1、 DNADNA分子的大小为49 Kb，其中的绝大多数基因都得到了确定和定位。基因图谱的一个特征是功能上相关的一系列基因在基因组中聚集在一起。这种簇集现象，在以噬菌体为基础的克隆载体构建中，也起着非常重要的作用。Lambda DNA is linear in viruscos sequence is 12 nucleotides and single strandedThe two cos sequences are complementaryReplicates by rolling ciricle in E.colito produce concatemerscos lambda DNA c
2、os etc etccos sequences hybridise in E.colito form circular genome可以插入超过可以插入超过10 Kb10 Kb的外源的外源DNADNA。该载体携带的。该载体携带的lacZlacZ基因上有一个多克隆位点接头，外源基因插入到多基因上有一个多克隆位点接头，外源基因插入到多接头上接头上6 6个酶切位点中的任何一个，都会使该基因失个酶切位点中的任何一个，都会使该基因失活，从而使得噬菌斑是无色清澈的而不是蓝色的。活，从而使得噬菌斑是无色清澈的而不是蓝色的。(2)ZAPIIred gamred gamP2 导入 外源DNA 取代无噬菌斑+P2
3、导入滚环复制-Spi 重组子的筛选重组子的筛选 3.5 3.5 基于基于M13M13噬菌体的载体噬菌体的载体 3.5.1 M13 3.5.1 M13纤维状噬菌体纤维状噬菌体 M13 M13是纤维状噬菌体的一个代表，在结构上与是纤维状噬菌体的一个代表，在结构上与噬噬菌体有着很大的不同。菌体有着很大的不同。M13 DNAM13 DNA分子比分子比DNADNA要小得多要小得多,仅有仅有6 4076 407个核苷酸。基因组为环状单链个核苷酸。基因组为环状单链DNADNA。M13M13的衣的衣壳仅仅是由壳仅仅是由3 3种不同的蛋白质组装而成，而种不同的蛋白质组装而成，而噬菌体的噬菌体的头尾结构则包含头尾
4、结构则包含1515种不同的蛋白质，而且种不同的蛋白质，而且M13M13的侵染周的侵染周期相对期相对来说也要简单一些，并不需要将基因插入到来说也要简单一些，并不需要将基因插入到宿主基因组中。宿主基因组中。M13-filamentous phageGene 9 proteinGene 6 proteinGene 3 proteinGene 8 proteinCircular ssDNADistal endProximal endGene 7 proteinuGenome:nSingle stranded circular DNA molecule,covalently closed,n6 407
5、nucleotidesn10 non overlapping genesnHoused in a flexible protein cylinderM13 M13 噬菌体基因组可编噬菌体基因组可编码码 3 3 类蛋白质，包括复类蛋白质，包括复制蛋白（基因制蛋白（基因 ，和和 ），形态发生蛋白），形态发生蛋白（基因（基因，和和 ），），结构蛋白（基因结构蛋白（基因 、和和 ）。）。所有结构蛋白在形态发所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细生之前都插入在宿主细胞的质膜中。胞的质膜中。M13 DNAM13 DNA分子通过分子通过大肠杆菌的纤毛大肠杆菌的纤毛进入细菌细胞进入细菌细胞在宿主细胞内，单链
6、在宿主细胞内，单链DNADNA分分子作为模板生成一条互补子作为模板生成一条互补链，形成正常的双链链，形成正常的双链DNADNA分分子（子（replication form,replication form,RFRF）。这个双链）。这个双链DNADNA分子不分子不会插入细菌基因组，但会会插入细菌基因组，但会持续复制直到细菌中的拷持续复制直到细菌中的拷贝数超过贝数超过100100。当细菌分裂。当细菌分裂时，每个子细胞都能得到时，每个子细胞都能得到一个或多个噬菌体基因组一个或多个噬菌体基因组的拷贝，这些拷贝也能继的拷贝，这些拷贝也能继续复制，以保证每个细胞续复制，以保证每个细胞具有恒定的拷贝数。具有
7、恒定的拷贝数。RF DNARF DNA再以滚环方式再以滚环方式进行复制，形成完整进行复制，形成完整的单链子代的单链子代DNADNA，接着，接着新合成的子代新合成的子代DNADNA被切被切下来，并进一步环化下来，并进一步环化形成单位长度的形成单位长度的M13M13基基因组因组DNADNA。游离的。游离的M13M13基因组基因组DNADNA被不断包装被不断包装成为成为M13M13噬菌体颗粒，噬菌体颗粒，并释放出来。每个被并释放出来。每个被侵染细胞在经过一代侵染细胞在经过一代复制后，都能够产生复制后，都能够产生 1 0001 000个新的噬菌体。个新的噬菌体。M13的侵染循环的侵染循环一个正常的一个
