1、核酸和蛋白质的生物合成 医学知识。生物的各项生命活动都生物的各项生命活动都有它的物质基础。生物有它的物质基础。生物遗传的物质基础是什么遗传的物质基础是什么呢？呢？2核酸和蛋白质的生物合成 医学知识l DNADNA是生物遗传的主要物质。生是生物遗传的主要物质。生物机体的遗传信息以密码的形式编物机体的遗传信息以密码的形式编码再码再DNADNA分子上，表现为特定的核分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。并通过苷酸排列顺序。并通过DNADNA的复制的复制由亲代传递给子代。在后代的生长由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，发育过程中，遗传信息自遗传信息自DNADNA转录转录给给RNARNA，然后翻译成
2、特异的蛋白质，然后翻译成特异的蛋白质（中心法则）（中心法则）。以执行各种生命功。以执行各种生命功能，使后代表现相似的遗传性状。能，使后代表现相似的遗传性状。DNARNA蛋白质转录反转录翻译复制复制 (Crick,1958)(Crick,1958)3核酸和蛋白质的生物合成 医学知识Reverse transcription4核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 复制过程可分为：起始、延长和终止复制过程可分为：起始、延长和终止3 3个阶段。个阶段。通过碱基配对通过碱基配对(A-T,C-G),(A-T,C-G),两条链连在一起，成为两条链连在一起，成为互补链。一条链上核苷酸排列顺序决定了另一条链上互补链
3、。一条链上核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序，每一条链都含有合成它的互补链的核苷酸排列顺序，每一条链都含有合成它的互补链所必需的全部遗传信息。所必需的全部遗传信息。5核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 DNADNA复制过程中，首先碱复制过程中，首先碱基间氢键断裂并使双链解旋和基间氢键断裂并使双链解旋和分开，然后每条链可作为模板分开，然后每条链可作为模板在其上合成新的互补连，新形在其上合成新的互补连，新形成的两个成的两个DNADNA分子与原来分子与原来DNADNA分分子的碱基顺序完全一样。在此子的碱基顺序完全一样。在此过程中，每个子代分子的一条过程中，每个子代分子的一条链来自亲代链来自
4、亲代DNADNA，另一条链子，另一条链子是新合成的。这种方式称为是新合成的。这种方式称为6核酸和蛋白质的生物合成 医学知识7核酸和蛋白质的生物合成 医学知识8核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 1958年，Messelson 和 Stahl用实验加以证实。细菌可利用NH4Cl作氮源合成DNA。普通DNA的沉降位置含含15N-DNA 的细菌的细菌第一代第一代第二代第二代重DNA的沉降位置细菌的DNA双链含含15N-DNA链链含含14N-DNA链链密度梯度离心结果普通DNA的沉降位置9核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 实验结果表明实验结果表明:子一代子一代DNADNA双链中有一股是双链中有一股是15
5、15N N单链，单链，而另一股是而另一股是1414N N单链，前者是从亲代接受和保留下来的，后单链，前者是从亲代接受和保留下来的，后者则是完全新合成的。者则是完全新合成的。半保留复制的意义：半保留复制的意义：按半保留复制的方式，按半保留复制的方式，子代保留了亲代的全部遗传子代保留了亲代的全部遗传信息，体现在亲代与子代之信息，体现在亲代与子代之间间DNADNA碱基序列的一致性上。碱基序列的一致性上。体现了遗传过程的相对保守体现了遗传过程的相对保守性（不是绝对的）。是物种性（不是绝对的）。是物种稳定的分子基础。稳定的分子基础。A TG CA TA TC GA TG CA TA TC GA TG C
6、A TA TC G亲亲链链子子链链子子链链亲亲链链10核酸和蛋白质的生物合成 医学知识J.CairnsJ.Cairns（19631963年）年）11核酸和蛋白质的生物合成 医学知识12核酸和蛋白质的生物合成 医学知识13核酸和蛋白质的生物合成 医学知识DNA新起始方式新起始方式（de novo initiationde novo initiation）复制的基本模式）复制的基本模式Parental D.S,DNAUnwinding proteinRNA polymerase Primase DNA polymerase leading Strand lagging StrandElongati
7、on of lag.&lea.strands DNA polymerase Poly(dNt)ligase Replication loop RNA primerRNA-primed DNA pieces(1kb)Continuous 5 to 3 in Leading S.Discontinuous 3 to 5 in lagging S.Two long DNA piecesMany shorter DNA pieces(1-2 kb)Repair&filling in 5 to 3Bidirectional lengthening of new stands眼形结构14核酸和蛋白质的生物
