1、细胞工程Cell EngineeringChapter 6Chapter 6、细胞拆合与克隆技术、细胞拆合与克隆技术61 细胞拆合细胞拆合611 细胞拆合技术发展概况细胞拆合技术发展概况612 细胞拆合概念与意义细胞拆合概念与意义 613 细胞拆合技术与关键细胞拆合技术与关键62 克隆技术克隆技术621 克隆的定义及理论基础克隆的定义及理论基础622 细胞核移植（也是克隆技术关键）细胞核移植（也是克隆技术关键）623 克隆动物一般制备技术克隆动物一般制备技术624 体细胞克隆技术体细胞克隆技术625 克隆技术的应用与意义克隆技术的应用与意义626 存在的问题存在的问题627 克隆技术发展趋势克
2、隆技术发展趋势61 细胞拆合细胞拆合611 细胞拆合技术发展概况细胞拆合技术发展概况612 细胞拆合概念与意义细胞拆合概念与意义一、细胞拆合（一、细胞拆合（Cell Reconstruction）：）：是指从活细胞中分离出细胞器及其细胞组是指从活细胞中分离出细胞器及其细胞组分，在体外一定条件下将不同细胞来源的分，在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组形成有生物活性细胞器及其组分进行重组形成有生物活性的细胞或细胞器的一种细胞工程技术。的细胞或细胞器的一种细胞工程技术。二、细胞拆合过程：二、细胞拆合过程：细胞器及其分离细胞器及其分离 同种或异种细胞器与同种或异种细胞器与组分重组组分
3、重组 新的重组细胞或新的性状或产品新的重组细胞或新的性状或产品 细胞核分离、细胞核分离、细胞核细胞核 胞质体的获得胞质体的获得 融合融合 胞质体胞质体三、细胞拆合基本方式（目前）三、细胞拆合基本方式（目前）四、细胞拆合意义四、细胞拆合意义 细胞拆合技术是现代生物工程中令人细胞拆合技术是现代生物工程中令人瞩目的热点课题，细胞拆合与细胞融合瞩目的热点课题，细胞拆合与细胞融合技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平上主要构建手段，它与基因转移技术、上主要构建手段，它与基因转移技术、干细胞技术等结合，可以人为地获得新干细胞技术等结合，可以人为地获得新物种或使细胞表达新的性状
4、和新的产物。物种或使细胞表达新的性状和新的产物。613 细胞拆合技术与关键细胞拆合技术与关键一、细胞拆合技术方法一、细胞拆合技术方法细胞组分分离技术细胞组分分离技术分级分离法分级分离法 细胞大小、密度细胞大小、密度密度梯度离心法密度梯度离心法 利用利用 细胞表面电荷细胞表面电荷流式细胞分选仪分离法流式细胞分选仪分离法 细胞表面标志细胞表面标志细胞破碎方法细胞破碎方法 超声波破碎法超声波破碎法反复冻融法：反复冻融法：-70 37C，重复，重复3-4次，次，细胞壁破碎细胞壁破碎化学裂解法：化学裂解法：SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）高速组织捣碎法：需循环水冷却高速组织捣碎法：需循环水冷却
5、流式细胞分选仪流式细胞分选仪去核细胞（胞质体）的制备：（见罗立新表去核细胞（胞质体）的制备：（见罗立新表5-1）核体的制备：核体的制备：贴壁法纯化（见图贴壁法纯化（见图5-2、5-3）核体需核体需5-10h再贴壁再贴壁 培养培养 分离分离 完整细胞需完整细胞需2h （菲可液梯度离心）（菲可液梯度离心）微核体的制备：微核体的制备：CB具有排核作用，形成的微核体；具有排核作用，形成的微核体；01ug/mL秋水仙胺，秋水仙胺，48h，处理细胞，处理细胞 细胞微核化细胞微核化 离心离心14000r/min、20min，80-90%1-3%牛血清密度梯度离心牛血清密度梯度离心（见图（见图5-4）去核细胞
