1、第六章第六章 基因工程基因工程genetic engineeringgenetic engineering 生物技术工程生物技术工程（biotechnology biotechnology engineering)engineering)基因工程基因工程蛋白质工程蛋白质工程酶工程酶工程细胞工程细胞工程第一节第一节 基因工程的基本原理基因工程的基本原理一、基因工程技术的诞生及意义一、基因工程技术的诞生及意义 二、基因工程技术的基本原理二、基因工程技术的基本原理 克隆（克隆（cloneclone）指的是来自于同一指的是来自于同一始祖的相同分子、细胞、细菌或始祖的相同分子、细胞、细菌或动物群体动物群
2、体 重组重组DNADNA（recombinant DNArecombinant DNA）,用酶学用酶学方法，在体外将各种不同来源的方法，在体外将各种不同来源的DNADNA与载与载体体DNADNA连接成能自主复制的重组连接成能自主复制的重组DNADNA分子，分子，继而通过转化宿主细胞，并筛选出含有继而通过转化宿主细胞，并筛选出含有目的基因的转化细胞，再进行扩增获取目的基因的转化细胞，再进行扩增获取大量相同的大量相同的DNADNA分子，即分子，即DNADNA克隆。又称克隆。又称分子克隆（分子克隆（molecular clonemolecular clone），基因），基因克隆（克隆（gene cl
3、oninggene cloning）重组重组DNADNA技术（技术（recombinant DNA recombinant DNA technologytechnology）实现基因克隆所采用的实现基因克隆所采用的方法及其相关的工作统称重组方法及其相关的工作统称重组DNADNA技技术，术，又称基因工程。又称基因工程。第二节第二节 基因工程的物质基础基因工程的物质基础一、工具酶一、工具酶 主要包括主要包括 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA连接酶连接酶 逆转录酶逆转录酶 DNADNA修饰酶修饰酶 （一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶（restrict
4、ion endonucleaserestriction endonuclease）能识别特异的能识别特异的DNADNA序列，并在识序列，并在识别位点或其周围切割别位点或其周围切割DNADNA双链结构的双链结构的一类核酸内切酶，简称一类核酸内切酶，简称限制酶限制酶 1、限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型 型酶型酶型酶型酶 基因工程的基因工程的“手术刀手术刀”型酶型酶 2 2、限制性核酸内切酶的命名、限制性核酸内切酶的命名 EcoR I 属属 种种 株株 序序3 3、限制性核酸内切酶的性质和作用特点、限制性核酸内切酶的性质和作用特点 不同限制性核酸内切酶切割不同限制性核酸内切酶切割DNA
5、DNA分子分子产生的不同末端：产生的不同末端：黏性末端（黏性末端（sticky endsticky end或或cohesive endcohesive end），），又称黏端切口又称黏端切口 平末端或钝末端（平末端或钝末端（blunt endblunt end），也叫平端），也叫平端切口切口 同裂酶（同裂酶（isoschizomerisoschizomer）：来源不：来源不同但识别序列相同的限制酶称为同同但识别序列相同的限制酶称为同裂酶，又称异源同工酶裂酶，又称异源同工酶 如如SamSam与与XmaXma，Hpa IIHpa II和和MspMsp是成对的异源同工酶，二者的是成对的异源同工酶，二
6、者的识别序列相同，但酶切位点不同识别序列相同，但酶切位点不同 DNADNA重组体重组体GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAA AATTC GGCTTAA AATTC G限制性内切酶对双链限制性内切酶对双链DNADNA分子的切割与重组分子的切割与重组4 4限制性核酸内切酶的应用及影响因素限制性核酸内切酶的应用及影响因素 主要应用于以下方面：主要应用于以下方面：改造和构建新质粒；改造和构建新质粒；建立建立DNADNA物理图谱；物理图谱；基因组基因组DNADNA同源性研究；同源性研究；基因克隆；基因克隆；DNADNA分子杂交及序列分析，分子杂交及序列分析，制备制备DNADNA放
