1、临床常见微生物标本采集法及影响临床微生物检验的因素引子：流行病学调查显示，临床感染病原菌种类不断发生变化，对抗微生物药物的耐药性不断增强，因此，临床医生在抗感染治疗中越来越重视病原学的检测，对微生物室的工作要求越来越高。微生物室任务越来越爱繁重。临床医生要求微生物室应做到：菌种鉴定准确 药敏试验准确 回报结果快速及时 做好咨询与解释工作螺旋体螺旋体 衣原体衣原体 支原体支原体 病病 毒毒真菌真菌 细菌细菌病原体常见病原体种类流 程 微生物学检查个体治疗感染性标本 诊断及鉴别诊断感染性疾病 在细菌检验中，许多因素可以影响检测结果的准确性，我们在工作时应当加以注意，主要包括以下几个方面：标本的采集
2、与运送 细菌的鉴定及药敏试验 结果的审核与报告 标本的采集与运送对于检验结果的重要性标本的采集与运送对于检验结果的重要性 正确的采集与运送标本是保证检验结果准确的最基本条件，如果得不到一份合格的标本，鉴定及药敏结果再准确，结果也是不可信的。而从目前状况看，采集一份合格的标本，不是一件容易的事情，微生物检验标本的正确采集、运送及处理，与细菌的培养、鉴定结果有十分密切的关系，医生、护士、检验人员均应重视微生物标本的正确采集的有关问题,并有责任向患者及家属进行正确采集标本的宣传和指导.典型案例 我们在临床检验工作当中遇到过这样的事情，脑积水患儿准备进行手术，术前三次脑脊液培养均分离出表皮葡萄球菌，脑
3、脊液常规检查正常，污染菌？病原菌？临床请求会诊。标本采集运送中的影响因素 抗微生物药物对标本的影响 抗菌药物抑制细菌生长，影响检出率，应当在应用抗微生物药物之前采集标本，或者停药35天采集标本，或在血浆药物浓度最低时采集标本。标本留取是否正确 无菌部位的标本采集是要严格消毒，无菌操作，避免污染。如：血液、无菌体液。主要注意两个方面，一是穿刺部位的消毒，二是在将标本注入容器时的无菌操作。如：肺感染 痰 泌尿系感染尿 脓肿脓汁 颅内感染脑脊液 发热血、骨髓、尿等临床实验室细菌分类需氧、微需氧或兼性厌氧菌非苛养菌：包括肠杆菌科细菌、假单胞类非发酵菌、不动杆菌、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属（不含肺炎
4、链球菌）苛养菌：嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌厌氧菌 标本采集和运送标本采集的时间、部位、种类和数量注明相关信息（由各种病原体所致感染性疾病的病程来决定）微生物标本采集、运送、验收和处理注意事项 1、标本采集（1）申请单必须标记清楚姓名、性别、年龄、病原号、标本来源（具体写明）、检查项目（目的要明确）检查项目（目的要明确）等，以便试验室能够合理选择培养环境和培养基。（2）尽量在抗生素应用前采集标本、以提高阳性检尽量在抗生素应用前采集标本、以提高阳性检出率和避免漏检。出率和避免漏检。（3）标本采集应严格执行无菌操作。（4）采集标本的容器必须经灭菌处理，不可用消毒剂。2、标本运送（
5、1）标本采集后应尽快运送到细菌室。（2）标本采集后在室温下超过室温下超过2 2小时小时未送到细菌室的，可视为不合格标本。3、标本验收（1）实验室只接受和处理合格标本。（2）实验室对不合格标本退回必须说明原因、并及时与临床联系。注意事项 （1）微生物检验样本必须要求采集转运，否则将影响检查结果，并给评价其意义带来麻烦甚至误导。（2）微生物样本极易被污染，污染的样本杂菌大量繁殖抑制病原菌生长，条件致病菌也是致病菌，如污染条件致病菌将误导临床，造成对患者的损害以及经济和时间的浪费。（3）某些标本离体极易死亡，应在床边采取和接种或立即保温送至实验室检验。室温放置或延迟送检，可使检出的阳性率降低；不能使
