1、宏基因组功能基因的筛选宏基因组功能基因的筛选WCX2019年年3月月17日日目目 录录v宏基因组简介宏基因组简介v宏基因组的常用研究方法宏基因组的常用研究方法 16S(18S)rDNA测序测序 宏基因组文库宏基因组文库 功能基因筛选（策略一）功能基因筛选（策略一）v宏基因组的测序宏基因组的测序 功能基因筛选（策略二）功能基因筛选（策略二）宏基因组（宏基因组（Metagenome）Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于及其研究组于2019年提出，定义为年提出，定义为“the Genomes of the Total M
2、icrobiota Found in Nature”，即指即指任何特定环境样品中全部微生物任何特定环境样品中全部微生物遗传物质的总和遗传物质的总和,并且目前主要是指环境样品中细并且目前主要是指环境样品中细菌和真菌基因组的总和。菌和真菌基因组的总和。Metagenome VS Genome目目 录录v宏基因组简介宏基因组简介v宏基因组的常用研究方法宏基因组的常用研究方法 16S(18S)rDNA测序测序 宏基因组文库宏基因组文库 功能基因筛选（策略一）功能基因筛选（策略一）v宏基因组的测序宏基因组的测序 功能基因筛选（策略二）功能基因筛选（策略二）Metagenomics involves co
3、nstructing DNA libraries from environmental DNAConstruct 16S(18S)rRNA gene library using PCRsequenceEnvironmental sampleClone into vectoreg plasmid,cosmid phosmid,BACIntroduce into host eg E.coliE x t r a c t m e t a g e n o m i c DNAMetagenomic libraryScreen for specific sequences by PCR or hybridi
4、sationSIGEX16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对分子的对应的应的DNA序列，也就是序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为的编码基因。其长度大约为1500 bp通过通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细菌的分类和进化分析。菌的分类和进化分析。细菌细菌16S rRNA的测序分析的测序分析uAshelford 等（等（2019）通过对）通过对4383个细菌个细菌16S rDNA的序列的序列进行比对分析，表明进行比对分析，表明16S rDNA 全长序
5、列中包含全长序列中包含9个可变区个可变区（V1-V9）和）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区则表明物种间的差异。缘关系，可变区则表明物种间的差异。uChakravorty 等（等（2019）总结）总结16S rDNA 的序列，及其中的序列，及其中九个九个9个可变区和个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的个保守区的位置和长度，并指出不同的可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约（约60 bp）和）和V6区（约区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。）可以分别用来鉴定大多数细菌。细菌细
6、菌16S rRNA的的V3或或V6区的测序分析区的测序分析16S rDNA 通过设计特异的通过设计特异的PCR引物，扩增得到引物，扩增得到V3或或V6区的序列，然区的序列，然后两端加上接头，便可利用后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对的高通量测序技术对V3或或V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。真菌真菌ITS的高通量测序分析的高通量测序分析ITS(Internal Transcribed Spacers)，即
7、核糖体内转录间隔区，即核糖体内转录间隔区，是位于是位于 28S rDNA的的3端与端与 18S rDNA的的 5端之间的序列端之间的序列ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bpITS包含包含ITS1和和ITS2两个区域。其中两个区域。其中ITS1 位于位于 18S rDNA和和 5.8S rDNA之间，之间，ITS2位于位于 5.8S rDNA和和 28S rDNA之间之间 ITS 1 和和ITS 2 是中度保守区域是中度保守区域,其保守性基本上表现为种内相对一致其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。种间差异比较明显。IT S
8、 的序列分析能实质性地反映出属间、的序列分析能实质性地反映出属间、种间种间以及菌株间的碱基对差异以及菌株间的碱基对差异,此外此外ITS 序列片段较小、序列片段较小、易于分析易于分析,目前已目前已被广泛应用于这种特点使被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。通过设计特异的通过设计特异的PCR引物，扩增得到引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利序列，然后两端加上接头，便可利用用Illumilla的高通量测序技术对的高通量测序技术对IT