7、射性探针；放射性探针；DNADNA甲基化碱基的识别与切割甲基化碱基的识别与切割 影响限制酶反应的因素主要包括影响限制酶反应的因素主要包括 DNADNA的纯度的纯度 DNADNA甲基化程度与分子的结构甲基化程度与分子的结构 酶切反应的温度酶切反应的温度 酶切反应的时间酶切反应的时间 酶切反应的缓冲体系中离子强度酶切反应的缓冲体系中离子强度 二价金属离子浓度二价金属离子浓度 pHpH值值 （二）（二）DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）是催化）是催化以以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA的酶的酶 主要包括：主要
8、包括：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶 KlenowKlenow酶酶 逆转录酶逆转录酶 共同特点：能够将脱氧核糖核苷酸连共同特点：能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链续地加到双链DNADNA分子中引物链的分子中引物链的3 3-OH-OH 末端末端1 1大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol是由大肠杆菌是由大肠杆菌pol Apol A基因基因编码的一种单链多肽，分子量为编码的一种单链多肽，分子量为109kDa109kDa，具有三种活性：具有三种活性：5 5 33 聚合酶活性聚合
9、酶活性 5 5 33 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 3 55 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 2 2TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 最佳反应温度最佳反应温度70707575 具有具有 5 5 33 聚合酶活性和聚合酶活性和5 5 33 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 主 要 用 于主 要 用 于 聚 合 酶 链 反 应聚 合 酶 链 反 应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）和和DNADNA序列测定。序列测定。3 3逆转录酶逆转录酶（reverse transcriptase，RT）全称是依赖全称是依
10、赖RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶(RNA-(RNA-dependent DNA polymerase)dependent DNA polymerase)所需模板可以是所需模板可以是RNARNA，也可以是，也可以是DNA DNA 产物产物DNADNA又称又称cDNAcDNA，即互补，即互补DNADNA（complementary DNAcomplementary DNA）具有具有5 5 33 聚合活性和聚合活性和3 3 55 RNARNA外切外切酶活性（酶活性（RNaseHRNaseH活性）或活性）或5 5 33 外切酶活外切酶活性性 目前使用的逆转录酶主要有两种目前使用的逆转录酶主要
11、有两种 禽源性禽源性 鼠源性鼠源性 逆转录酶的主要用途逆转录酶的主要用途 以以mRNAmRNA为模板合成为模板合成cDNAcDNA 补齐和标记补齐和标记DNADNA双链的双链的3 3 隐蔽末端隐蔽末端 以单链以单链DNADNA或或RNARNA为模板制备探针为模板制备探针 4 4Klenow Klenow 酶酶 又称又称KlenowKlenow片段片段 具有具有5 5 33 聚合活性和聚合活性和3 3 55 核酸外切核酸外切酶活性酶活性 在在DNADNA重组技术中的主要用途有：重组技术中的主要用途有：填补填补DNADNA双链的双链的3 3 隐蔽末端隐蔽末端 合成合成cDNAcDNA第二链第二链