6、用冷藏的样本检验。（4）厌氧菌样本采取必须隔绝空气，混入空气的样本影响检验结果，不能使用。血液标本血液标本 正常人血液是无菌的，血液标本病原学检查有助正常人血液是无菌的，血液标本病原学检查有助于菌血症、败血症的诊断和疑由菌血症所致其他症于菌血症、败血症的诊断和疑由菌血症所致其他症状，如皮疹、肝脾肿大、关节疼痛、昏迷休克等的状，如皮疹、肝脾肿大、关节疼痛、昏迷休克等的鉴别诊断。并通过药敏试验为临床治疗提供合理的鉴别诊断。并通过药敏试验为临床治疗提供合理的抗生素选择抗生素选择。采集时间发热初期发热初期寒战期寒战期抗生素应用之前抗生素应用之前下次用药之前下次用药之前临床常见的采血指徵 发热（38C）
7、或低温（36C）寒战 白细胞增多（计数大于10，000109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核的白细胞）粒细胞减少（成熟的多核白细胞1000109/L）血小板减少 皮肤粘膜出血 昏迷，休克多器官衰竭 CRP升高采血指徵指徵 采集方法采集方法2.采样量：不少于培养基的1/10。成人采血510ml骨髓1-2ml儿童采血15ml 3.培养要求：除有明确的感染特征，应同时送需氧、厌氧培养。1 1.采血部位：肘静脉：无菌采集，1-3次其他部位：亚急性心内膜炎等病人，从肘动脉或股动脉等多次采血标本采集后立即送检标本采集后立即送检,不宜存放于冰不宜存放于冰箱箱。标本运送标本运送采集数量对结果的影响因素
8、血培养的数量研究表明，当每套血培养采血20ml时一套检出率：65%二套检出率：80%三套检出率：96%目前的指南推荐采集23套血培养一套血培养瓶（一套血培养瓶（Blood Culture SetBlood Culture Set）：血培养瓶接种的是同一来源的）：血培养瓶接种的是同一来源的标本（同一穿刺）标本（同一穿刺）Principle and Procedure for Blood Culture，CLSI，M47-P,2006How many blood culture sets should be drawn?需要抽取多少份血培养样本？需要抽取多少份血培养样本？抽取2-3份血培养样本可使
9、败血症病原菌检出率达到 99%败血症患者在初期千万不要（NEVER draw only 1 blood）仅抽取一瓶血培养注意：“份”是指单独的静脉穿刺的数量。怀疑急性原发性菌血症真菌菌血症脑膜炎 2或3份血培养骨髓炎关节炎肺炎 采血份数采血份数徐英春，倪语星等。血培养操作规范，上海科学技术出版社，2002,1-31血培养份数和时间不明病源的发热，如：隐性脓肿 采集2或3份 伤寒热波浪热 估计体温升高之前 （下午）再采2份以上 24h24h至至36h36h后后徐英春，倪语星等。血培养操作规范，上海科学技术出版社，2002,1-31血培养份数和时间 1h2h内 采集3份 24h后阴性 再采3份以上
