1、第十九章第十九章 临床免疫学检验的质量保证临床免疫学检验的质量保证 第一节第一节 分析前质量控制分析前质量控制 第二节第二节 分析中质量控制分析中质量控制 第三节第三节 分析后质量控制分析后质量控制目的要求目的要求1.掌握免疫学检验质量控制的有关概念及质量控制原则掌握免疫学检验质量控制的有关概念及质量控制原则2.掌握标本的正确收集及处理掌握标本的正确收集及处理3.熟悉常用免疫学检验的质量控制、室间质量评价熟悉常用免疫学检验的质量控制、室间质量评价4.了解质量保证、室内质控和室间质量评价之间的关系，免疫学质量控制的意义了解质量保证、室内质控和室间质量评价之间的关系，免疫学质量控制的意义免疫学检验
2、质量控制的有关概念免疫学检验质量控制的有关概念1质量保证（质量保证（quality assurance，QA）2室内质量控制室内质量控制(internal quality control，IQC)3室间质量评价室间质量评价(external quality assessment，EQA)免疫学检验质量控制的有关概念免疫学检验质量控制的有关概念4准确度（accuracy）5精密度(precision)6标准品（standard character）7质控物(质控品，quality testing materials)质量保证：质量保证：为一产品或服务项目、为满足特定的质量要求而提供的具有充分可信
3、性所进行的、有计划和系统的措施室内质量控制：室内质量控制：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠程度目的是监测和控制本室常规工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作室间质量评价：室间质量评价：为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构采取一定的方法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定实时的测定结果的可接受性 准确度：准确度：即待测物的测定值与其真值的一致性程度准确度不能直接以数值表示，通常以不
4、准确度来间接衡量对一分析物重复多次测定，所得均值与其真值或参考靶值之间的差异亦即偏差，即为测定的不准确度 精密度：精密度：在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度与准确度一样，精密度同样也是以不精密度来间接表示测定不精密度的主要来源是随机误差，以标准差（SD）和/或变异系数（CV）具体表示SD或CV越大，表示重复测定的离散度越大，精密度越差，反之则越好 标准品标准品(物物)：指性质纯正的己知含量或成分的物质，通常用以比较检测未知的物质或成分标准品有WHO国际标准品和国家标准品质控物质控物(品品)：是用以校准物相同的介质制备的，具有较好的稳定性和重复性其作用主要是控制仪器的稳定性，以保
5、证仪器、试剂、工作环境具高度的稳定性第一节第一节 分析前质量控制分析前质量控制一、检验项目的申请二、患者准备三、标本的采集、传送与保存四、影响分析前质量的因素概述概述分析前程序，也称为检验前程序，按时间顺序，检验前程序始于临床医师提出申请，止于启动分析检验程序。其步骤包括检验申请、患者准备、原始样品采集、样本转运到实验室、在实验室内部传递及检验前标本的预处理的全部过程。一、检验项目的申请一、检验项目的申请要求：信息的规范性和完整性信息的规范性和完整性形式：电子、纸质、二者兼有或者口头（必须在规定时间内补充电子或纸质的才能执行）（一）申请单格式和填写（一）申请单格式和填写（二）检验项目的申请原则
6、（二）检验项目的申请原则（一）申请单格式和填写（一）申请单格式和填写患者信息：患者信息：患者姓名、患者性别及年龄、临床诊断、患者唯一性标示（住院号、门诊号、病案号等）申请医师信息：申请医师信息：医师姓名、科室、申请时间原始样本信息：原始样本信息：血液、尿液、脑脊液、胸腹水等（二）检验项目的申请原则（二）检验项目的申请原则 应结合患者的病情选择适合的检验项目应结合患者的病情选择适合的检验项目1.针对性针对性:检测指标要符合临床医师的检测目的2.有效性有效性:对诊断疾病的敏感性和特异性3.时效性时效性:结果回报的及时性4.经济性经济性:避免增加患者经济负担二、患者准备二、患者准备医护人员、样本采集
7、人员、检验技术人员应了解采集前患者的状态要求和影响结果的非疾病因素将相关的要求和注意事项通过合适的途径告知患者，以获得患者的配合保证所采集标本能客观真实反映当前的疾病状态三、标本的采集、传送与保存三、标本的采集、传送与保存标本的采集：可用作标本的采集：可用作ELISA的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成分，一般使用血清。泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成分，一般使用血清。标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧
8、化物酶活性物质干扰结果，可造成假阳性；标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰结果，可造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。长菌的标本同样的道理易产生假阳性。标本的采集标本的采集抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。标本在冰箱中保存时间过长易导致血清标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4冰箱冰箱5天内完成测试。天内完成测试。如需保存一周以上则要如
9、需保存一周以上则要-20冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。ELISA的灵敏度的灵敏度1ng/ml水平上水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫后最起码应先做免疫后做生化。做生化。标本的采集标本的采集 采样时间：晨起空腹 激素和治疗药物测定三、标本的采集、传送与保存三、标本的采集、传送与保存传送与保存：传送与保存：标本的传送过程中应保证标本的密闭、防震、防漏、防污染。四、影响分析前质量的因素四、影响分析前质量的因素检验前影响因素具有：检验
10、前影响因素具有：复杂性隐蔽性不可控性责任不确定性第二节第二节 分析中质量控制分析中质量控制分析中阶段是指从标本前处理到标本检测完成，形成报告结果的过程包括标本前处理、标本检测还应包括检测体系的建立、人员培训、检测系统的选择和性能确认、室内质量控制和室间质量控制、实验室间比对等内容分析中阶段是决定检验结果正确、可靠的关键工作人员培训工作人员培训特点：特点：项目广泛，技术众多，既有手工操作，又有自动化仪器操作根据实际工作需要，建立定期培训计划，保证工作人员的技术能满足临床免疫检验的需求工作人员培训工作人员培训 熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。熟悉检测仪器的原理及性能；掌
11、握数据处理的能力和质量控制知识。某些特殊项目的检测如抗某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。检验系统性能确认检验系统性能确认定量检测系统：定量检测系统：精密度（批内、批间）精密度（批内、批间）准确度准确度分析测量范围分析测量范围临床可报告范围临床可报告范围参考期间验证参考期间验证定性检测系统定性检测系统符合率（灵敏度符合率（灵敏度 特异度）验证特异度）验证精密度（批内精密度精密度（批内精密度 批间精密度，即中间精密度）验证批间精密度，即中间精密度）验证检出限验证检出限验证临界值（临界值（cut-off
12、值）验证值）验证方法学性能验证方法学性能验证 实验方案实验方案 实验计划实验计划 实验实施实验实施 实验报告实验报告标准操作规程的建立标准操作规程的建立在免疫测定中，试剂准备、加样、温育、洗板、显色和测定等每一步骤均可能对测定结果产生较大影响因此，需要将每个操作步骤标准化并形成“标准操作程序标准操作程序”（SOP），所有操作人员必须按照SOP进行试验操作加样加样在在ELISA中一般有中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样应用微量移液器（加样枪加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上
13、部，并注意不可溅出，不可产生气泡。处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。干吸头预先在血清中抽吸三次。加样加样样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需
14、振荡混匀。如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。ELISA竞争法的本质：酶标抗体与样本抗体在同样体系中，与固相抗原竞争结合是等比例关系。竞争法的本质：酶标抗体与样本抗体在同样体系中，与固相抗原竞争结合是等比例关系。正确的加样：应该先将样本与酶标抗体混合均匀，然后加入孔中反应。正确的加样：应该先将样本与酶标抗体混合均匀，然后加入孔中反应。实际工作中实际工作中 分开加分开加分开加会造成先加入的先结合，与后加入者并不是公平竞争关系，也不符合等比例原则。特别是在放置时分开加会造成先加入的先结合，与后加入者并不是公平竞