12、DNADNA序列分析序列分析 随机引物末端标记随机引物末端标记DNADNA链的链的3 3 末端、末端、制备探针制备探针 5 5T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶 具有具有5 5 33 聚合活性和聚合活性和3 3 55 核酸外核酸外切酶活性切酶活性 用途与用途与KlenowKlenow片段类似，主用于剪切片段类似，主用于剪切3 3-末端突出的核苷酸，制作末端突出的核苷酸，制作DNA 3DNA 3端标端标记探针及记探针及DNADNA序列分析等序列分析等 (三三)DNA)DNA连接酶连接酶（DNA ligase）催化催化DNADNA中相邻的中相邻的5 5-磷酸基和磷酸基和3 3-羟羟基末端之间形成
13、磷酸二酯键，使基末端之间形成磷酸二酯键，使DNADNA单单链缺口连接起来，形成完整链缺口连接起来，形成完整DNADNA分子。分子。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶 3 3 5 5 失去磷酸二酯键的缺口失去磷酸二酯键的缺口连接酶封闭缺口连接酶封闭缺口DNADNA连接酶连接双链中的单链缺口连接酶连接双链中的单链缺口1.1.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 2.2.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl terminal deoxynucleotidyl transferasetransferase，TDTTDT）
14、3.3.多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶（polynuleotide kinasepolynuleotide kinase）(四四)其它其它DNADNA修饰酶修饰酶二、基因载体二、基因载体 载体（载体（vectorvector）是指能携带外）是指能携带外源源DNADNA分子进入受体细胞进行扩增分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具和表达的运载工具 具有自主复制能力具有自主复制能力 有多个单一限制酶的酶切位点或有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点（多克隆位点（multiple cloning multiple cloning sitesite，MCSMCS）具有一个或多个选择性遗传标记具有一个或
15、多个选择性遗传标记 分子量小分子量小 具有较高拷贝数具有较高拷贝数 具有较高的遗传稳定性具有较高的遗传稳定性DNADNA重组技术的载体应具备以下条件：重组技术的载体应具备以下条件：人工构建载体人工构建载体质粒质粒噬菌体噬菌体人工染色体人工染色体病毒载体病毒载体分类：分类：根据所对应的受体细胞不同根据所对应的受体细胞不同原核细胞载体原核细胞载体真核细胞载体真核细胞载体按其用途不同按其用途不同克隆载体克隆载体（cloning vector）表达载体表达载体（expression vector）(一一)克隆载体克隆载体 质粒（质粒（plasmidplasmid）是存在于细菌染色体）是存在于细菌染色体
16、之外的、具有自主复制能力的双链环状之外的、具有自主复制能力的双链环状DNADNA分子。分子。1 1、pBR322pBR322质粒质粒 pBR322 pBR322质粒由三种天然质粒质粒由三种天然质粒pSC101pSC101、ColE1ColE1和和pSF2124pSF2124构建而成，全长构建而成，全长4363bp 4363bp pBR322 pBR322图谱图谱 2 2、pUCpUC系列载体系列载体 pUC pUC系列载体是在系列载体是在pBR322pBR322质粒载质粒载体的基础上改建而成的体的基础上改建而成的 ，保留了，保留了pBR322pBR322的一部分，插入了一个来自的一部分，插入了
17、一个来自M13M13噬菌体并带有一段噬菌体并带有一段MCSMCS的的LacZLacZ 基基因，而发展为具有双重检测特性的因，而发展为具有双重检测特性的质粒载体。质粒载体。质粒质粒pUCpUC系列图谱系列图谱 3 3、穿梭质粒载体、穿梭质粒载体 穿梭质粒载体（穿梭质粒载体（shuttle plasmid shuttle plasmid vectorvector）是一类由人工构建的具有两种）是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。4 4、TATA克隆载体克隆载体 专为克隆专