10、 前前2周周用抗生素用抗生素第第1天天 第第2天天 第第3天天2份份2份份2份份急性心内膜炎急性心内膜炎徐英春，倪语星等。血培养操作规范，上海科学技术出版社，2002,1-31或可疑亚急性心内膜炎患者每间隔一个小时采集一份,共采集3份标本.送检目的：送检目的：有助于泌尿系感染的诊断和鉴别诊断有助于泌尿系感染的诊断和鉴别诊断 尿液标本尿液标本采集时间细菌培养在未使用抗生素前取晨尿，结核细菌培养在未使用抗生素前取晨尿，结核分枝杆菌检查应停用抗结核药物分枝杆菌检查应停用抗结核药物1 12 2天后天后留留24h24h尿送检尿送检.因尿道口寄居有正常菌群,故采集标本应避免杂菌污染。晨起第一次中段尿，保证
11、尿液在膀胱内停留时间4小时以上，留尿前 清洗外阴，排尿过程不要中断，避免污染。培养后有四种以上细菌生长，考虑污染，防止在尿袋中直接采集尿液标本。尿液标本要定量报告 将尿液标本接种于增菌液中或离心后取沉渣进行培养都是错误的。采集办法采集办法尿液标本的采集方法有:1.中段尿采集法2.导尿法、3.肾盂尿采集法、4.膀胱穿刺尿采集法、5.24h留尿法 中段尿采集法最常用的方法，女性患者用中段尿采集法最常用的方法，女性患者用肥皂水冲洗外阴及尿道口肥皂水冲洗外阴及尿道口;男性患者用肥皂男性患者用肥皂水冲洗尿道口，排出前段尿，再收集中段水冲洗尿道口，排出前段尿，再收集中段尿尿 3 35ml5ml于无菌容器内
12、送检于无菌容器内送检。中段尿采集法中段尿采集法使用导尿管导尿是一种较好的无菌采集法,可以防止杂菌染。导尿法导尿法用导尿管采集肾盂尿,用于确定菌尿是否来自肾脏。首先充分冲洗膀胱,以最后一次冲洗尿作对照,然后用导尿管插入输尿管,分别标记左右侧,收集三次尿;如果输尿管菌数比对照管菌数多或第三次尿中菌数比第一次多,该菌尿可能来自肾脏。反之，则可能来自膀胱。肾盂尿采集法肾盂尿采集法将病人耻骨上皮肤经碘酒消毒后，以无菌空针作膀胱穿刺。主要用于尿液厌氧菌的培养，也可用于采集中段尿困难者或培养结果与患者病情有矛盾时。膀胱穿刺尿采集法膀胱穿刺尿采集法用一洁净容器，留取24h尿液，取其沉淀部份盛于清洁瓶内送检。主
13、要用于结核分枝杆菌的检查。24h24h留尿法留尿法尿菌落计数低于标准时应考虑如果尿培养菌落数较少 除考虑污染因素外，还可能有以下原因：用抗生素治疗 尿液稀释 尿PH8.5细菌生长受阻 尿频，在膀胱贮存时间短，菌落数少 尿道口消毒液混入标本中 标本采集后立即送检(1h内),不能立即运送者应存放在4冰箱内保存。标本运送标本运送粪便标本粪便标本送检目的：粪便标本病原学检查有助于对一些肠道感染性疾病进行病原学诊断和鉴别诊断；为临床治疗提供合理的抗生素选择；及对肠道菌群进行监测，预防菌群失调。总体原则：应在腹泻急性期(3天内)及用药前采样。1、腹泻患者于急性期，尽量在用药前采 集粪便。2、伤寒患者于发病
14、2周后采集粪便。3、怀疑霍乱时立即采集粪便送检。采集时间采集时间1.1.自然排便采集法：自然排便采集法：自然排便后，固体粪便挑取脓血、粘液部份23；液体粪便取絮状物23ml，盛于无菌容器内送检。2.2.直肠拭子法：直肠拭子法：对不易获取粪便者，将无菌棉签用甘油盐水湿润后，插入肛门内45cm(幼儿23cm)处，轻轻旋转，擦取直肠表面粘液后取出,插入无菌试管或保存液中送检。采集方法采集方法标本采集后应立即送检(1小时以内),不能立即送检时应放入pH7.0的磷酸盐甘油中保存。标本运送标本运送呼吸道标本呼吸道标本上呼吸道标本：咽拭子、鼻拭子下呼吸道标本：痰上呼吸道标本：上呼吸道标本：最好在清晨，用清水