15、争关系，也不符合等比例原则。特别是在放置时间过长，温度过高的情况下，对结果的影响很大。间过长，温度过高的情况下，对结果的影响很大。有研究表明，有研究表明，2min后加入酶标抗体，由于标本比酶标抗体先结合了后加入酶标抗体，由于标本比酶标抗体先结合了2min，因此可出现，因此可出现7.4%的假阳性。的假阳性。30min后再加，假阳性率高达后再加，假阳性率高达57.4%。温育温育在在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后的显色反应。中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后的显色反应。温育常采用的温度有温育常采用的温度有43、37、室温和、室温和4（冰箱温度）等。（冰箱温度
16、）等。37 是实验室中常用的保温温度，也是大是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。多数抗原抗体结合的合适温度。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的。是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的。同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。显色和比色显色和比色HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的
17、时间和温度。催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度。一定要按照说明书规定的时间温度（一般为一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37C，10-15分钟）恒定反应后终止。分钟）恒定反应后终止。显色反应终止后应立刻比色（显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。分钟内）。报告方式报告方式定性试验定性试验 国内外为便于统一计算，一律按国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方式报告，方式报告，S为标本为标本A值，值，C.O即即Cut Off值（阳性判定值值（阳性判定值)夹心法和间接法以夹心法和间接法以S/C.O1为阳性；为阳性；竟争法与中和法以竟争法与中和法以S/C.O1为阳性为阳性室内质量控
18、制室内质量控制定量室内质量控制：定量室内质量控制：L-J质量控制图定性室内质量控制定性室内质量控制定性室内质量控制定性室内质量控制 定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC要保证：要保证：控制提供反应的仪器控制提供反应的仪器/系统的稳定性系统的稳定性（灵敏度和特异性）。灵敏度和特异性）。检出假阳性反应和假阴性反应（即符合率和一致性）。（检出假阳性反应和假阴性反应（即符合率和一致性）。（保证检测结果阳性就是阳性、阴性就是阴性保证检测结果阳性就是阳性、阴性就是阴性）HOOK效应的监控。效应的监控。质控物的选择：质控物的选择
19、：质控物来源：均采用自制质控物质。质控物来源：均采用自制质控物质。浓度梯度的设置：浓度梯度的设置：（1）阴性质控：）阴性质控：0.5倍倍Cut Off值附近的阴性值附近的阴性OD值值（2）阳性质控：）阳性质控：弱阳性质控：弱阳性质控：2-4倍倍Cut Off值附近的弱阳性值附近的弱阳性OD值值 阳性质控：试剂盒所带阳性对照阳性质控：试剂盒所带阳性对照OD值值控制提供反应的仪器控制提供反应的仪器/系统的稳定性系统的稳定性 建议采用弱阳性质控物作建议采用弱阳性质控物作Levey-Jennings质控图，横坐标（质控图，横坐标（X轴）表明的是检测日期，纵坐标（轴）表明的是检测日期，纵坐标（Y轴）用吸
20、光度值表轴）用吸光度值表示。示。旨在监测和控制本室常规工作的精密度、灵敏度，提高批内批间样本检验的一致性旨在监测和控制本室常规工作的精密度、灵敏度，提高批内批间样本检验的一致性检出假阳性反应和假阴性反应检出假阳性反应和假阴性反应 建议采用建议采用Westgard质控规则改良法对第三方阴性、弱阳性质控进行分析质控规则改良法对第三方阴性、弱阳性质控进行分析 绘制中心线和上下失控限三条线，中心线为质控物测量均值，利用临界值（绘制中心线和上下失控限三条线，中心线为质控物测量均值，利用临界值（cut off值）验证值确定上下失值）验证值确定上下失控限。控限。监控监控HOOK效应效应建议采用试剂盒中试剂盒