18、为克隆PCRPCR产物而设计的，它产物而设计的，它们的共同点是在其多克隆位点两侧们的共同点是在其多克隆位点两侧的的3 3 末端携带有未配对的末端携带有未配对的T T碱基，多碱基，多克隆位点均位于克隆位点均位于 半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 肽肽编码区内并且都含有编码区内并且都含有T7T7启动子启动子 pBS-T pBS-T载体图谱载体图谱 pGM-T pGM-T载体图谱载体图谱 pCF-T pCF-T载体图谱载体图谱5 5、噬菌体载体、噬菌体载体 噬菌体（噬菌体（bacteriophagebacteriophage，phagephage）是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增是一类细菌病毒，可用于克隆和
19、扩增特定的特定的DNADNA片段，是广泛使用的基因片段，是广泛使用的基因克隆载体。克隆载体。主要有主要有噬菌体和噬菌体和M M1313噬菌体噬菌体 M M1313噬菌体噬菌体 6 6、酵母人工染色体载体、酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector，YAC）YACYAC主要包括以下调控元件：主要包括以下调控元件：着丝粒（着丝粒（centromerecentromere，CENCEN）端粒（端粒（telomeretelomere，TELTEL）复制起始点和限制性酶切位点复制起始点和限制性酶切位点 选择标记选择标记 原核序列及调控元件原核序列及调控元件
20、YAC YAC结构及其基因重组过程结构及其基因重组过程 细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（bacterial bacterial artificial chromosome vectorartificial chromosome vector，BACBAC）噬菌体噬菌体P1P1衍生的人工染色体（衍生的人工染色体（PACPAC）哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（MACMAC）7 7、逆转录病毒载体、逆转录病毒载体 逆转录病毒为单正链逆转录病毒为单正链RNARNA病毒，可高效感染病毒，可高效感染许多类型的宿主细胞，并稳定整合到宿主细胞许多类型的宿主细胞，并稳定整合到宿主细胞染色体上，是
21、最先被改造且应用最为广泛的病染色体上，是最先被改造且应用最为广泛的病毒基因载体。毒基因载体。构建的逆转录病毒载体主要有两类构建的逆转录病毒载体主要有两类:卸甲载体（卸甲载体（disarmed vectordisarmed vector）穿梭载体穿梭载体 8 8、腺病毒载体、腺病毒载体 腺病毒是无包膜的线性双链腺病毒是无包膜的线性双链DNADNA病毒病毒 ,基因组长约基因组长约36kb36kb，两端各有一个反向末端，两端各有一个反向末端重复区（重复区（inverted terminal repeatinverted terminal repeat，ITRITR），为病毒复制和包装所必需），为病毒
22、复制和包装所必需 基因组组成：早期转录区基因组组成：早期转录区 晚期转录区晚期转录区 RNARNA聚合酶聚合酶转录子转录子（二）表达载体（二）表达载体（expressing vector）表达载体是在受体细胞中表达外源表达载体是在受体细胞中表达外源基因的载体，它除了具有克隆载体所具基因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性质外，还需要有能表达外源基因有的性质外，还需要有能表达外源基因所必需的所必需的DNADNA序列序列 原核表达系统原核表达系统真核表达系统真核表达系统 1 1大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体 启动子启动子(promoter)(promoter)核糖体结合位点（核糖体结合位点（RB
23、SRBS）转录终止信号转录终止信号 表达元件表达元件pRSETpRSET载体载体 pIN-ompApIN-ompA载体载体2 2真核表达载体真核表达载体 质粒载体质粒载体(plasmid vector)(plasmid vector)病毒载体病毒载体(viral vector)(viral vector)常用的病毒载体：常用的病毒载体：腺病毒载体腺病毒载体 逆转录病毒载体逆转录病毒载体 SV40SV40 腺相关病毒载体腺相关病毒载体 pcDNA3.1pcDNA3.1载体载体第三节第三节 基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程 基因克隆过程主要包括：基因克隆过程主要包括：目的基因的获取目的基因的获