9、S进行测序分析，以获得环境样品中真菌进行测序分析，以获得环境样品中真菌等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。宏基因组文宏基因组文库库Metagenomic Library通过通过PCR PCR 或者杂或者杂交筛选特定序列交筛选特定序列通过功能筛选特通过功能筛选特定表型的阳性克定表型的阳性克隆隆环境样品环境样品抽提抽提DNA 克隆克隆(多种载体多种载体)转化适宜宿主细菌转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌如大肠杆菌)宏基因组文库的构建宏基因组文库的构建 宏基因组文库的分析宏基因组文库的分析SIGEXSIGEX基于宏
10、基因组分离基于宏基因组分离筛选功能基因筛选功能基因的四的四个技术要素个技术要素载体载体 Vector宿主宿主Host自然产品筛选平台自然产品筛选平台Natural Product Discovery Platform环境样品环境样品DNA制备制备DNA Preparation高通量筛选高通量筛选High Throughput Screening 环境样品环境样品DNA制备制备 原位裂解法原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理,继而抽提纯继而抽提纯化。化。此法操作容易、成本低、此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小提取率高、偏差小,但由于强烈
11、的但由于强烈的机械剪切作用机械剪切作用,所提取的所提取的DNA片段较小片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也，且腐殖酸类物质也难以完全去除。难以完全去除。异位裂解法异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来,然后采然后采用较温和的方法抽提用较温和的方法抽提DNA,如先采用尼可登介质密度梯度离心分离如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微生物细胞微生物细胞,然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解,脉冲场凝胶电泳回收脉冲场凝胶电泳回收DNA。可获得大片段可获得大片段DNA(20500 kb)且纯度高且纯度高,但操作繁琐但操作繁琐
12、,成本高成本高,有些微生物在分离过程中可能丢失有些微生物在分离过程中可能丢失,温和条件下一些细胞壁较厚的微温和条件下一些细胞壁较厚的微生物生物DNA难以抽提出来。难以抽提出来。载体载体 一般选用质粒、粘粒或者一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 载体来构建文库，其插入片载体来构建文库，其插入片断小于断小于40kb,对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大，则无法完整克隆。，则无法完整克隆。细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）载体能克隆）载体能克隆100 kb以上的大插入片断以上的大插入片断，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目，完全
13、有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭 BAC 载体来构建载体来构建文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导增加载体拷贝数以获得大量增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。进行亚克隆和序列分析。宿宿 主主u已报道的宏基因文库构建绝大多数采用已报道的宏基因文库构建绝大多数采用cosmid、BAC或或fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基
14、因的宿主细菌杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的宿主细菌,因而构建广宿主或穿梭宏基因组文库在充分挖掘和筛选功因而构建广宿主或穿梭宏基因组文库在充分挖掘和筛选功能新基因的研究中尤为重要。能新基因的研究中尤为重要。序列驱动筛选序列驱动筛选 基于基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基因的保守序列或相似序列设计杂交探针或基因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过引物，通过杂交或杂交或PCR扩增筛选阳性克隆子。扩增筛选阳性克隆子。此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，
15、且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率，质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率，缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全新的活性物质及其功能编码基因。新的活性物质及其功能编码基因。功能驱动筛选功能驱动筛选 生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子，功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子，结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。如可
16、在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。uSIGEX（Substrate-induced gene-expression screening），即底物诱导基因筛选，其基本原理为：），即底物诱导基因筛选，其基本原理为：代谢相关基因通常由相