6、的性质：去核细胞的性质：二、细胞拆合技术关键二、细胞拆合技术关键细胞器与完整细胞融合：细胞器与完整细胞融合：ctDNA叶绿体叶绿体（抗药性、色素）（抗药性、色素）细胞器分离细胞器分离 细胞器包裹细胞器包裹 mtDNA线粒体线粒体 形成脂质体或血影细胞形成脂质体或血影细胞 与完整细胞融合与完整细胞融合生物大分子引入完整细胞：生物大分子引入完整细胞：1975年，童第周、牛满江，鲤鱼或鲫鱼年，童第周、牛满江，鲤鱼或鲫鱼mRNA 鲤金鱼鲤金鱼 金鱼受精卵金鱼受精卵 鲫金鱼鲫金鱼62克隆技术克隆技术621 克隆的定义及理论基础克隆的定义及理论基础一、克隆（一、克隆（clone）：）：克隆克隆原意为原意为
7、“扦插的枝条扦插的枝条”无性繁殖系无性繁殖系 基因克隆（实为基因扩增）基因克隆（实为基因扩增）细胞克隆（实为有丝分裂的细胞集落）细胞克隆（实为有丝分裂的细胞集落）个体克隆（如植物快繁个体）个体克隆（如植物快繁个体）引伸为引伸为“克隆操作技术，即核移殖技术克隆操作技术，即核移殖技术”二、理论基础：二、理论基础：体细胞具有细胞全能性体细胞具有细胞全能性三、发展历程：三、发展历程：622 细胞核移植（也是克隆技术关键）细胞核移植（也是克隆技术关键）一、定义一、定义 细胞核移植技术：是指利用显微操作技术将细胞核移植技术：是指利用显微操作技术将某种动物细胞核移入同种或异种动物的去核成熟某种动物细胞核移入
8、同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术；卵内的精细技术；它可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植；它可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植；它可用于发育生物学、细胞生物学、分子生它可用于发育生物学、细胞生物学、分子生物学等问题的研究，实现不同细胞核与细胞质的物学等问题的研究，实现不同细胞核与细胞质的组配，还能培育出新物种。组配，还能培育出新物种。二、发展历程二、发展历程三、核移植技术三、核移植技术供体和受体的准备供体和受体的准备 鱼类：鱼类：供体供体囊胚细胞或成体细胞，囊胚细胞或成体细胞，受体受体成熟的卵细胞成熟的卵细胞 发育发育（人工催产、水中激活）（人工催产、水中激活）时间时间 两栖类：两栖类：配
9、合配合 供体供体囊胚细胞或成体细胞，囊胚细胞或成体细胞，好好 受体受体成熟卵细胞（人工针刺）成熟卵细胞（人工针刺）鸟类、爬行类：未知鸟类、爬行类：未知哺乳类：哺乳类：供体供体早期胚胎细胞、胚胎干细胞、体细早期胚胎细胞、胚胎干细胞、体细 胞；后用体细胞，如乳腺细胞、粘胞；后用体细胞，如乳腺细胞、粘 膜上皮细胞；合子核到膜上皮细胞；合子核到64细胞期，细胞期，0.2%链霉蛋白酶预处理链霉蛋白酶预处理,溶去胚胎溶去胚胎 胶膜及透明带胶膜及透明带,分离单个卵裂球；分离单个卵裂球；受体受体去核卵母细胞、受精卵、去核卵母细胞、受精卵、2细胞胚细胞胚 胎（第一极体成熟时期去核）；胎（第一极体成熟时期去核）；
10、去卵膜和卵核去卵膜和卵核用玻璃微针（尖为用玻璃微针（尖为2-4um）鱼卵鱼卵借助第二极体标志，去核；借助第二极体标志，去核；两栖卵两栖卵紫外线去核；紫外线去核；哺乳卵哺乳卵借助第一极体；借助第一极体；供体细胞制备：供体细胞制备：胚胎或组织机械切割胚胎或组织机械切割 置细胞分离液置细胞分离液（含胰蛋白酶）处理几分钟（含胰蛋白酶）处理几分钟 单细胞短期培养单细胞短期培养移植移植 选择合适微吸管（比细胞核大，比供体细胞小选择合适微吸管（比细胞核大，比供体细胞小），不能多带细胞质，须），不能多带细胞质，须30-40min内完成操作过内完成操作过程，温度程，温度16-18C；显微操纵术：原子力显微镜、显