8、正常的M13M13噬菌噬菌体的基因组是体的基因组是6.4 Kb6.4 Kb，紧密排列着紧密排列着1010个基因，个基因，每一个基因对噬菌体每一个基因对噬菌体的复制都是必须的。的复制都是必须的。基因间有一长为基因间有一长为507 507 bpbp的短序列，外源的短序列，外源DNADNA片段必须从这里片段必须从这里插入才不会损伤其他插入才不会损伤其他的基因，同时还必须的基因，同时还必须保证该序列中的复制保证该序列中的复制起点不被破坏。显然，起点不被破坏。显然，只有一个很小的空间只有一个很小的空间可用于改造可用于改造M13M13噬菌噬菌体。体。M13M13噬菌体噬菌体DNADNA组织结构组织结构 M
9、13M13作为克隆载体的吸引力作为克隆载体的吸引力u它的基因组小于它的基因组小于10 Kb10 Kb，对一个潜在的载体来说恰，对一个潜在的载体来说恰好处于一个令人满意的范围内。好处于一个令人满意的范围内。uM13M13基因组的复制型非常像质粒，因此也能像质粒基因组的复制型非常像质粒，因此也能像质粒一样被处理。而且，一样被处理。而且，M13M13基因组容易从大肠杆菌培养基因组容易从大肠杆菌培养中获得，也能够通过转染而重新引入。中获得，也能够通过转染而重新引入。u以以M13M13为载体克隆基因，能够得到单链形式的为载体克隆基因，能够得到单链形式的DNADNA。单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥
10、作用，在单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥作用，在DNADNA测序和体外突变产生中尤为明显。测序和体外突变产生中尤为明显。3.5.2 M13mp23.5.2 M13mp2克隆载体的开发克隆载体的开发构建构建M13M13克隆载体的第一步，是把克隆载体的第一步，是把lacZlacZ基因导入到基因导入到噬菌体噬菌体M13M13的短序列中。这样就产生了的短序列中。这样就产生了M13mp1M13mp1，它在，它在含有含有X-galX-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。M13mp1的lacZ基因上不含有任何限制性酶切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一个GGATTC的序列。
11、改变一个核苷酸就变成了GAATTC，这是EcoR I的识别位点。M13mp2的lacZ基因的第6个密码子编码的是天冬酰氨而不是通常的天冬氨酸，但转染了M13mp2的细胞产生的-半乳糖苷酶仍然有着正常的功能。3.5.3 M13mp73.5.3 M13mp7对称的克隆位点对称的克隆位点 由于携带对称的克隆位点，用由于携带对称的克隆位点，用M13mp7M13mp7载体有一个很大载体有一个很大的好处，无论新的的好处，无论新的DNADNA是通过是通过BamBamH H I I，SalSal I I或或PstPst I I中中的哪一个酶切位点插入载体，都可以用的哪一个酶切位点插入载体，都可以用EcoREc
12、oRI I从重组体从重组体中切除。中切除。3.5.4 3.5.4 M13mp8/9M13mp8/9载体载体 越精巧的越精巧的M13M13载体越有更复杂的多接头被插入到载体越有更复杂的多接头被插入到lacZlacZ基因中。基因中。M13mp8M13mp8是是pUC8pUC8的对应物。和的对应物。和pUC8pUC8一一样，样，它允许具有两个不同粘性末端的它允许具有两个不同粘性末端的DNADNA片段的插入。片段的插入。M13mp9 M13mp9是是M13mp8M13mp8的姐妹载体，它有一个与的姐妹载体，它有一个与M13mp8M13mp8相同的多接头，但是方向相反，当把一个相同的多接头，但是方向相反
13、，当把一个DNADNA片段克片段克隆到隆到M13mp8M13mp8后，可以用两种限制性内切酶把它再切后，可以用两种限制性内切酶把它再切下来，然后可以把它以相反的方向连接入下来，然后可以把它以相反的方向连接入M13mp9M13mp9。这在这在DNADNA测序中很重要，因为核苷酸序列从多接头的测序中很重要，因为核苷酸序列从多接头的一端一直读进插入的一端一直读进插入的DNADNA片段。通常一次测序只能读片段。通常一次测序只能读出约出约600600个碱基，如果插入的个碱基，如果插入的DNADNA超过了这个长度，超过了这个长度，就有一个末端的序列读不出来。一种解决的办法就就有一个末端的序列读不出来。一种
14、解决的办法就是把是把DNADNA换个方向，再插入到姐妹载体中。换个方向，再插入到姐妹载体中。4.M134.M13和质粒的杂交载体噬菌和质粒的杂交载体噬菌体质体质粒粒M13M13可以产生单链可以产生单链DNADNA，这使得它非常有用，但，这使得它非常有用，但它有一个很大的缺点。当用它有一个很大的缺点。当用M13M13作载体时，它可以容作载体时，它可以容纳纳DNADNA片段的大小十分有限。为了解决这一问题，人片段的大小十分有限。为了解决这一问题，人们把们把M13M13基因组的一部分和质粒基因组的一部分和质粒DNADNA结合在一起，构结合在一起，构成一种新型的载体，叫做成一种新型的载体，叫做噬菌噬菌
