1、多肽抗原的设计与抗体制备第二版 多肽抗原的设计 多肽的固相合成和纯化 多肽的交联和免疫 抗多肽抗体的检测和功能学鉴定 抗体的纯化 怎样利用Internet 的免费资源寻找与抗体相关的信息 抗合成肽类抗体制备程序免疫原性肽的选择肽的合成、纯化与鉴定载体蛋白的选择连接剂的选择载体蛋白/肽连接物免疫动物McAb的制备ELISA筛选抗体血清反应性收集阳性血清Western blot,Immunofluorescence assay 鉴定抗体的生物学功能阳性抗体的纯化抗体制备常用的免疫原 1：表达纯化一段或全长的重组的带GST,Histag的融合蛋白 Abnova corporationAbnova c
2、orporation 2：利用合成肽制备抗体 AVIVA SYSTEMS BIOLOGYAVIVA SYSTEMS BIOLOGY LIFESPAN BIOSCIENCES LIFESPAN BIOSCIENCES 3：利用纯化的天然蛋白免疫原性肽选择的基本程序利用在线设计软件或DNAStar筛选抗原性强的多肽序列尽量使用N端或C端的序列该序列经Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守用peptide companion 软件判定易于合成的14-16个氨基酸免疫原性肽选择的注意事项避开信号肽，磷酸化，糖基化位点避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zinc
3、 finger，SH2 domains，GTP binding sites。有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcript variants），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多肽 利用Swiss-Prot数据库辅助设计.UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 CNTFR_HUMAN Ciliary neurotrophic factor receptor alpha.htm多肽的固相合成 此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的C-端
4、羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。合成原料 Fmoc-AA(prot)-Wang resin 提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质 例如：Fmoc-His(Trt)-Wang resin Prot：Boc,tBu,Trt,OtBu 侧链活性位点的保护基团 Fmoc:-NH2保护基团：Boc:Trt:Fmoc-AA(Prot)-OH Solvent 1:DMF Solve
5、nt 2:20%pipdine/DMF Solvent 3:0.4M NMM/HBTU/DMF Solvent 4:50%ACN/DMF Solvent 5:methylene chloride Solvent 6:94%TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O标准合成程序Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 Reagent(AA)1 00:00:00 off 1
6、 5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on 1 6 DMF 1 00:00:30 on 3标准切割程序Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 methylene chloride 1 00:00:30 on 6 5 Dry 1 00:10:00 on 1 6 TFA 2 02:00:00 on 1 7 TFA 1 00:00:30 on 1 8 methy
7、lene chloride 1 00:00:30 on 3 9 Dry 1 00:02:00 on 1 多肽合成的一般常识固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。为了保证合成的效率和纯度，我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa的多肽。减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cys,Met,Arg,or Trp的含量。避免多肽序列中连续3到4个疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，Ile-I，Met-M，Phe-F）避免Asp-Pro序列避免多肽序列中最后一个氨基酸是Pro。PIWIL3 SR0015 FFLKHGSNFQNPPPCaspase 2 SR0024 TDTVEHSLDNKDGPCa