11、微操纵仪；显微操纵术：原子力显微镜、显微操纵仪；显微操作仪显微操作仪核移植操作过程核移植操作过程623 克隆动物一般制备技术克隆动物一般制备技术一、胚胎细胞核移植法一、胚胎细胞核移植法世界：世界：1984年，英，绵羊年，英，绵羊;2019年，日本；年，日本；2019年，澳大利亚，孪生牛年，澳大利亚，孪生牛;2019年，食用牛年，食用牛 目前，小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、羊、猴目前，小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、羊、猴中国：中国：1990年，中国发育所，兔；西北农大，山羊年，中国发育所，兔；西北农大，山羊;1991年，台湾，猪年，台湾，猪;1992年，江苏农科院，兔年，江苏农科院，兔;2019年，中国
12、发育所与扬州大学，山羊年，中国发育所与扬州大学，山羊;2019年，华南师院与广西师大，克隆杂色牛年，华南师院与广西师大，克隆杂色牛;2019年，西北农大，猪年，西北农大，猪 2019年，湖南医科大，小鼠年，湖南医科大，小鼠二、胚胎干细胞核移植：二、胚胎干细胞核移植：鼠，鼠，8细胞前胚胎，细胞前胚胎，细胞全能性明显细胞全能性明显三、胎儿成纤维细胞核移植：三、胎儿成纤维细胞核移植：2019年，年，3只山羊只山羊624 体细胞克隆技术体细胞克隆技术一、体细胞克隆技术：一、体细胞克隆技术：是指将动物体细胞经过抑制培养，是指将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技使其处于休眠状态，利
13、用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植到受体，妊娠产仔，克隆出非成后移植到受体，妊娠产仔，克隆出非成体动物。体动物。20世纪，世纪，50年代，体细胞克隆出成体年代，体细胞克隆出成体蛙，但哺乳类个体不成功蛙，但哺乳类个体不成功 2019、2、23，英格兰、爱丁堡罗斯林，英格兰、爱丁堡罗斯林研究所与研究所与PPL制药公司，伊恩制药公司，伊恩.维尔穆特博维尔穆特博士研究小组，用白绵羊细胞核士研究小组，用白绵羊细胞核+黑绵羊去黑绵羊去核卵母细胞，培育出克隆绵羊核卵母细胞，培育出克隆绵羊“多莉多莉”，现现存活存活 2019、7，美国，夏威夷大学，用豚鼠细
14、，美国，夏威夷大学，用豚鼠细胞核胞核+黑鼠去核卵细胞，培育出黑鼠去核卵细胞，培育出50只克隆鼠只克隆鼠 ，克隆猪，克隆猪 2019、1，中国，克隆牛（卢光锈，中南，中国，克隆牛（卢光锈，中南大学，干细胞，克隆人胚胎）大学，干细胞，克隆人胚胎）2019、8，经过李宁教授领导的课题组，经过李宁教授领导的课题组一年多的科技攻关，一年多的科技攻关，8月月5日，我国第一头日，我国第一头体细胞克隆猪终于在河北省三河成功诞生体细胞克隆猪终于在河北省三河成功诞生。该项目得到了国家重点基础研究发展规。该项目得到了国家重点基础研究发展规划划“973”项目以及北京市自然科学基项目以及北京市自然科学基金资助。金资助。
15、2019、12，中国农业大学，高产奶牛体细胞，中国农业大学，高产奶牛体细胞克隆技术的研究获得突破，利用成年母奶牛成克隆技术的研究获得突破，利用成年母奶牛成纤维细胞、颗粒细胞和胎儿成纤维细胞、胎儿输纤维细胞、颗粒细胞和胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞作为供体核克隆时重构胚的囊胚发卵管上皮细胞作为供体核克隆时重构胚的囊胚发育率，分别为育率，分别为41%、41%46%和和39%。克隆胚胎。克隆胚胎的移植后的移植后60天妊娠检查时，妊娠率为天妊娠检查时，妊娠率为35.2%（51/145），妊娠母牛早期流产率为），妊娠母牛早期流产率为15.2%（8/51，指妊娠，指妊娠159天前），早产率为天前），早