15、体质体质粒粒（phagemidsphagemids）。）。pEMBL8pEMBL8载体载体它是通过把它是通过把M13M13基因组中一个基因组中一个1 300 bp1 300 bp的的片段导入片段导入pUC8pUC8中而构建的。中而构建的。M13M13在形成被在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链DNADNA变成单链变成单链DNADNA，而被导入的那一段，而被导入的那一段M13 DNAM13 DNA则含有这种酶识别的信号序列。尽管这段则含有这种酶识别的信号序列。尽管这段序列已经从序列已经从M13M13噬菌体基因组中被分离出噬菌体基因组中被分离出来，但它的功能还在
16、。所以，来，但它的功能还在。所以，pEMBL8pEMBL8也可也可以转化为单链以转化为单链DNADNA。用作用作pEMBL8pEMBL8克隆实验的宿主大肠杆菌细胞必克隆实验的宿主大肠杆菌细胞必须随后被正常的须随后被正常的M13M13噬菌体感染，而在这里正噬菌体感染，而在这里正常的常的M13M13噬菌体作为辅助噬菌体，提供必要的噬菌体作为辅助噬菌体，提供必要的复制酶和蛋白质外壳。复制酶和蛋白质外壳。pEMBL8pEMBL8是从是从pUC8pUC8发展发展来的，同样也有插入多接头的来的，同样也有插入多接头的lacZlacZ基因，基因，重组体可以通过在含有重组体可以通过在含有X-galX-gal培养
17、基上的噬菌培养基上的噬菌斑而被鉴定出来。我们可以用斑而被鉴定出来。我们可以用pEMBL8pEMBL8产生达产生达到到10 Kb10 Kb的单链的单链DNADNA片段，这极大地扩展了片段，这极大地扩展了M13M13克隆系统的使用范围。克隆系统的使用范围。1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，
18、便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；8.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；5.阳性重组子可以用蓝白斑进行筛选；lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；6.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子；7.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中
19、，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一繁琐的亚克隆步骤。pUC118和pUC119 1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种
20、不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5.阳性重组子可以用蓝白斑进行筛选；lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；6.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子7.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；8.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；9.可以直
21、接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一繁琐的亚克隆步骤。pBluescript噬菌粒载体3.编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子标记；4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG显色反应法筛选噬菌粒载体。1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；5 粘粘端质端质粒粒 粘粘端质端质粒粒(cosmidscosmids,柯斯质粒柯斯质粒)是噬菌体是噬菌体DNADNA和
22、和大肠杆菌质粒两者的杂交体。设计粘端质粒的想法大肠杆菌质粒两者的杂交体。设计粘端质粒的想法来源于这样一个事实：把噬菌体来源于这样一个事实：把噬菌体DNADNA包装进头部的酶包装进头部的酶仅仅识别仅仅识别coscos位点。在体外包装系统中，任何长度在位点。在体外包装系统中，任何长度在37 Kb37 Kb和和52 Kb52 Kb之间的之间的DNADNA分子，只要两端含有分子，只要两端含有coscos位位点，就能够包装进噬菌体的头部。构建点，就能够包装进噬菌体的头部。构建cosmidscosmids是是为了克服把大片段为了克服把大片段DNADNA导入到大肠杆菌细胞中的技术导入到大肠杆菌细胞中的技术难