24、取基因载体的选择与构建基因载体的选择与构建基因载体与目的基因的连接基因载体与目的基因的连接DNADNA重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞含含DNADNA重组体细胞（转化子）或菌重组体细胞（转化子）或菌 落的筛选与鉴定落的筛选与鉴定 载体载体目的基因目的基因重组重组DNADNA分子分子细菌细菌转化或转染转化或转染扩增扩增筛选阳性克隆筛选阳性克隆基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程 一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)直接从基因组直接从基因组DNADNA中分离中分离(二二)化学合成法化学合成法(三三)逆转录法逆转录法 (四四)聚合酶链反应聚合酶链反应 (五五)从基因文库中筛选获得从基因文
25、库中筛选获得 二、基因载体的选择与制备二、基因载体的选择与制备 必须具有自主复制能力，拷贝数高，必须具有自主复制能力，拷贝数高，易与宿主细胞染色体易与宿主细胞染色体DNADNA分离分离 分子量小，易进行操作，并能容纳较分子量小，易进行操作，并能容纳较大的外源大的外源DNADNA分子；分子；与宿主细胞具有两个或多个易于筛选与宿主细胞具有两个或多个易于筛选的标记的标记有多个单一限制酶的酶切位点或多克有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点隆位点 三、三、DNADNA重组体的构建重组体的构建 目的基因与载体的连接与自然目的基因与载体的连接与自然界发生的基因重组不同界发生的基因重组不同,其本质上其本质上
26、是一个酶促反应过程，即在是一个酶促反应过程，即在DNADNA连连接酶的催化作用下，将外源接酶的催化作用下，将外源DNADNA分分子（目的基因）与载体子（目的基因）与载体DNADNA分子连分子连接成一个重组接成一个重组DNADNA分子（分子（DNADNA重组体）重组体）的过程的过程 （一）目的基因与基因载体的连接（一）目的基因与基因载体的连接 1 1、粘端连接法、粘端连接法2 2、平端连接法、平端连接法 3 3、人工接头连接法、人工接头连接法 4 4、同聚物加尾连接法、同聚物加尾连接法 5 5、T-AT-A克隆克隆 质粒质粒目的基因目的基因粘性末端粘性末端DNA重组重组+DNA连接酶连接酶错配错
27、配错配错配粘端连接法粘端连接法 质粒载体质粒载体外源外源DNADNA低效转化低效转化高效转化高效转化DNADNA连接酶连接酶定向克隆定向克隆 EcoEcoRR酶切位点酶切位点 PvuPvu酶切位点酶切位点EcoEcoRR酶切酶切PvuPvu酶切酶切粘性末端粘性末端平末端平末端DNADNA连接酶连接酶酶切质粒酶切质粒DNADNA体外重组体外重组 人工接头人工接头EcoEcoRR酶切质粒酶切质粒DNADNA连接酶连接酶利用人工合成的接头连接重组利用人工合成的接头连接重组DNADNA分子分子同聚物尾巴同聚物尾巴 同聚物加尾法连接重组同聚物加尾法连接重组DNADNA分子分子（二）影响目的基因与载体连接
28、的因素（二）影响目的基因与载体连接的因素 1 1、连接酶的抑制剂、连接酶的抑制剂2 2、连接反应条件、连接反应条件 3 3、目的基因与载体、目的基因与载体DNADNA的比例的比例 4 4、连接反应方法、连接反应方法、DNADNA末端的修饰等末端的修饰等 四、重组四、重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞 转化（转化（transformationtransformation）：重组体导入）：重组体导入原核细胞的过程原核细胞的过程转染（转染（transfection)transfection)：重组体导入真核：重组体导入真核细胞的过程细胞的过程感染（感染（infection)infection)