8、spase 7 SR0032 DRVARHFESQSDDP切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有 多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF 极难溶 DGCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRL TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS 不溶于甲醇 可以用peptide companion 软件辅助判定多肽合成的难易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考虑TIE1 SR00043 DRPEETSTIIR
9、GLN BAG4：SR00079 LRRSGYGPSDGPSY SR00007 Dicer GKVRVTVEVVGKGK 多肽的鉴定和纯化合成完整长度粗肽的纯度不仅取决于多肽的本身长度和序列的特异性，还和使用的各种试剂的质量密切相关，因此我们合成多肽使用的试剂都是色谱纯。Fmoc固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在95%以上。对于一个15aa的粗肽，其完整长度多肽的合成效率一般在50%左右。长度2345678合成效率%95908581777369长度%9101112131415合成效率%66625956535048长度%16171819202122合成效率%45434140373537质谱分析（
10、MS/ESI）用途：测定合成的粗肽产物中目标肽的分子量，以此来衡量我们合成的肽序列是否正确原理：将样品分子离子化后，根据离子间不同的质荷比（m/z）来分离并确定分子量。TPTE SR00283:(CH3CO)RVSENKRRYTRDGFC MW：1887.13+42=1929.13TNFRSF13B SR00306（NH2）PELRRQRSGEVENNSD MW：1885.99 多肽粗品中一般含有非全长多肽,非多肽类杂质。非多肽类杂质主要是指去保护过程中产生的一些保护性基团，多肽裂解过程中的一些原料如DTT、TFA等。粗肽的一般后期纯化处理有脱盐，离子交换色谱，反相HPLC。国内外的多肽公司可
11、以根据用户要求的纯度选择不同的纯化方法。多肽的纯度分析一般使用反相HPLC，通常都能得到较好的分析效果。多肽脱盐（凝胶过滤法）原理：利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法。表 葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性品 名干胶颗粒直径/m得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量Da线性葡聚糖分子质量/Da20lOOSephadex G-1O40-1201.00.12-3700700319810(
12、100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100中
13、粗超细40-12010-4010l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)Sephadex G-150中粗超细40-12010-40151.520-305000-4000001000-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗超细40-12010-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)多肽脱盐条件选择Sephdex G-15:适用于分子量在1500-2000多肽的脱盐，对于分子量超过1500的多肽能够完全排阻。柱子的选择：鼎国自产10mm20cm色谱柱柱床体积：根据上样体积确定，一
14、般柱床的体积不要少于上样体积的10%。我们一般脱盐1.0ml的多肽，柱床体积通常选者10-15ml。洗脱速度：洗脱速度会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。流速通常选择 1ml/min洗脱夜:PBS，0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3)检测波长：214nmSR0002脱盐结果称取SR0002约7.0mg,溶于1.0ml的0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3)过柱收集：500ul/管OD214(空白）=0.664 (1)OD214=0.704 (7)OD214=0.869