15、漱口，由检查者将舌最好在清晨，用清水漱口，由检查者将舌向外拉，使悬雍垂向外牵引，用无菌棉拭向外拉，使悬雍垂向外牵引，用无菌棉拭子在扁桃体区域、咽后壁及口腔溃疡处局子在扁桃体区域、咽后壁及口腔溃疡处局部反复涂抹采样，然后放入无菌试管内立部反复涂抹采样，然后放入无菌试管内立即送检即送检。采集办法采集办法下呼吸道标本：下呼吸道标本：要求采集肺深部的痰液,避免采到唾液，常见方法：自然咳痰法：最好采集晨痰,在取标本之前,用清水反复漱口几次，再从气管深部咳出第一口痰，盛入无菌容器中立即送检。气管镜采集法：在病灶附近用导管或用支气管刷直接取得标本。小儿采集法：用弯压舌板向后压舌，用无菌棉拭深入咽部，小儿经压
16、舌刺激咳嗽时，可喷出肺部和气管分泌物，粘在棉拭上，将棉拭放入无菌管中立即送检。气管穿刺法：通过气管穿刺取得痰液，主要用于厌氧菌培养。通常以自然咳痰法采集标本最常见。应嘱咐患者晨起漱口，咳深部痰，告知唾液的培养结果对临床无指导意义，以便引起患者对留取标本的重视。检验痰液标本是否合格应进行涂片。涂片合格后的痰标本建议使用盐水稀释方法接种于相应培养基上 痰涂片显微镜检查判别标准分类细胞数/低倍视野标本判别白细胞鳞状上皮细胞A 2510合格，用于细菌培养B251025尚合格，可用于细菌培养C10 25不合格，建议重送标本标本采集后应立即送检,以防某些细菌在外环境中死亡。作结核分枝杆菌或真菌培养的痰液如
17、不能及时送检，应置于4冰箱保存。标本运输标本运输分级划线区菌落数目1区2区3区少见（1+）10少量（2+）105中量（3+）1055多量（4+）1055 痰标本在平板上的菌落量化指标注：1+多为污染，2+污染可能，3+感染可能，4+多为感染病原菌一般应在用药之前或停止用药12天后采集标本。1、脑脊液标本（1）采集时间：怀疑脑膜炎时应立即采集脑脊液，最好是在应用抗生素之前采集脑脊液。（2）采集方法:无菌腰穿采集脑脊液脑脊液1-3ML1-3ML注入血培养瓶注入血培养瓶中中。2、穿刺液标本（1）穿刺液标本包括胸腹水、关节液等。（2）无菌操作穿刺抽取标本1ML立即送检。3、胃液及胆汁：抽取5ML左右后
18、置于无菌管中立即送检。4、深部脓液：用无菌注射器抽取后立即送检。脑脊液与其他无菌体液标本脑脊液与其他无菌体液标本 采集方法采集方法1.脑脊液标本：无菌操作腰椎穿刺，抽取脑脊液23ml于无菌试管中送检。其它无菌体液标本以无菌操作抽取标本送检。2.其他无菌性体液：无菌操作（浆膜腔穿刺液）大量留取脑脊液标本采集后应立即保温送检或床旁接种,不宜置于冰箱保存。胸水、腹水等无菌体液标本采集后立即送检或置于冰箱4保存。脑脊液不能存放于标本脑脊液不能存放于标本其他标本可放于冰箱保存其他标本可放于冰箱保存 立即送检立即送检标本运输标本运输眼、耳部标本眼、耳部标本 无菌采集 拭子采样 局部麻醉后取角膜刮屑 立即送
19、检 一般应在用药之前或停止用药710天采集标本。泌尿生殖道标本泌尿生殖道标本 男性尿道拭子男性尿道拭子女性宫口取材女性宫口取材按摩前列腺按摩前列腺采集方法采集方法男性尿道口分泌物：先用生理盐水局部清洗，用无菌棉拭插入尿道口12cm，停留半分钟，轻轻旋转采集标本女性阴道及宫颈口分泌物：则需在窥阴器下操作,用长的无菌棉拭采集分泌物前列腺液：按摩标本采集后应立即送检或放于保存液中置4冰箱内保存（淋球菌培养除外）。标本运送标本运送创伤、组织、和脓肿标本创伤、组织、和脓肿标本最好在抗生素使用之前采集标本。在创伤出血时、敷用药物2h内及烧伤后12h内不应采集标本。总体取材原则：取接近新生组织处的标本，既可