16、产率为4%（2/51，指妊娠，指妊娠7-8个月）。个月）。体细胞克隆高产奶牛体细胞克隆高产奶牛 2019、2，美国科学杂志日宣，美国科学杂志日宣布，韩国和美国科学家成功克隆出了人类早布，韩国和美国科学家成功克隆出了人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。这是科期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。这是科学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细胞。胞。汉城国立大学和美国密歇根州立大学等汉城国立大学和美国密歇根州立大学等机构的科学家参与了这项研究。名健康机构的科学家参与了这项研究。名健康妇女为这项研究志愿捐献了个卵细胞妇女为这项研究志愿捐献了个卵细胞以及被称为卵丘细胞的体细
17、胞。以及被称为卵丘细胞的体细胞。科学家们从卵丘细胞内提取出细胞核，然后将其科学家们从卵丘细胞内提取出细胞核，然后将其植入同一位妇女去除了细胞核的卵细胞内，并采用植入同一位妇女去除了细胞核的卵细胞内，并采用化学手段刺激卵细胞分裂，共有个克隆细胞经化学手段刺激卵细胞分裂，共有个克隆细胞经过约天的时间发育到至少几十个细胞组成的、被过约天的时间发育到至少几十个细胞组成的、被称为胚囊的早期胚胎阶段。科学家们从这些胚囊中称为胚囊的早期胚胎阶段。科学家们从这些胚囊中分离出个内层细胞团，并在此基础上最终获得分离出个内层细胞团，并在此基础上最终获得一个人类胚胎干细胞系。实验显示，利用这种办法一个人类胚胎干细胞系
18、。实验显示，利用这种办法获得的胚胎干细胞具有多能性，可分化成骨骼细获得的胚胎干细胞具有多能性，可分化成骨骼细胞、肌肉细胞和未成熟的脑细胞等多种细胞类型。胞、肌肉细胞和未成熟的脑细胞等多种细胞类型。克隆人早期胚胎克隆人早期胚胎(1)克隆人早期胚胎克隆人早期胚胎(2)2019、3，中国首批转基因体，中国首批转基因体细胞克隆牛的再克隆体日前成功细胞克隆牛的再克隆体日前成功降生。降生。克隆羊借腹生子津城落地克隆羊借腹生子津城落地 克隆动物可以自然交配克隆动物可以自然交配 中国转基因克隆技术再破难关中国转基因克隆技术再破难关 荧光小猪荧光小猪 625 克隆技术的应用与意义克隆技术的应用与意义一、无性繁殖
19、意义为：有利于保护柔弱的一、无性繁殖意义为：有利于保护柔弱的 胚胎期；有利于大量快速繁殖。胚胎期；有利于大量快速繁殖。二、检验动物细胞全能性（理论上）；二、检验动物细胞全能性（理论上）；三、加速动物繁殖，优良育种，保护珍稀三、加速动物繁殖，优良育种，保护珍稀 动物；动物；四、用于医药领域四、用于医药领域克隆动物（器官大克隆动物（器官大 小与人相当），培育组织、器官，如小与人相当），培育组织、器官，如 用猪肝、羊颅骨、鸡肌腱、猪关节软用猪肝、羊颅骨、鸡肌腱、猪关节软 骨作替代器官；骨作替代器官；626 存在的问题存在的问题一、技术尚不成熟：一、技术尚不成熟：克隆动物成功率低，死亡克隆动物成功率低
20、，死亡 率高；率高；二、克隆动物的体细胞突变、寿命和其他遗传二、克隆动物的体细胞突变、寿命和其他遗传 问题，如无遗传物质交换，适应力差，易问题，如无遗传物质交换，适应力差，易 突变；突变；三、理论问题：三、理论问题：克隆并非完全复制，体细胞也克隆并非完全复制，体细胞也 有变异，理论问题值得深入；有变异，理论问题值得深入；四、社会伦理问题：四、社会伦理问题：从医学上讲，赞同者多；从医学上讲，赞同者多；从伦理上讲，反对者多；难判断；从伦理上讲，反对者多；难判断；627 克隆技术发展趋势克隆技术发展趋势克隆技术与转基因技术、干细胞技克隆技术与转基因技术、干细胞技术结合；术结合；灵长类、鸟类、爬行类作为克隆对灵长类、鸟类、爬行类作为克隆对 象。象。【思考题】【思考题】1、何谓细胞拆合技术？、何谓细胞拆合技术？2、何谓胞质体、微核和微核体？、何谓胞质体、微核和微核体？3、克隆技术的关键和发展趋势是什么？、克隆技术的关键和发展趋势是什么？4、从理论上分析和建立、从理论上分析和建立“克隆鸡克隆鸡”的技的技术术 路线。路线。