17、应的化合物（如底物或者代代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或者代谢）诱导表达。因此，通过建立特定的宏基因组文谢）诱导表达。因此，通过建立特定的宏基因组文库，利用流式细胞仪，筛选受一定底物诱导、与载库，利用流式细胞仪，筛选受一定底物诱导、与载体中的特定标签（如体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子，就能）共表达的克隆子，就能够筛选到相应的代谢基因。够筛选到相应的代谢基因。u 利用特殊载体，建立宏基因组文库，通过流式细利用特殊载体，建立宏基因组文库，通过流式细胞术，实现功能基因的高通量筛选胞术，实现功能基因的高通量筛选Uchiyama et al.,Nature,2009SIGEXSIGEX
18、载体特点一种操作子捕获一种操作子捕获(operon trap)载体载体多拷贝，稳定性好多拷贝，稳定性好含有一个标记基因（如含有一个标记基因（如gfp），能够与受底物诱导的操作子），能够与受底物诱导的操作子 基因片段共表达基因片段共表达标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体；标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体；标记基因前有标记基因前有RBS位点和起始密码子，避免形成融合蛋白位点和起始密码子，避免形成融合蛋白Uchiyama et al.,Nature,2009Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019SIGEX筛选流程筛选流程 u优
19、点优点能够筛选到新的代谢相关基因能够筛选到新的代谢相关基因诱导底物不需要经过特殊修饰诱导底物不需要经过特殊修饰避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能 结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选u缺点缺点不能筛选组成型表达的基因不能筛选组成型表达的基因仅针对能进入细胞质的底物仅针对能进入细胞质的底物仅适用于插入片段带有自身启动子的情况仅适用于插入片段带有自身启动子的情况出发菌株须与宿主菌株近缘出发菌株须与宿主菌株近缘T载体容量有限，载体容量有限，10kb的基因或操纵子难以克隆的基因或操纵子难以克隆与与GFP反向插入的
20、目的基因将漏检反向插入的目的基因将漏检目的基因与目的基因与GFP之间有转录终止子的情况将漏检之间有转录终止子的情况将漏检Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019SIGEX的优点和缺点的优点和缺点三种筛选方法的比较三种筛选方法的比较目目 录录v宏基因组简介宏基因组简介v宏基因组的常用研究方法宏基因组的常用研究方法 16S(18S)rDNA测序测序 宏基因组文库宏基因组文库 功能基因筛选（策略一）功能基因筛选（策略一）v宏基因组的测序宏基因组的测序 功能基因筛选（策略二）功能基因筛选（策略二）宏基因组测序宏基因组测序宏基因组宏基因组DNA提取提取Illum
21、ina 高通量测序高通量测序组学系统分析组学系统分析高通量基因克隆高通量基因克隆利用测序结果，经序列比对分析，利用测序结果，经序列比对分析，PCR直接扩增、克隆相关功能基因直接扩增、克隆相关功能基因高通量克隆高通量克隆ORF The Gateway systemuGateway技术原理技术原理 Gateway克隆技术是利用克隆技术是利用噬菌体与大肠杆菌的染噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的色体之间发生的嗜菌体位点特异重组系统的重组整合嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（与切出反应（attB x attP attL x attR）BP和和LR两个两个反应构成的。反应构成的。BP反应利用一
22、个反应利用一个attB DNA片段或表达克片段或表达克隆和一个隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个供体载体之间的重组反应，创建一个入门入门克隆克隆。LR反应是一个反应是一个attL入门克隆和一个入门克隆和一个attR目的载目的载体之间的重组反应。体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个移目的序列到一个或更多个目的载体目的载体。Matsuyama and Yoshida，2009BP和和BL反应反应u不需要传统的酶切、连接方法不需要传统的酶切、连接方法u利用位点特异性重组，省时省力利用位点特异性重组，省时省力,可以实现高通量克
23、隆可以实现高通量克隆u利用了利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆选择方法，以确保高效率的分离重组克隆,典型的效率是典型的效率是95%u在目的基因（或者开放阅读框在目的基因（或者开放阅读框(ORF)克隆进克隆进Gateway 入入 门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆创建各种各种各样的表达克隆 Gateway 技术优点技术优点 The Gateway system 克隆克隆ORFeome利用利用The Gateway system 的高通量、快捷、方便等特点，可以克隆的高通量、快捷、方便等特点，可以克隆得到生物体的得到生物体的ORFeome，即全部编码蛋白质的，即全部编码蛋白质的ORF组成组成Brandner et al.,BMC Genomics,2019u得到生物体的得到生物体的ORFeome后，通过高通量诱导后，通过高通量诱导ORF 表达，利用表达，利用“功能驱动筛选功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因，筛选得到相应的功能基因ORFeome的用途的用途高通量检测、筛选高通量检测、筛选功能基因、新型酶功能基因、新型酶