20、以提高阳性率，又能获得该部感染病原菌，中心部位的脓汁，由于营养差，不利于细菌生长，阳性率低。开放部位的脓汁采集，应首先用无菌生理盐水冲洗表面污染菌，然后挤压深部组织里的脓汁进行培养。取组织进行培养最好。1.清创、消毒2.大面积创伤：多部位采样3.封闭性脓肿：无菌注射器抽取4.开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶深部的分泌物，5.瘘管：取组织碎片6.厌氧菌感染：应采集深部脓液并隔绝空气运送。排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检采集方法采集方法伤口标本采集要求 1、在伤口切开排脓时留取标本 2、不能在伤口清洁消毒后留取标本 3、尽量采集伤口深部的浓汁送检组织或吸取物中革兰染色的评价镜下所见备注
21、出现鳞状上皮细胞标本采集技术不过关，培养提示皮肤菌群污染大量中性粒细胞长时间仔细寻找病原菌，这时菌有可能在细胞内大量的中性粒细胞，混合G-和G+小细菌混合厌氧或兼性厌氧菌感染少见或可见破损的中性粒细胞和粗大G不定的或G+b可能是梭菌属细菌引起的组织坏死，手术应激，提示产期荚膜梭菌引起的气性坏疽中性粒细胞罕见，无其他体细胞病人没能产生足够的免疫反应，或细菌没有能激活中性粒细胞（如球菌），仍然高度怀疑细菌感染细胞内微生物活动性细菌感染小的、浅的、不规则、链状排列G+c呈堆排列如果分离自脓肿,提示咽峡炎链球菌群(米勒链球菌)很细小G-b特别是如果标本为淋巴结或组织时，这些菌可能为生物恐怖病原菌（布氏
22、杆菌，耶尔森菌，弗朗西斯菌），标本须在安全柜里处理。平皿需用胶带封起来，培养物只能在生物安全柜中进行。不可闻平皿。脓液标本采集后应立即送检或存放于保存液中。标本运输标本运输影响微生物检验的其它因素 标本容器是否合格应该采用无菌、清洁、干燥、无溢漏的容器盛装标本，血液、骨髓、无菌体液等标本采用仪器法培养时，应将标本直接注入特定培养瓶中，但在注入标本之前，应该将瓶塞进行消毒。根据标本的种类选择合适的容器。厌氧菌培养，应将标本置厌氧环境容器中送检，以免厌氧菌接触空气死亡 送检时间 标本 采集后应立即送检，一般细菌培养送检时间不应超过 2小时，苛养菌应在30分钟内送检，否则，细菌死亡，导致培养结果阴性
23、。对于客观条件限制，不能立即送检的标本，应用转运培养基保存标本送检。血培养标本应放置室温保存。标本采集的量要符合标准 太少：捕捉细菌的几率少；太多：与培养基比例不适当，营养供给不足不合格标本的处理 标本标识与申请单不一致；采集的标本与申请单不一致；非无菌容器留取的标本或采用不合格的容器；容器中无标本；将有菌容器的标本重新倒入无菌容器；盛标本的容器未加盖；取材后将标本放置时间过长；换药后取材；从输液管直接采集标本；正在点滴抗菌药物过程中采集血液标本；用注射器直接送检血液标本；从尿液收集袋中直接抽取标本；用拭子采集厌氧菌标本；对于这些不合格的标本实验室应拒绝接受，在拒绝接受的同时，要及时通知临床医
24、生或护士，说明标本采集不合格的原因，并给予正确指导。血平板：适合于各类细菌生长 巧克力平板：含V、X因子 中国蓝平板或伊红美兰平板：弱选择性培养基 麦康凯平板：中等强度选择培养基 SS琼脂平板：强选择培养基 碱性琼脂或TCBS琼脂：弧菌 血液增菌培养基 营养肉汤 厌氧平板 标本接种 平板培养基在使用前应放孵育箱中烘干表面的水分，取材 接种方式：不同的标本有不同的要求 培养环境：气体（氧气，CO2，）、厌氧、温度、湿度 培养时间 病原菌的选择及纯化 根据标本来源不同，选择有临床意义的病原菌，特别注意有正常菌群部位标本中病原菌的选择（如痰、咽、粪便标本）。将挑选出的细菌分纯、涂片后进行菌种鉴定。结
