。若要同时测定组织中单胺递质含量,可将离心后的上
37、清液过Sephadex G10 凝胶柱,甲酸洗脱收集前2 ml 用于ACh测定;继后流出液可用于单胺递质及代谢产物含量测定。3.3.3 Na+,K+-ATP酶酶 Ca2+，Mg2+-ATP酶酶nATPATP酶是参与细胞能量转换及离子转运的关键酶类，广泛分布于各酶是参与细胞能量转换及离子转运的关键酶类，广泛分布于各类细胞质膜上。类细胞质膜上。nATPaseATPase的基本功能是催化的基本功能是催化ATPATP末端磷酸水解，并利用该反应产生的末端磷酸水解，并利用该反应产生的自由能来逆化学梯度进行各种离子如自由能来逆化学梯度进行各种离子如NaNa+、K K+、CaCa2+2+等浓度的相对恒等浓度的
38、相对恒度及渗透压的平衡，以保证细胞正常的信息传导或物质吸收等重度及渗透压的平衡，以保证细胞正常的信息传导或物质吸收等重要的生理功能。要的生理功能。n正常情况下，神经细胞膜内外正常情况下，神经细胞膜内外NaNa+，K K+分布差异很大，细胞内呈高分布差异很大，细胞内呈高K K+低低NaNa+，膜外为高膜外为高NaNa+低低K K+，这是保证神经冲动传导的必要条件之这是保证神经冲动传导的必要条件之一。一。nNaNa+-K-K+-ATPaseATPase被抑制时，使被抑制时，使NaNa+不能泵出，引起膜内不能泵出，引起膜内NaNa+浓度升高，浓度升高，膜电位发生变化，使神经膜处于持续兴奋状态，继而导
39、致神经系膜电位发生变化，使神经膜处于持续兴奋状态，继而导致神经系统功能紊乱，最终使昆虫死亡。统功能紊乱，最终使昆虫死亡。活性测定活性测定Na+,K+-ATP酶活性测定原理nNaNa+,K,K+-ATP-ATP酶和酶和CaCa2+2+、MgMg2+2+-ATP-ATP酶可分解酶可分解ATPATP成成ADPADP和无和无机磷（机磷（PiPi）。）。以每毫克蛋白每小时新产生的以每毫克蛋白每小时新产生的PiPi量为酶量为酶的活性单位，即的活性单位，即mol Pimol Pimgmg-1-1prpr-1-1hrhr-1-1。nNaNa+,K,K+-ATP-ATP酶的活性为反应体系中含酶的活性为反应体系中
40、含NaNa+,K,K+、MgMg2+2+时的时的总酶活性与反应体系中无总酶活性与反应体系中无NaNa+,K,K+，而只有而只有MgMg2+2+的酶活性的酶活性或含有或含有NaNa+,K,K+-ATP-ATP酶的特异性抑制剂如哇巴因时酶活性酶的特异性抑制剂如哇巴因时酶活性之差值。之差值。nCaCa2+2+，MgMg2+2+-ATP-ATP酶活性则为反应体系中含酶活性则为反应体系中含CaCa2+2+时测定的时测定的总酶活性与反应体系中无总酶活性与反应体系中无CaCa2+2+时测得的酶活性之差值。时测得的酶活性之差值。家蝇脑突触体Na+-K+-ATPase活性测定 n肖丹青，冷欣夫，肖丹青，冷欣夫，
41、1994.1994.不连续不连续FicollFicoll密度梯度法分密度梯度法分离家蝇脑突触体离家蝇脑突触体.昆虫知识，昆虫知识，3131（2 2）：）：101-103101-103n田雨，冷欣夫，田雨，冷欣夫，1999.1999.溴氰菊酯对不同品系家蝇脑突触溴氰菊酯对不同品系家蝇脑突触体膜蛋白磷酸化及体膜蛋白磷酸化及ATPATP酶活性的影响酶活性的影响.昆虫学报，昆虫学报，4242（2 2）：）：113113119119n何运转，李梅，冯国蕾等，何运转，李梅，冯国蕾等，1999.1999.拟除虫菊酯对家蝇拟除虫菊酯对家蝇Na2K2ATPaseNa2K2ATPase抑制作用的研究抑制作用的研究
