1、血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离一、关于血红蛋白一、关于血红蛋白 血红蛋白是_动物红细胞的主要组成成分，负责血液中_的运输。血液由_和_组成，其中_细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以外，约90%是血红蛋白。血红蛋白由四条肽链组成，包括两条-肽链和两条-肽链。其中每条肽链环绕一个_基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有_而呈现红色。人和其他脊椎O2和CO2血浆各种血细胞红亚铁血红素血红素二、关于蛋白质的分离二、关于蛋白质的分离 不同的蛋白质，其分子的_、所带电荷的_、_、吸附性质和对其他分子的_等特性存在差异，可利用这些差异来分离不同种类的蛋白质。1 1、凝胶色谱法
2、、凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对_分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的_球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较_，移动速度较_；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较_，移动速度较_。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。形状和大小性质和多少溶解度亲和力分子质量的大小多孔小长慢短快 有部分小分子蛋白质没有进入凝胶内，在凝胶外移动，导致分离的蛋白质_。若需要得到纯度更高的蛋白
3、质，可用凝胶色谱法进行_。纯度降低再次分离加入样品加入样品样品的洗脱样品的洗脱1 1洗脱洗脱2 2洗脱洗脱3 3二、关于蛋白质的分离二、关于蛋白质的分离 2、电泳 电泳是指_。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上_。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子_以及_，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。_电泳和_电泳是两种常用的电泳方法。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它_以及_等因素。带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程正电或负电相反带电性质的差异分子本身的大小和形
4、状的不同琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶所带净电荷的多少分子的大小 思考1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小，其原理是？分析：SDS的作用：SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成_；SDS能与各种蛋白质（肽链）形成_，SDS所带负电荷的量_蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的_，使电泳迁移率完全取决于_。思考2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质的分子量，其原理是？分析：使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组_的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过换算，可以测定样品蛋白质的分子量。单条肽链
5、复合物大大超过电荷差别分子的大小已知分子量 思考思考2 2、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质测定蛋白质的的分子量分子量，其原理是？，其原理是？分析：使用分析：使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组已已知分子量知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定得的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定得换算，可以测定未知蛋白质的分子量。换算，可以测定未知蛋白质的分子量。思考3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的结果是_（整个血红蛋白/单条肽链）
6、的分子量。思考4、丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，因此，操作时需要戴上_，而且在_内进行。3 3、缓冲溶液、缓冲溶液 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。缓冲溶液通常由1-2种_（例如H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等）溶解于_中配制而成。调节_就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。缓冲剂水单条肽链手套和防毒面具通风橱缓冲剂的使用比例血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液三、
7、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液 1、干凝胶吸水膨胀。2、凝胶色谱柱的装填：将吸水膨胀的凝胶颗粒沿玻璃管内壁灌入，同时轻轻敲击管壁，排出柱内气泡，并保证柱床上表面平整。静置，使凝胶颗粒沉降至柱内出现清晰固液分界面。3、凝胶珠装填完成之后，需要立即连接磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液 样品加入：滴管尖端紧贴柱内壁，以匀速转圈的方式沿内壁加入样品，保证样品在凝胶上表面均匀分布，形成狭
8、窄、均匀、整齐的圆环状样品层。洗脱：以匀速转圈的方式沿内壁加入磷酸缓冲液，不能冲乱整齐的环状样品层。加入样品加入样品样品的洗脱样品的洗脱1 1洗脱洗脱2 2洗脱洗脱3 3三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液 思考5、人们用人的红细胞为材料提取血红蛋白，而不是用鸡的红细胞提取，原因是？分析：人的红细胞无细胞核，_，便于提取血红蛋白。思考6、采血容器中要预先加入柠檬酸钠，目的是_。思考7、洗涤红细胞的目的是_。思考8、从红细胞中释放血红蛋白时，加甲苯的作用是_。思考9、红细胞破裂之后，经高速离心，溶液分为4层，从上往下分别是_、_、_、_。思考10、如何
9、除掉脂溶性沉淀？_。血红蛋白含量丰富防止血液凝固洗去血浆蛋白等杂蛋白溶解细胞膜,加速红细胞破裂甲苯层白色脂溶性沉淀层红色血红蛋白水溶液层暗红色杂质沉淀层过滤 思考11、如何除掉甲苯？_。思考12、“红细胞的洗涤”时用到_（低速/高速）离心就能将红细胞与其他物质分开，因为红细胞与其他物质的密度差异_。而“分离血红蛋白溶液”时用到_（低速/高速）离心，因为血红蛋白和其他成分的密度_。思考13、对血红蛋白溶液进行粗分离的方法是_。具体操作是：取1mL的血红蛋白溶液装入_中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的_中（pH为7.0)，透析12h。思考14、透析袋一般是用_（又
10、称玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子血红蛋白保留在袋内。透析可以去除样品中_，或用于_。分液漏斗分液低速较大高速比较接近透析透析袋磷酸缓冲液硝酸纤维素分子量较小的杂质更换样品的缓冲液 思考15、商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需12h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的_，排除胶粒内的_。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶（SephadexG-75）。“_”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示_，即_。思考16、凝胶珠装填完成之后，需要立即连接_，在约50
11、cm 高的操作压下，用300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶_。微生物空气G凝胶得水值每克凝胶膨胀时吸水7.5 g缓冲液洗脱瓶装填紧密 思考17、凝胶柱内一旦有气泡且无法去除，必需重装，原因是？分析：_。思考18、某实验小组的同学决定重新装填凝胶色谱柱，可能的原因是？分析：发现凝胶柱内_；操作过程中，出现了_的现象。思考19、在蛋白质分离过程中，仔细观察_色区带在洗脱过程中的移动情况。如果_，说明色谱柱制作成功。思考20、请从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀？分析：如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无
12、效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱_，影响分离的效果。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果有气泡且无法去除洗脱液流干，露出凝胶颗粒红红色区带均匀一致地移动洗脱液的洗脱次序三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液 蛋白质在蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带中的迁移率取决于它所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的分子的大小大小。思考思考1 1、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小，其原理是？
13、只取决于它的分子大小，其原理是？分析：分析：SDSSDS的作用：的作用：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成能使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链单条肽链；SDSSDS能与各种蛋白质（肽链）形成能与各种蛋白质（肽链）形成复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量所带负电荷的量大大超过大大超过蛋白质（多肽）蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的电荷差别电荷差别，使电泳迁移率完全取，使电泳迁移率完全取决于决于分子的大小分子的大小。思考思考2 2、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质测定蛋白质的的分子量
14、分子量，其原理是？，其原理是？分析：使用分析：使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组可选用一组已知分子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定得换算，可泳区带位置，经过一定得换算，可以测定未知蛋白质的分子量。以测定未知蛋白质的分子量。正在电泳电泳结果2.纯化结果鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Marker纯化前纯化后1纯化后297KD66KD45KD20.1KD14.4KD（一组已知分子量的蛋白质）（一组已知分子量的蛋白质）电泳结果Marker 纯化前 纯化后1 2 31 2 3Marker 纯化前 纯化后A方法纯化结果B方法纯化结果