25、果回报结果回报 审核：包括患者信息和检验结果及报告内容。核对患者的信息资料：如姓名、性别、年龄、标本种类、检验项目等。病人结果的确认：审核菌种和所测试的药敏结果，包括以下内容：药敏结果与菌株鉴定是否一致 单个药敏结果与特定药物种类中活性规则层次是一致的（如三代头孢菌素对肠杆菌科细菌抗菌活性高于一、二代头孢菌素）。分离株未被证明耐药及“仅有敏感”解释标准的药物是敏感的，如化脓性链球菌和无乳链球菌对万古霉素是敏感的；头孢噻肟和头孢曲松对流感嗜血杆菌是敏感的。出现非常见或者不一致结果，应分析错误原因：誊写错误 试剂污染 查找非常见或不一致结果原因，必要时重新进行菌种鉴定和药敏试验，可以考虑换一种试验
26、方法。比如；氨苄青霉素耐药的肺炎克雷伯菌；青霉素耐药的化脓性链球菌等。评论或修正 对于某些细菌或具有某些耐药表型细菌的药敏结果，其体外药敏试验可能与临床疗效不一致，应该给与评论或对其结果进行修正。下列抗生素/微生物组合在体外可出现活性，但临床上无效，不应报告敏感：产ESBL（超广谱-内酰胺酶）肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌：对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南不应报告敏感。沙门菌属、志贺菌属：一、二代头孢菌素和氨基糖苷类不应报告敏感。苯唑西林耐药的葡萄球菌属细菌：对所有青霉素类、头孢菌素类和其他-内酰胺类，如阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦和亚胺培南不应报告敏感。肠球菌属
27、：氨基糖苷类（除外高浓度）、头孢菌素类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑不应报告敏感。嗜麦芽窄食单胞菌：对于亚胺培南天然耐药非发酵型细菌（如铜绿假单胞菌、不动杆菌）：对于一、二代头孢菌素耐药 与临床沟通 向临床医生了解患者的情况，对检验结果的判断有重要意义，如患者的症状体征、标本采集的部位、患者的用药情况等。给临床医生一些建议，如在长期应用抗菌药物治疗过程中，有些细菌易发生耐药，对这类细菌应建议临床医生进行同一部位标本的重复测试。这类细菌如下：肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属 肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属在用3代头孢菌素长期治疗时，可以产生耐药，所以最初敏感株治疗3-4天后应建议临床医生重复进行实验。铜绿假单胞菌在用抗生素长期治疗过程中易产生耐药，在治疗34天后可耐药，应告知临床重复试验。在长期应用氟喹诺酮治疗过程中葡萄球菌属易发展为耐药，所以在治疗34天后应重复测试。积极配合临床正确采集标本，如厌氧培养、特殊部位的取材等。分级报告 对于培养时间长或危及患者生命的培养结果，要进行分级报告，以便使临床医生尽早获得检验信息，积极进行有效救治，如血培养、真菌培养等。做好咨询解释工作和宣传工作。