23、题。难题。粘端质粒基本上算是一个携带粘端质粒基本上算是一个携带coscos位点的质粒位点的质粒。coscos位点用于把重组位点用于把重组DNADNA装入噬菌体的头部。因为它缺装入噬菌体的头部。因为它缺少几乎所有的少几乎所有的噬菌体基因组，不能产生噬菌斑，因噬菌体基因组，不能产生噬菌斑，因此需要其他的筛选标记，如氨苄青霉素抗性标记，也此需要其他的筛选标记，如氨苄青霉素抗性标记，也要有质粒的复制起点。要有质粒的复制起点。粘粒具有来自粘粒具有来自ColE1ColE1的复制起点，可以在大肠杆的复制起点，可以在大肠杆菌进行复制，具有菌进行复制，具有AmpAmpR R作为选择标记，利用体外包装作为选择标记
24、，利用体外包装系统选择携带外源系统选择携带外源DNADNA插入片段的重组体，并侵染宿插入片段的重组体，并侵染宿主细胞。主细胞。外源外源DNADNA片段与粘粒载体的连接类似于外源片段与粘粒载体的连接类似于外源DNADNA片片段和置换型载体的连接。连接产物是由段和置换型载体的连接。连接产物是由45 Kb45 Kb的外源的外源DNADNA片段和片段和5 Kb5 Kb粘粒载体构成的连环体。对连环体进粘粒载体构成的连环体。对连环体进行体外包装形成病毒颗粒，并用于侵染大肠杆菌细胞。行体外包装形成病毒颗粒，并用于侵染大肠杆菌细胞。连环体的包装仅仅起到筛选重组体，并把连环体的包装仅仅起到筛选重组体，并把50
25、Kb50 Kb的的DNADNA分子转到细菌细胞内。分子转到细菌细胞内。50 Kb50 Kb的片段的转化效率非常的片段的转化效率非常低，而噬菌体的侵染效率非常高。低，而噬菌体的侵染效率非常高。采用粘端质粒的克隆实验按照如下步骤进行。从单酶采用粘端质粒的克隆实验按照如下步骤进行。从单酶切位点切开质粒，加入新的切位点切开质粒，加入新的DNADNA片段，这些片段通常是片段，这些片段通常是不完全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于粘端不完全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于粘端质粒来说太小了。然后，进行连接反应，形成重组体。质粒来说太小了。然后，进行连接反应，形成重组体。如果插入的如果插入的DNADN
26、A大小合适，体外包装系统从大小合适，体外包装系统从coscos位点切位点切开连环体，把重组后的粘端质粒包装进成熟的噬菌体开连环体，把重组后的粘端质粒包装进成熟的噬菌体颗粒。用这样的颗粒。用这样的噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产生噬菌斑。把感染后的大肠杆菌培养在选择性培养基生噬菌斑。把感染后的大肠杆菌培养在选择性培养基上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生长。所有的上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生长。所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组的线性粘端质粒菌落都是重组体，因为那些没有重组的线性粘端质粒太小，根本不可能包装进噬菌体的头部。太小，根本不可能包装进噬菌体的头部
27、。If we could just fill the capsid with a big plasmid having cos ends(necessary for packaging)then we would have about 42 kbp of free space instead of only 23 kbp(as in lambda FIX).In fact,that kind of cloning vector has been made already,and it is called a cosmid(where the cos indicates that it has
28、lambda cos ends).Heres an example of a commercial vector based on cosmid technology:A sequence marked“ori”for DNA replication in bacteria;Ampr for ampicillin selection in bacteria;A sequence marked MCS that is a polylinker containing unique restriction sites and two phage RNA polymerase promoters(T7
29、 and T3)in opposing directions.Two cos sequences,separated by an Xba1 site;An origin of DNA replication from SV40(permits replication and copy number amplification in many eukaryotic cells,in the presence of SV40 T antigen protein);Neor for selection in eukaryotic cells with the neomycin antibiotic