29、：病毒载体构建的重：病毒载体构建的重组体导入细胞（细菌）的过程组体导入细胞（细菌）的过程感受态（感受态（competencecompetence）：细胞（细菌）：细胞（细菌）处于容易接受外源处于容易接受外源DNADNA状态状态常见的介导基因转染方法主要有以下几种常见的介导基因转染方法主要有以下几种1 1磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法2 2脂质体（脂质体（liposomesliposomes）法）法 3 3DEAEDEAE（二乙氨乙基）（二乙氨乙基）-葡聚糖介导转染法葡聚糖介导转染法 4 4电穿孔（电穿孔（electroporationelectroporation）法）法 5 5显微注射法（显微
30、注射法（microinjectionmicroinjection）五、筛选与鉴定五、筛选与鉴定 筛选（筛选（ScreeningScreening）：从大量转化菌）：从大量转化菌落或噬菌斑中选择和鉴定出含有目落或噬菌斑中选择和鉴定出含有目的基因的菌株（细胞）的过程的基因的菌株（细胞）的过程（一）根据（一）根据DNADNA重组体表型筛选重组体表型筛选 1 1插入灭活法插入灭活法 2.2.互补筛选法互补筛选法 AmpAmpR RTetTetR R含氨苄青霉素的培养基含氨苄青霉素的培养基导入细菌导入细菌BamHBamH和和SallSall分别切割目的基因和载体分别切割目的基因和载体目的基因与载体连接目
31、的基因与载体连接AmpAmpR RTetTetS S 插入灭活法筛选插入灭活法筛选 XbatXbat和和SacSac切割目的基因和载体切割目的基因和载体目的基因和载体连接目的基因和载体连接导入细菌导入细菌含氨苄青霉素和含氨苄青霉素和X-GalX-Gal培养基培养基互补筛选的原理和基本过程互补筛选的原理和基本过程 （一）根据（一）根据DNADNA重组体表型筛选重组体表型筛选 （二）限制酶酶谱分析法（二）限制酶酶谱分析法（三）核酸分子杂交（三）核酸分子杂交 （四）（四）PCRPCR扩增法扩增法 （五）核酸序列测定（五）核酸序列测定 （六）免疫学方法（六）免疫学方法 第四节第四节 克隆基因的表达克隆
32、基因的表达 一、克隆基因在原核细胞中的表达一、克隆基因在原核细胞中的表达 1 1、适当改造或选择真核基因、适当改造或选择真核基因 2 2、必须选用合适的大肠杆菌为表达载体、必须选用合适的大肠杆菌为表达载体 3 3、在大肠杆菌中的表达方式、在大肠杆菌中的表达方式 分泌型表达分泌型表达 非融合蛋白表达非融合蛋白表达 融合蛋白表达融合蛋白表达4 4、受体菌株和诱导条件的选择、受体菌株和诱导条件的选择 （一）真核基因在大肠杆菌中表达的基本要求（一）真核基因在大肠杆菌中表达的基本要求（二）如何提高外源基因的表达水平（二）如何提高外源基因的表达水平 1 1、提高翻译水平、提高翻译水平 2 2、错开目的基因
33、表达与细菌生长的时间、错开目的基因表达与细菌生长的时间 3 3、提高目的蛋白的稳定性、提高目的蛋白的稳定性 二、克隆基因在真核细胞中的表达二、克隆基因在真核细胞中的表达（一）酵母表达系统（一）酵母表达系统 （二）哺乳动物细胞表达系统（二）哺乳动物细胞表达系统1 1启动子启动子 2 2增强子增强子 3 3剪接信号剪接信号 4 4终止信号和多聚腺苷酸（终止信号和多聚腺苷酸（Poly APoly A）化信号化信号 （三）哺乳动物细胞基因转染的筛选（三）哺乳动物细胞基因转染的筛选 1 1新霉素抗性基因新霉素抗性基因 2 2胸苷激酶（胸苷激酶（TKTK）基因）基因 3 3二氢叶酸还原酶基因二氢叶酸还原酶
34、基因 4 4氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶(CAT(CAT）基因）基因 （四）外源基因在真核细胞中的表达（四）外源基因在真核细胞中的表达 三、克隆基因在其它表达系统中的表达三、克隆基因在其它表达系统中的表达(一一)杆状病毒表达系统杆状病毒表达系统 (二二)果蝇表达系统果蝇表达系统 四、表达产物的分离纯化四、表达产物的分离纯化 第五节第五节 基因工程技术与医学的发展基因工程技术与医学的发展 一、疾病相关基因的分析一、疾病相关基因的分析 基因定位（基因定位（gene mappinggene mapping）：用某）：用某种方法将各种基因定位到染色体的具体种方法将各种基因定位到染色体的具体位置上，并分析基因的结构和疾病状态位置上，并分析基因的结构和疾病状态下基因的突变下基因的突变 二、对特定基因进行定点诱变二、对特定基因进行定点诱变 三、基因工程医药产品三、基因工程医药产品 四、基因诊断与基因治疗四、基因诊断与基因治疗