8、合成 医学知识15核酸和蛋白质的生物合成 医学知识拓扑拓扑物体或图像做弹性位移而又保持物体不变的性质。物体或图像做弹性位移而又保持物体不变的性质。核酸的拓扑结构核酸的拓扑结构核酸分子结构的空间关系核酸分子结构的空间关系。共同起解开、理顺共同起解开、理顺DNA链，维持链，维持DNA在一定时间内处于单链状态的作用。在一定时间内处于单链状态的作用。解螺旋酶（解螺旋酶（DNA helicase)解开双链。同样功能的还有解开双链。同样功能的还有Rep蛋白。蛋白。DNA拓扑异构酶（拓扑异构酶（Top I、Top II）改变）改变DNA分子拓分子拓 扑构象。扑构象。单链单链DNA结合酶结合酶（SSB)维持模
9、板的单链状态并保持单链的完整。维持模板的单链状态并保持单链的完整。解旋、解旋、解链酶解链酶Top ICut D.S.DNAATPLigateTop IITop I在在DNA的一股链上产生缺口，使另一条链得以穿越。的一股链上产生缺口，使另一条链得以穿越。Top II则在则在DNA的双链上产生缺口，使另一双链的双链上产生缺口，使另一双链DNA片段得以穿越。片段得以穿越。16核酸和蛋白质的生物合成 医学知识（Primase)(Primosome)引物酶引物酶(Dna G)(Dna G)：催化引物合成的一种：催化引物合成的一种RNARNA聚合酶。聚合酶。引物酶在模板的复制起始部位催化互补碱基的聚合，形
10、成短片断的引物酶在模板的复制起始部位催化互补碱基的聚合，形成短片断的RNARNA。引物。引物酶和解螺旋酶共同起作用。酶和解螺旋酶共同起作用。引发体：引发体：Dna A Dna A 蛋白、蛋白、Dna BDna B蛋白蛋白 、Dna G Dna G 蛋白、蛋白、Dna CDna C及其他复制因子，及其他复制因子，一起形成复合体，结合引物酶，形成较大的聚合体，再结合到模板一起形成复合体，结合引物酶，形成较大的聚合体，再结合到模板DNADNA上。上。引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。解螺旋辨认起点引物酶17核酸和蛋白质的生物合成 医学知识
11、Primosome（consists of six proteins）PriA(dual role)displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at prepriming stage DnaB is central component,action with DnaC DnaC is central component,action with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primase18核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 19核酸和蛋白质的生
12、物合成 医学知识l 反应需要接受模板的指导反应需要接受模板的指导l 引物：反应需要有引物引物：反应需要有引物33羟基存在。羟基存在。l 底物：底物：4 4种脱氧核糖核苷三磷酸（种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPdNTP）l 产物产物DNADNA的性质与模板相同。的性质与模板相同。l 复制在复制在5 5-3-3方向延伸方向延伸20核酸和蛋白质的生物合成 医学知识21核酸和蛋白质的生物合成 医学知识22核酸和蛋白质的生物合成 医学知识23核酸和蛋白质的生物合成 医学知识DNA聚合酶全酶亚基组成亚基亚基数亚基功能2聚合活性。催化从5 3方向合成DNA。235外切酶活性，校对功能 核心酶2组建核心酶2核心
13、酶二聚化2依赖DNA的ATP酶，形成复合物1可与亚基结合，形成复合物1形成复合物1形成复合物1形成复合物4两个亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。夹夹子子装装配配器器24核酸和蛋白质的生物合成 医学知识25核酸和蛋白质的生物合成 医学知识26核酸和蛋白质的生物合成 医学知识27核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 酶酶作作 用用DNADNA聚合酶聚合酶不能从无到有开始不能从无到有开始DNADNA合成，要有引物链。合成，要有引物链。5 5 33聚合酶及外切酶作用，聚合酶及外切酶作用，3 53 5外切酶酶作用，外切酶酶作用，可校正可校正/修复修复DNADNA链，还可切除引物。链，还可切除引物。D