30、analog G418.The maximum amount of DNA that can be inserted into SuperCos I depends on the packaging limit of lamba(52 kbp)and the pre-existing size of the vector(7.6 kbp).How much space does SuperCos I have for foreign DNA?52 kbp-7.6 kbp=44.4 kbp 6 6 其他高容量载体其他高容量载体 基于基于噬菌体的载体的主要用途是克隆噬菌体的载体的主要用途是克隆DN
31、ADNA大片段。大片段。做个比较，做个比较，M13M13载体可以插入不超过载体可以插入不超过3 Kb3 Kb的的DNADNA片段，片段，大多数质粒的容量不超过大多数质粒的容量不超过8 Kb8 Kb，对于像，对于像EMBL4EMBL4那样的那样的置换载体能够达到置换载体能够达到20 Kb20 Kb，对某些粘端质粒而言是，对某些粘端质粒而言是40 40 KbKb。这样可以克隆如此巨大的这样可以克隆如此巨大的DNADNA片段的能力，使得片段的能力，使得人们可以建立基因组文库。一个基因组文库就是一人们可以建立基因组文库。一个基因组文库就是一套覆盖某个生物体所有套覆盖某个生物体所有DNADNA的重组体克
32、隆群。例如，的重组体克隆群。例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有的大肠杆菌一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有的大肠杆菌基因，据此，我们可以抽提出任何我们所感兴趣的基因，据此，我们可以抽提出任何我们所感兴趣的基因加以研究。基因组文库可以保存很多年，也可基因加以研究。基因组文库可以保存很多年，也可以很容易地在研究组织间传播。以很容易地在研究组织间传播。由于人类和其他哺乳动物的基因组很大，因此需由于人类和其他哺乳动物的基因组很大，因此需要构建新的容量更大的载体。人类已经开发出一系列要构建新的容量更大的载体。人类已经开发出一系列这样的载体，并且很快应用到基因组物理图谱的构建这样的载体，并且很快应用
33、到基因组物理图谱的构建工作。工作。Bacterial artificial chromosome(BAC)vectors 以大肠杆菌为宿主的克隆载体多属于多拷贝复制子。以大肠杆菌为宿主的克隆载体多属于多拷贝复制子。这类载体的优点是在宿主细胞中有较多的拷贝数，因此这类载体的优点是在宿主细胞中有较多的拷贝数，因此可以获得更多的克隆片段。但是，这类载体也有一个明可以获得更多的克隆片段。但是，这类载体也有一个明显缺点，即插入片段不稳定。当插入片段来自于含有重显缺点，即插入片段不稳定。当插入片段来自于含有重复顺序的真核基因组时，插入片段的不稳定现象就尤为复顺序的真核基因组时，插入片段的不稳定现象就尤为突
34、出，因此在细菌细胞中就很难保持完整的大片段突出，因此在细菌细胞中就很难保持完整的大片段DNADNA。为了避免高拷贝数目载体中插入片段不稳定这一问为了避免高拷贝数目载体中插入片段不稳定这一问题，人们开始利用低拷贝数目复制子，例如题，人们开始利用低拷贝数目复制子，例如F-F-因子，因子，来构建载体。利用来构建载体。利用F F因子构建的载体可以克隆因子构建的载体可以克隆5050300 300 KbKb的外源的外源DNADNA片段。片段。BACBAC载体含有载体含有F F质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriSoriS），控制质），控制质粒复制的基因（粒复制的基因（repErepE）,确保低拷贝质粒精
35、确分配至子确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因代细胞的基因（parAparA,parBparB），以及细菌的氯霉素乙），以及细菌的氯霉素乙酰转移酶基因。酰转移酶基因。构建构建BACBAC文库的方法与构建标准质粒文库的方法相文库的方法与构建标准质粒文库的方法相似，只是似，只是DNADNA插入片段是通过脉冲电泳制备的。插入片段是通过脉冲电泳制备的。pBeloBAC11pBeloBAC11是一种是一种BACBAC载体。由载体。由HindHindIIIIII部分酶切，通部分酶切，通过过PAGEPAGE分离得到分离得到DNADNA片段连接到通过片段连接到通过HindHindIIIIII 酶切，并酶切，