21、所带质控（阳性对照）的建议采用试剂盒中试剂盒所带质控（阳性对照）的OD值作值作Levey-Jennings质控图来监控，横坐标（质控图来监控，横坐标（X轴）表明的是轴）表明的是检测日期，纵坐标（检测日期，纵坐标（Y轴）用吸光度值表示。轴）用吸光度值表示。判断：当第三方质控（阴性、弱阳性）均在控时，试剂盒所带质控（阳性对照）下限超限，此时，应考虑判断：当第三方质控（阴性、弱阳性）均在控时，试剂盒所带质控（阳性对照）下限超限，此时，应考虑HOOK效应效应的发生的发生HOOK效应处理对策效应处理对策 当监控到当监控到HOOK效应的发生时，应在效应的发生时，应在LIS系统上回顾病人结果，对可疑结果、阳
22、性低值结果、在系统上回顾病人结果，对可疑结果、阳性低值结果、在cut-off值附值附近的结果采用同步稀释法进行重复试验近的结果采用同步稀释法进行重复试验室间质量控制室间质量控制室间质量评价：室间质量评价：为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构采取一定的方法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定实时的测定结果的可接受性室间质量控制室间质量控制室间质量控制实施途径：室间质量控制实施途径：室间质量控制可通过能力验证实验（简称PT）来实现PT是指多家实验室分析同一标本并由外部独立机构收集、
23、反馈实验室上报结果并评价实验室检测能力的活动国家级PT计划，由卫生部临检中心组织实施省级PT计划，有省临检中心组织实施实验室间比对和人员比对实验室间比对和人员比对实验室间比对是按照预先规定的条件，由两个或多个实验室对相同或类似检测物品（通常是患者新鲜标本）进行检测（主要针对一些不能参加室间质量控制的项目）人员比对是指实验室为发现及纠正不同工作人员从事相同检测项目而导致检测结果存在可接受的偏倚而采取的措施实验室环境、设施及设备的控制实验室环境、设施及设备的控制环境：环境：室温：18-25 湿度：30%-60%设施及设备设施及设备:辅助设备及仪器 包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标
24、仪。辅助设备及仪器辅助设备及仪器 移液器：移液器：ELISA加样量小（加样量小（5-100l），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在10%以内；以内；水浴箱水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有1的误差；的误差；辅助设备及仪器辅助设备及仪器 洗板机洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过每
25、个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过3ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；是否堵塞；酶标仪酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。第三节第三节 分析后质量控制分析后质量控制一、检验结果的审核和发放二、检验后标本的保存与处理三、咨询服务一、检验结果的审核和发放一、检验结果的审核和发放报告的审核和发放制度：实验室应制定报告审核和发放制度，审核应由相应资格的工作人员进行：信息的规范性和完整性（检测项目是否完整、结果格式是否正确
26、、报告内容是否正确、检测过程中室内质控是否在控等）报告的审核和发放制度报告的审核和发放制度根据提供的临床诊断信息，评估检测结果与患者病情的符合性遇到怀疑或明显不符合的情况，应对本次结果进行复核，或通过及时与临床医护、患者沟通获得更多相关信息二、检验后标本的保存与处理二、检验后标本的保存与处理检验后标本的保存：检验后标本的保存：为了必要的复查，依据检测的需求，对检测后的标本按规定的保存时间和方法进行保存（如HBV、HCV、TP、HIV等原始标本管4 冰箱保存3月后送微生物室高压灭菌后统一销毁处理，并做好相关记录）对于一些需长期保存的标本，应对分析物稳定性的影响进行确认，必要时分离血清，血浆、细胞
27、成分进行保存二、检验后标本的保存与处理二、检验后标本的保存与处理检验后标本的处理：检验后标本的处理：检验后标本的处理应根据有关法律法规对二级生物实验室的要求，按照潜在生物危害处理方式进行处理三、咨询服务三、咨询服务咨询服务的提供：咨询服务的提供：实验室应主动为患者和临床医护提供检验结果的解释和咨询服务，以便使检验结果在诊断、治疗中发挥更大作用。对检测系统、疾病的自然发展过程、标本的质量等因素造成检测结果的影响做出解释。对于参考范围、临界值、医学决定水平不同而对检测结果的影响做出解释三、咨询服务三、咨询服务与临床的沟通：与临床的沟通：建立沟通机制，了解临床需求、投诉及意见反馈对本室的工作方式、流程及服务质量进行评估，通过不断的持续改进，提高检测和服务质量推广检验新项目和新方法