42、.昆虫学报，昆虫学报，4242（1 1）：）：191924243.3.4 环腺苷酸环腺苷酸(cAMP)含量的测定含量的测定 信号传导方式n一是神经介质直接与其受体(实际为受体离子通道复合物)相结合,从而引起受体一离子通道复合物的结构发生变化,改变了膜对特殊离子的通透性。n二是神经介质与后膜的受体相结合,引起受体A-环化酶的构象发生变化,使A-环化酶由非活性型变为活性型。活性型A-环化酶催化从ATP合成第二信使cAMP,后者作用于非活性的蛋白激酶,使其调节亚基解离,变为活性型蛋白激酶,催化蛋白质磷酸化,从而改变膜的通透性。昆虫中cAMP含量的方法(以家蝇为例)n每40头家蝇成虫为一个样品组,在2
43、0条件平衡1h,目的是使昆虫体内的生理生化状态趋于平衡。立即用液氮固定,取下蝇头,放入1ml匀浆器,加入400l 10%三氯乙酸进行匀浆。匀浆液在5000rmin-1下离心10min。取上清液,加入5倍体积的水饱和的乙醚萃取4次,以除去三氯乙酸。合并萃取液,蒸去乙醚即得cAMP样品。测定前以一定量的缓冲溶液稀释。n测定cAMP含量可采用氚标记的放射免疫法。标准的cAMP或样品,分别加入3HcAMP、蛋白激酶,在04条件下反应3h,反应后加入吸附剂,离心(3000rmin-1,6min)。取上清液200l加入闪烁液进行测定。以不同浓度的标准cAMP作标准曲线,范围为0.2516.0Pmol/50
44、l,样品的cAMP含量可从标准曲线或其回归方程算出。1.Hopkins,T.L.&L.L.Mardock 1976 J.Insect Physiol.22:11672.罗远,张宗炳 1987 昆虫学报 30(1):8123.王世真等.1975，放射免疫分析及其它放射体外测定方法 ，228，原子能出版社北京 3.3.5 神经电生理测定神经电生理测定 昆虫电生理技术,是深入进行药剂毒理学,特别是分子水平的作用机理研究中重要的实验技术。进行昆虫电生理方面的实验,需要专门的配套仪器和娴熟的操作技术。细胞外电极记录 细胞内微电极记录、电压钳记录 膜片钳全细胞记录技术 1.刘安西 陈守同 1990 昆虫电
45、生理学实验研究法 科学出版社 北京 2.张均田主编，1998.现代药理实验方法（下）.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，北京.3.3.5.1 生物材料的准备生物材料的准备 神经标本。通常以美洲蜚蠊或黑胸大蜚蠊雄成虫为材料制备中枢神经单纤维大轴突离体标本。a.离体腹神经索，T1-T3胸神经节，A1-A6腹神经节；b.A5-A6腹神经节间已剥离的单根中间神经元大轴突；c.A5-A6节间横切面示大轴突位置。分别称GI1,GI2,GI3,GI7。一、剥离出包括尾须神经在内的整条神经索,其中第6腹神经节是尾须感觉神经元进入中枢神经元的突触所在连接点,而尾须神经由X和XI两条神经组成,分别具有抑制和