15、(2)OD214=0.713 (8)OD214=1.095(3)OD214=0.710 (9)OD214=0.909(4)OD214=0.718 (10)OD214=0.780(5)OD214=0.724 (11)OD214=0.661(6)OD214=0.742 (12)OD214=0.598峰形区带变宽，收集第（6），（7），（8），（9），（10）管共约2.5ml，会有部分损失。多肽RL-HPLC分析RL-HPLC是一种分辨率最高的分离分析方法，可以分开长度上相差一个氨基酸的多肽。流动相中溶质分子与固定相配基间的疏水性相互作用形成的“on-off”机制。RL-HPLC分离多肽的基础是待分
16、离多肽间“疏水脚”的细微差别，这些差别来源于氨基酸序列和构象的差异。SR0001多肽的RL-HPLC分析 色谱柱：瑞典进口填料Kroamsil C18柱 250*4.6mm,5um,120A(2,000MW)分析程序：洗脱液A(弱移动相）:500ml 0.1%TFA in H2O 洗脱液B(强移动相）:500ml 0.09%TFA in 60%acetonitrile/40%H2O（V/V)样品溶解：0.25mg SR0001溶于80ul A液中，加入不超过总体积25%的B液（即20ul)助溶。取80ul加入4ml的水稀释，上样20ul/1ug。Linear A B gradient Elue
17、nt A:0.1%TFA in H2O Eluent B:0.09%TFA in 80%acetonitrile/40%H2O（V/V)Gradient range and time:95%-0%A in 90 mins 5%-100%B in 90 mins Flow rate:0.8-1.0ml/mins Gradient rate:1%B/mins Detection:214nm Temperature:25 SR00001 RL-HPLC分析结果 如果我们独立的看这一张色谱峰形图，我们并不能确定这个主峰就是代表合成的完整的多肽，需要联合进行质谱分析其分子量，从而最终确定该峰是否代表合成
18、的完整的多肽。对于合成的18个aa以下的多肽，通过RL-HPLC分析通常都能得到单一的主峰。因为在我们的合成程序中并没有引入别的反应程序，而且每步反应的效率都在95%以上，因此根据经验我们就可以认为该主峰就是代表我们合成的完整多肽。根据实验目的来确定多肽是否需要纯化或者纯化到什么级别，免疫级别的多肽一般纯度达到70%就可以了。多肽的溶解和保存 多数肽易溶于无菌的PBS 对于碱性肽来说（K,R,H),如果一开始用PBS不溶解，用10%或更高浓度的乙酸溶解。如果肽仍然不溶解，加入1/20体积的TFA溶解 对于酸性肽来说（D,E),如果一开始用PBS不溶解，加入2000KD 6.9-NH2，1.7-
19、SH，7.0 酚基 BSA:MW 67KD 59-NH2，1-SH，19酚基 OVA:MW 43KD 20-NH2，4-SH，10酚基 肌红蛋白：MW 17KD 19-NH2，0-SH，3酚基 绝大多数国外的抗体公司用KLH作为载体蛋白。交联方法 MBS法 戊二醛法 EDC法MBS Coupling EDC method 以上的四种交联方法中，最常用的还是前三种，但是戊二醛法，EDC法，都有一定程度的二次反应。偶联剂修饰的氨基酸初次反应二次反应MBSCys-SH戊二醛-NH2Lys，-NH2，SH-CysTyr，HisEDC-NH2Lys，-NH2，-COOH，Glu，AspTyr，Cys 不
20、同的肽序列应该选择不同的偶联方法。偶联是一定要发生在多肽的末端，避免偶联发生在多肽的中间序列。N-端序列需要通过C-端氨基酸偶联，而C-端序列则需要通过N-端氨基酸偶联。CLIC1（241aa)SR00239(147-160aa):PLPEEVDETSAEDE （NH）B S A（NH）PLPEEVDETSAEDEKK(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDE(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDEK(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDEK(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDE典型的错误偶联方式CLIC1（241aa)SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQK
21、L B S AK(NH)VDTKRRTETVQKL(HN）K(NH)(HN)VDTKRRTETVQKLK(NH）（HN）VDTKRRTETVQKLK（NH）(HN)VDTKRRTETVQKL赖氨酸(K）含有游离的-氨基，他也可以通过戊二醛与载体分子上的氨基以共价键结合，可能会影响多肽链上赖氨酸及其附近氨基酸残基暴露的侧链的免疫原性 或者产生的抗体不是针对天然蛋白中的多肽的确切结构。K(NH)(HN)正确的偶联方式在其C端加上一个C，用MBS法CLIC1（241aa)SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQKLCB S AK（NH）(HS)VDTKRRTETVQKLCK（NH）(