36、并通过磷酸酶水解的通过磷酸酶水解的pBeloBAC11pBeloBAC11上，连接分子通过电击上，连接分子通过电击导入大肠杆菌细胞中，在含有氯霉素的培养基上筛选重导入大肠杆菌细胞中，在含有氯霉素的培养基上筛选重组体。插入片段可以利用稀有位点限制性内切酶组体。插入片段可以利用稀有位点限制性内切酶NotNotI I切割下来。切割下来。terminaseterminase可以在可以在coscosN N位点切开质粒。可以位点切开质粒。可以对线性化质粒进行末端标记进行限制酶作图。对线性化质粒进行末端标记进行限制酶作图。HindHindIIIIII克隆位点两侧的克隆位点两侧的T7T7和和SP6SP6启动子
37、可以被用作制备启动子可以被用作制备RNARNA探探针进行文库筛选。针进行文库筛选。BACBAC载体的优点是通过很多代的传递，仍保持稳定，并载体的优点是通过很多代的传递，仍保持稳定，并且且BACBAC能够通过电击的方法高效地导入大肠杆菌细胞，能够通过电击的方法高效地导入大肠杆菌细胞，避免了体外包装过程。避免了体外包装过程。P1 噬菌体载体（Bacteriophage P1 vectors）它含有很多它含有很多 P1 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 7070100kb 100kb 大小的基因组大小的基因组DNADNA片段。在这种系统中，含有基因组片段。在这种
38、系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 P1 噬菌体颗粒噬菌体颗粒中，后者总容量可达中，后者总容量可达 115kb 115kb（包括载体和插入片段）。将（包括载体和插入片段）。将重组重组 DNA DNA 注射到表达注射到表达 CreCre 重组酶的大肠杆菌中，线状重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA DNA 分子通过重组于载体的两个分子通过重组于载体的两个 loxPloxP 位点之间而发生环化。另位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记外，载体还携带一个通用的选择标记 kankan r r，一个区分携，一个区分携带外源带外
39、源 DNA DNA 克隆的阳性标记克隆的阳性标记 sacBsacB 以及一个能够使每个细以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 P1 质粒复制子。另一质粒复制子。另一个个 P1 P1 复制子（复制子（P1 P1 裂解性复制子）在可诱导的裂解性复制子）在可诱导的 laclac 启动启动子（子（IPTG IPTG 诱导）控制下，用于诱导）控制下，用于 DNA DNA 分离前质粒的扩增。分离前质粒的扩增。E.coli promotersacBP1 repressorbinding siteT7 T3 SalISfiINotI BamHI loxPA
40、mpAd10 pAD10sacBII(29.3 kb)XbaIScaIpacloxPtetlyt Repplasmid Rep kanr 它含有很多它含有很多 P1 P1 噬菌体来源的顺噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳式作用元件，能容纳 7070100kb 100kb 大小的基因组大小的基因组DNADNA片段。在这种片段。在这种系统中，含有基因组和载体序列系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到的线状重组分子在体外被组装到 P1 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量噬菌体颗粒中，后者总容量可达可达 115kb 115kb（包括载体和插入（包括载体和插入片段）。将重组片段）。将重组 D
41、NA DNA 注射到表注射到表达达 CreCre 重组酶的大肠杆菌中，重组酶的大肠杆菌中，线状线状 DNA DNA 分子通过重组于载体分子通过重组于载体的两个的两个 loxPloxP 位点之间而发生环位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用化。另外，载体还携带一个通用的选择标记的选择标记 kankan r r，一个区分，一个区分携带外源携带外源 DNA DNA 克隆的阳性标记克隆的阳性标记 sacBsacB 以及一个能够使每个细胞以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒都含有约一个拷贝环状重组质粒的的 P1 P1 质粒复制子。质粒复制子。P1 噬菌体载体（Bacteriophag
42、e P1 vectors）CreCre重组酶重组酶：于：于19811981年从年从P1P1噬菌体噬菌体中发现，属于中发现，属于 IntInt酶超基因家族酶超基因家族,能识别特异的能识别特异的 DNA DNA 序列，即序列，即 loxPloxP 位点，使位点，使 loxPloxP位点间的基因序列被删除或重位点间的基因序列被删除或重组。组。LoxPLoxP（locus of locus of X-overX-over P1 P1）序列：来源于）序列：来源于P1P1噬菌噬菌体，是有两个体，是有两个13bp13bp反向重复序列反向重复序列和中间间隔的和中间间隔的8bp8bp序列共同组成，序列共同组成，