46、兴奋的功能。二、将第5和第6腹神经节间腹神经索的两股神经分开,再将其中一股神经外面的结缔组织神经鞘剥离,小心分离出中间神经元大轴突2(简称GI),剪断其余神经纤维。神经肌肉标本 通常以正常型果蝇3龄幼虫为材料n果蝇幼虫腹纵肌细胞(每体节有8个,腹中线两侧各4个),均为单细胞,长约400m,宽80m,厚25m。n这些细胞,包括控制该体节一侧的运动神经和腹纵肌细胞的神经肌肉接头是真正测试的部位。na.解剖皿，示吸附于磁性橡皮上的6个小钩；nb.内部解剖，示脑、咽下神经节和肌肉，为胸节，1，2，8 为腹节；n c.第 腹节一侧放大，示4个腹纵肌细胞。离体昆虫神经细胞培养。棉铃虫Helicoverpa
47、 armigera 中枢神经细胞 n棉铃虫为累代饲养种群。n解剖棉铃虫3龄幼虫，迅速取出胸腺、神经节，置消化液（0.15%胶原酶，0.3%胰蛋白酶）中，孵育15min后，除去神经鞘，继续消化30min，然后移至培养液（TC-100与L-15等体积混合，3000mgL-1酵母提取物，2800mgL-1L水解乳蛋白，700mgL-1葡萄糖，400mgL-1果糖，1.0mmolL-1谷氨酰胺，0.6gL-1谷胱甘肽，80UmL-1庆大霉素，使用时增补10%胎牛血清，pH6.8）中；n用内径递减的玻璃管离散细胞，然后接种于35mm培养皿中，在271下静置培养24h。n待细胞贴壁后，选择直径2025m，
48、表面光洁的神经细胞，用于膜片钳实验。蜚蠊DUM神经元细胞 n由于人们对蜚蠊中枢神经系统电活性研究的相对比较透彻，因此被认为是探讨昆虫神经毒理的重要模型。n蜚蠊背中线神经节上有一种被称为非成对背中神经元（Dorsal unpaired median,DUM）的特殊神经细胞，与其它神经元的不同之处在于其胞体能够自发的产生超射动作电位。n膜片钳技术的使用使得DUM神经元成为中枢神经细胞中研究最为活跃的神经元之一。nDUM神经元细胞的分离培养方法与棉铃虫中枢神经细胞培养的方法基本相同，一般步骤如下：室温下解剖蜚蠊雄性成虫，除去内脏，剥离出包括完整尾须的整条神经索，剥去A6神经节的髓鞘，置于消化液（含胶
49、原蛋白酶1mgmL-1和透明酯酸酶1mgmL-1）中，孵育15min后，除去神经鞘，继续消化30min，然后移至培养液中。3.3.5.2 细胞外电极细胞外电极中枢神经兴奋性和抑制性突触后电位的引导中枢神经兴奋性和抑制性突触后电位的引导 n中枢神经兴奋性和抑制性突触后电位的引导以美洲蜚蠊离体腹神经索和中枢神经大轴突为材料,采用糖间隙法,将刺激电极与XI尾须神经相连,可引导复合兴奋性突触后电位(EPSP);n与X尾须神经相连,可引导复合抑制性突触后电位(IPSP)。换上包括尾须神经,第6-5神经节和节间的单根大轴突,并将XI尾须神经与刺激电极相连,可引导单个的EPSP电位。n复合EPSP,复合IP
50、SP,单个EPSP及无刺激的自发突触后电位(spontaneous excitatory postsynaptic potential,SEPS)的波形图。图 蜚蠊中枢神经突触后电位(刘安西,陈守同,1990)a.自发突触后电位；b.复合突触后电位；c.单个兴奋性突触电位(单轴突),d抑制性突触后电位。举例：举例：EPSPs的测定的测定 标本槽四个小室：n室A放置尾须神经及尾须，并安置一对铂丝为刺激电极，同时刺激两侧尾须神经；n室B宽约0.8mm，放置A6节；n室C宽约1.2mm，放置A5与A6之间的神经索；n其余部分放于D 室。n小室之间间隔约0.6mm，用凡士林封闭缺口以防止各室溶液相通。