22、HS)VDTKRRTETVQKLCK（NH）VDTKRRTETVQKLC（SH)K(NH)VDTKRRTETVQKLC(SH)K(NH)VDTKRRTETVQKLC(SH)来源于蛋白中间序列多肽的偶联可以发生在N端，也可以发生在C端，但是我们一般会选择偶联在免疫原性相对较弱的一端。有的公司提到：来源于蛋白中间序列的多肽，为了最大程度的模拟其在天然蛋白中的位置，其N端常乙酰化，C端酰氨化。有的公司则认为没有必要，而且这样做常常会增加多肽的疏水性，导致溶解度减小。Location in the native proteinN-terminusinternalC-terminusIs there a
23、 C in sequenceAdd a C to c-terminus(MBS)Redesign sequenceChoose which terminal is conjugatedN-terminal conjugationIs there a K in sequence戊二醛Add a C to N-terminalRedesign sequenceIs there a C in sequenceAdd a C to N-terminalRedesign sequenceIs there a C in sequenceRedesign sequenceAdd a C to C-termi
24、nalConjugation Chemistry Determination Flow DiagramnoyesC-terminal conjugation Is there a C in sequencenoyesnoyesyesnoyesno made by puyong 2006.5.27肽与载体蛋白偶联结果观察连接物中多肽与载体蛋白的分子比影响其诱导免疫应答的效应。分子比太低，常常引起无关的免疫应答；分子比过高，易诱导低特异性抗体的产生。最适合分子比为：一个BSA分子与5-15个半抗原分子结合。我们交联后的肽-载体蛋白复合物，理论上平均一个BSA分子上面交联了20个多肽分子。肽与载体蛋
25、白的偶联反应是一种比较稳定和充分的化学反应，戊二醛的偶联效率通常能达到80%以上，MBS的偶联效率通常能达到90%以上。因此，很多公司认为没有必要进行这一步的检测。我们对偶联结果通过SDS-PAGE做了定性检测。偶联结果：SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色MBS偶联多肽免疫免疫动物：健康新西兰大白兔1只饲养条件：温度：15-25 饮食：100g 兔饲料/天，并配以白菜胡萝卜少许 卫生：专人每天负责清洗粪便托盘，拖洗地面，定期消毒。免疫方案：500ug多肽/1ml+1ml 完全佐剂混匀,皮下注射4-5点间隔一周500ug多肽/1ml+1ml不完全佐剂混匀，皮下注射4-5点共加强3次第七周取血ELI
26、SA检测、收集血清。多肽免疫注意事项 佐剂与抗原一定要充分混匀，以混匀后静置长时间不分层作为混匀充分的标准。每种抗原大概1.5ml,一般皮下免疫四到五点，每点大约0.25m，每点间隔大概1-2cm.不能为了图省事，就直接免疫一到两点，这样抗原的吸收会不好。每次免疫要新选择兔子背部上未免疫区域，因为免疫过的区域皮肤有时会结痂变硬。免疫过程中尽量避免扎到血管，引起出血和感染。兔子取血和血清保存颈动脉取血，每只兔子大概能收集35ml左右的血清。分装2.5ml（0.5ml血清+0.5ml甘油）其余的血清冻于-28，禁止冻融。血清一般不建议加叠氮钠，因为叠氮钠上的氨基基团会干扰偶联反应和许多标记反应。而
27、且我们取血的器械，50ml离心管都是经过高压灭菌的。抗多肽抗体的检测和功能学鉴定肽封闭实验确定抗体的特异性 Western 实验中经常能见到一条或超过一条带，为了确定哪一条带是特异性的针对抗多肽的抗体。例如：Fas:（335aa)SR0065(42-55aa)TTVETQNLEGLHHD 戊二醛 交联实验步骤 1：确定Western 实验所用抗体的效价和血清量 通常我们一条膜需要用 5ml blot buffer,按 1:50稀释血清,需要100ul 血清。2：封闭所用的抗原肽一般为血清量的5到50倍。也就是说如果1ug的血清，需要5到50ug的多肽。来源于兔血清总抗体浓度为10ug/ul,特
28、异性抗体的浓度一般为总抗体的10%，也就是1ug/ul。100ul的血清需要封闭的肽量为1mg。3：称取1mg肽溶于900ul PBS中，加入100ul血清，37翻转2小时，4 翻转5小时。同时做一不加多肽的对照。4：4，12000rpm,15mins.小心的吸取上清作为一抗加入到反应盒中 结果观察 阳性结果Fas SR0065阴性结果TOP2A SR0065抗体纯化 DEAE-纤维素 Protein A 多肽抗原柱亲和纯化亲和纯化NH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH
29、-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH2-TrisNH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH2-TrisNH2-TrisNH2-TrisNH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH-PEPTIDENH2-TrisNH2-Tris+交联封闭结合洗脱Made by puyong 2006.6.4多肽抗体的纯化结果 SIP1（HA）YPYDVPDYA纯化前19/10/05 2mins纯化后11/12/05 曝光过夜纯化
30、抗体考马斯亮蓝染色结果甘氨酸洗脱（1)高值甘氨酸洗脱（1)低值三乙胺洗脱（1）高值三乙胺洗脱（1）低值protein markerBSA 4ug甘氨酸洗脱(2)高值甘氨酸洗脱(2)低值三乙胺洗脱（2）高值三乙胺洗脱（2）低值甘氨酸洗脱（3)高值甘氨酸洗脱（3)低值三乙胺洗脱（3）低值三乙胺洗脱（1）高值注：每种洗脱的抗体均上样10ul SR0002 Drosha GAAMDALEKYNFPQ纯化前19/10/05 2mins将SROOO2甘洗脱(1)高值5.5ml，甘洗脱(2)高值3.2ml,甘洗脱(2)低值8ml，甘洗脱(3)高值2.7ml,甘洗脱(3)低值2.7ml,三乙胺洗脱（3）高值3
31、.3ml收集在一起共25ml，加入NaN3至终浓度0.05%，BSA至终浓度0.5%。混合后的抗体再次进行Western 检测，结果见下图：未纯化血清混合后的抗体1:100混合后的抗体1:50混合后的抗体1:25混合后的抗体1:25016/12/05 30mins16/12/05 30mins纯化抗体考马斯亮蓝染色结果2ugBSA4ugBSAProtein marker甘氨酸洗脱（1)高值甘氨酸洗脱（1)低值甘氨酸洗脱（2)高值甘氨酸洗脱（2)低值甘氨酸洗脱（3)高值甘氨酸洗脱（3)低值三乙胺洗脱（3）高值三乙胺洗脱（3）低值8/12/05注：每种洗脱的抗体均上样10ul将不同次纯化的抗体混合
32、后考马斯亮蓝染色结果Protein marker0.5ug人IgG1ug人IgG2ug人IgG4ug人IgG10ul的混合抗体SR0002 Drosha 10ul的混合抗体估计在0.75ug左右，那么25ml的混合抗体总量估计在2mg左右。17/12/05SR0004 DGCR8 LHILSKLQEEMKRL阴性血清1:100SR0004-1 1:100SR0004-1 1:100SR0004-2 1:100SR0004-2 1:100冻融至少4次的Hela新裂解的Hela新裂解的Hela冻融至少4次的Hela未纯化血清1:100甘氨酸洗脱（1)1:50甘氨酸洗脱（2）1:50三乙胺洗脱（1）
33、1:50纯化前 7/11/05 曝光过夜纯化后 29/11/05 曝光过夜 SR0004 小量纯化抗体考马斯亮蓝染色结果Protein marker2ug人IgG12ul甘氨酸洗脱（1)12ul甘氨酸洗脱（2)12ul三乙胺洗脱（1）14/12/05抗体失去活性？SIP0002(C-myc)EQKLISEEDL商品化C-myc 1:1000未纯化血清 1:200甘氨酸洗脱1:50三乙胺洗脱1:5027/11/05 曝光过夜商品化c-myc 1:1000未纯化血清T-04 1:200血清结合后 1:20甘氨酸洗脱高值 1:2016/12/05 30mins注：上样SIP0002 C-myc小量纯
34、化的抗体考马斯亮蓝染色结果Protein marker2ug 人IgG甘氨酸洗脱（1）12ul三乙胺洗脱（1）12ul三乙胺洗脱（2）12ul14/12/05寻找原因血清中的抗体没有结合到C-myc交联的CNBr活化的Sephrose 4B上?C-myc多肽交联？多肽脱盐？6mg SIP0002脱盐结果214(空白）=0.122(1)214=0.122 (7)214=0.344(2)214=0.135 (8)214=0.308(3)214=0.185 (9)214=0.227(4)214=0.171 (10)214=0.186(5)214=0.139 (11)214=0.159(6)214=0
35、.229 (12)214=0.138(13)214=0.135 (14)214=0.137收集第（6）-（11）管交联方法？EQEQK KLISEEDLLISEEDLEQEQK KLISEEDLLISEEDL利用Internet 免费资源寻找与抗体相关的信息针对某种蛋白的多肽抗体，国外是否将已知多肽序列公布。TNFRSF6B/DcR3 SR00315(31-46):abcam公司：AETPTYPWRDAETGEC ESR1(595aa)SR00341(247-260aa)EVGMKGGIRKDRRGC 可以用来制备单抗抗体的功能学验证(WB,IHC-P,ICC)用的是哪些细胞或组 织作为阳性对照大多数蛋白的预测分子 量与Western曝光后显示 的分子量相一致，但也 有些蛋白的预测分子量 与Western曝光后显示的 有差异，甚至差异很大。例如CD40:TOP2A可能的影响因数 翻译后修饰：如磷酸化，糖基化，翻译后切割：如pro-caspase 转录异构体 氨基酸的组成 二聚体或多聚体