14、NADNA聚合酶聚合酶5 35 3聚合酶及聚合酶及3 53 5外切酶酶作用，可校正外切酶酶作用，可校正/修复修复DNADNA链。链。DNADNA聚合酶聚合酶与酶与酶作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶（聚合酶 replicasereplicase）。）。DNADNA聚合酶聚合酶涉及涉及DNADNA的错误倾向修复。的错误倾向修复。DNADNA受到严重损伤时，受到严重损伤时，可诱导产生，使修复缺乏准确性。可诱导产生，使修复缺乏准确性。DNADNA聚合酶聚合酶同上。同上。28核酸和蛋白质的生物合成 医学知识29核酸和蛋白质的生物合成 医学知识30核酸和蛋白质的
15、生物合成 医学知识Nick：指断裂的磷酸二酯键。Gap：指缺失核苷酸31核酸和蛋白质的生物合成 医学知识Top I ,Top II Helicase(rep protein)Single Strand Binding protein(SSB)Helix destabilizing protein(HDP)DnaB priteinDnaC protein Primase Ung-ase DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligasefor primosome复复制制体体进化中形成了活的多酶复合体进化中形成了活的多酶复合体 replisomereplisome
16、32核酸和蛋白质的生物合成 医学知识包括包括三个阶段三个阶段。复制的起始阶段复制的起始阶段主主要是引发体的形成。要是引发体的形成。(1)Dna A(1)Dna A蛋白识别并结合于起始点蛋白识别并结合于起始点ori Cori C。(2)Dna(2)Dna、Pri APri A、引物酶等相继结合，组成复制引发体。、引物酶等相继结合，组成复制引发体。（3 3）拓扑异构酶）拓扑异构酶引入负超螺旋，促进引入负超螺旋，促进Dna ADna A的结合，同时的结合，同时消除扭曲张力。消除扭曲张力。（）聚合酶（）聚合酶结合到模板上，在引物的结合到模板上，在引物的后面合成新的链。后面合成新的链。解螺旋水解ATP推
17、动DNA解链合成引物33核酸和蛋白质的生物合成 医学知识半不连续复制半不连续复制：在复制：在复制叉上前导链连续合成子叉上前导链连续合成子代链，而滞后链不连续代链，而滞后链不连续合成子代链。合成子代链。前导链前导链以走向以走向3 3 5 5的亲代链为模板，连续合成子代链。的亲代链为模板，连续合成子代链。滞后链滞后链以走向以走向5 5 3 3的亲代链为模板，不连续合成子代链。的亲代链为模板，不连续合成子代链。冈崎片断冈崎片断滞后链侧的滞后链侧的较小的较小的DNADNA片断。片断。每一个复制叉上只有每一个复制叉上只有一个一个DNADNA聚合酶聚合酶全酶的全酶的二聚体。同时在前导链和二聚体。同时在前导
18、链和滞后链上完成复制任务。滞后链上完成复制任务。34核酸和蛋白质的生物合成 医学知识（滞后链）（前导链）单链DNA结合蛋白（DNA聚合酶）（DNA聚合酶）35核酸和蛋白质的生物合成 医学知识（DNA聚合酶）(DNA引物酶)（冈崎片断)（RNA引物）（解螺旋酶）（DNA聚合酶）（滞后模板）复复制制叉叉上上蛋蛋白白质质的的协协作作（前导模板）36核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 两个复制叉在两个复制叉在ori C 约约180度的对面相遇，在这度的对面相遇，在这一区域有几个终止子的位点，它们与一区域有几个终止子的位点，它们与tus基因基因产物即产物即Dna 解旋酶的抑制剂结合，从而阻止解旋酶的抑制剂
19、结合，从而阻止复制叉的前进。复制叉的前进。复制终止后，由复制终止后，由DNADNA聚合酶聚合酶填补空隙，最后填补空隙，最后由连接酶封口。由连接酶封口。37核酸和蛋白质的生物合成 医学知识DNADNA复制的要点是：复制的要点是：1 1）在复制开始阶段，）在复制开始阶段，DNADNA的双螺旋的双螺旋拆分成两条单链。拆分成两条单链。38核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 2 2）以）以DNADNA单链为模板，按照碱基互补配对的原单链为模板，按照碱基互补配对的原则则,在在DNADNA聚合酶催化下，合成与模板聚合酶催化下，合成与模板DNADNA完全完全互补的新链，并形成一个新的互补的新链，并形成一个新的D
20、NADNA分子。分子。NC H3HNOORN HNOORC H3N HNOORC H3NC H3HNOORO HN HNORC H3O HUVROOHNC H3NH2O39核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 3)3)通过通过DNADNA复制形复制形成的新成的新DNADNA分子分子,与原来的与原来的DNADNA分子分子完全相同。完全相同。经过经过一个一个 复制周期后复制周期后，子代，子代DNADNA分子的分子的两条链中，一条来两条链中，一条来自亲代自亲代DNADNA分子，分子，另一条是新合成的另一条是新合成的，所以又称为半保，所以又称为半保留复制。留复制。40核酸和蛋白质的生物合成 医学知识五、真