43、8bp8bp的间隔序列同时也确定了的间隔序列同时也确定了LoxPLoxP的方向。的方向。CreCre在催化在催化DNADNA链交换过程中与链交换过程中与DNADNA共价结共价结合，合，13bp13bp的反向重复序列是的反向重复序列是CreCre酶的结合域。酶的结合域。1 1、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点位于一条位点位于一条DNADNA链上，且方向相同，链上，且方向相同，CreCre重组酶能有效切除两个重组酶能有效切除两个LoxPLoxP位点间的序列或环化；位点间的序列或环化；2 2、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点位于一条位点位于一条DNADNA链上，但方向相反，链上，但方向相
44、反，CreCre重组酶能导致两个重组酶能导致两个LoxPLoxP位点间的序列倒位；位点间的序列倒位；3 3、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点分别位于两条不同的位点分别位于两条不同的DNADNA链或染色体链或染色体上，上，CreCre酶能介导两条酶能介导两条DNADNA链的交换或染色体易位。链的交换或染色体易位。正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因失活。如蔗糖致死基因 SacBSacB ，来自淀粉水解芽，来自淀粉水解芽胞杆菌胞杆菌 （Bac
45、illus amyloliquefaciensBacillus amyloliquefaciens），编，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上 sacBsacB 基基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。可用于插入失活筛选重组子。sacBBamHI+95 kb DNA fragment pac loxPsacBKanDNA headful+Cre Recombi-lation DNAAmplifi-cationpac cleavageproteinloxPAmpAd10 pAD10sacB
46、II(29.3 kb)XbaIScaIpacloxPlyt Repplasmid Rep kanrrP1噬菌体载体构建噬菌体载体构建基因组文库的示意图基因组文库的示意图pAd10 sacB ScaI+BamHI 长臂长臂+短臂短臂 加入外源加入外源DNA片段片段 重组重组DNA分子分子 离体包装离体包装 感染宿主细胞感染宿主细胞 还有一些大容量的载体使基于噬菌体还有一些大容量的载体使基于噬菌体P1P1发展而来的。发展而来的。P1P1优于优于的地方在于，它能够在它的蛋白质外壳中挤的地方在于，它能够在它的蛋白质外壳中挤进进110 Kb110 Kb的的DNADNA分子。基于噬菌体分子。基于噬菌体P1
47、P1设计的粘端质粒可设计的粘端质粒可用于克隆长度从用于克隆长度从75 Kb75 Kb到到100 Kb100 Kb的的DNADNA。还有一种载体，。还有一种载体，结合了结合了P P载体和载体和BACBAC的特点，称为的特点，称为P P衍生的人工染色体衍生的人工染色体（P1-derived artificial chromosome,PACP1-derived artificial chromosome,PAC），同样），同样也拥有超过也拥有超过300 Kb300 Kb的容量。的容量。Types of vectorsPlasmid-basedVirus-basedChromosome-basedP
48、hage-basedEukaryotic virus-based(to be reviewed in gene therapy section)YACBACPACHybrid(phagemid,cosmid etc)Cloning vector Size of insertStandard high copy number plasmid vectors 0 10 kbBacteriophage insertion vectors 0 10 kbBacteriophage replacement vectors 9 23 kbCosmid vectors 30 44 kbBacteriophage P1 70 100 kbPAC(P1 artificial chromosome)vectors 130 150 kbBAC(bacterial artificial chromosome)vectors up to 300 kbYAC(yeast artificial chromosome)vectors 0.2 2.0 MbSizes of inserted DNA commonly obtained with different cloning vectors