21、核生物五、真核生物DNADNA的复制合成的复制合成DNA聚合酶（）DNA聚合酶（）DNA聚合酶（M)DNA聚合酶（）DNA聚合酶（）亚基数41221分子量（KD)25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核引物合成酶活性35外切活性+功能引物合成修复线粒体DNA合成核DNA合成修复41核酸和蛋白质的生物合成 医学知识42核酸和蛋白质的生物合成 医学知识43核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 端粒端粒DNA(Telomer)(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3(rich G c
22、hain)3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain)1985.Carol Greider&Blackburn,1986.Gottchling Gottchling 尖毛虫尖毛虫 telomere binding proteintelomere binding protein 1 55kd telomere binding protein telomere binding protein 2 26 kd四膜虫四膜虫 telomerasetelomerase 将将T2G4 末端重复延伸末端重复延伸 游扑虫游扑虫 TelomeraseTelomerase=RNA
23、CAAAACCCC 链链+末端结合蛋白末端结合蛋白 （TBP）+100 bp telomere44核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 长 短细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值端粒长短端粒长短端粒酶活端粒酶活 Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测端粒的重复片段为探针检测 胎儿细胞株胎儿细胞株婴儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株青年细胞株老年细胞株老年细胞株年龄年龄小 大端粒长度端粒长度早老性侏儒症的端粒明显较正常人短早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老研究端粒（记时器）丢失的速率研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人
24、类的寿命年，预测人类的寿命 XX XY why?XX XY why?PCDPCD机制、癌细胞的无限繁殖机制、癌细胞的无限繁殖45核酸和蛋白质的生物合成 医学知识六、六、DNADNA的损伤及其修复的损伤及其修复46核酸和蛋白质的生物合成 医学知识47核酸和蛋白质的生物合成 医学知识光聚合反应光聚合反应 胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应：在在DNADNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复
25、制或转录。制或转录。48核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 当当DNADNA受到大剂量紫外线（波长受到大剂量紫外线（波长260nm260nm附近）照射时，附近）照射时，可引起可引起DNADNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如嘧啶二聚体（二聚体，例如嘧啶二聚体（TTTT二聚体）。二聚体）。NNN H2ORH O N ONNN2+ORH2ONNO HORH NNORO49核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 化学因素化学因素 化学因素是引起化学因素是引起DNADNA结构发生变化的最常见因结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱素，
26、主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。基类似物等。烷基化试剂能够与烷基化试剂能够与DNADNA分子中的氨基或氧作用分子中的氨基或氧作用，生成烷基化，生成烷基化DNADNA。除了碱基上有多个位置可。除了碱基上有多个位置可被烷基化外，被烷基化外，DNADNA链上磷酸二酯键中的氧也容链上磷酸二酯键中的氧也容易被烷基化，从而导致易被烷基化，从而导致DNADNA链的断裂。链的断裂。50核酸和蛋白质的生物合成 医学知识烷基化反应烷基化反应 由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转变为稳定的烯醇醚。变为
27、稳定的烯醇醚。鸟嘌呤核苷烷基化形成鸟嘌呤核苷烷基化形成6-6-甲氧基鸟嘌呤甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与核苷后，不再与C C配对，而与配对，而与T T配对。配对。这种情况将引起这种情况将引起DNADNA的复制、转录及信息的复制、转录及信息表达出现错误。表达出现错误。51核酸和蛋白质的生物合成 医学知识环外氨基的反应环外氨基的反应 环外氨基在适当条件下，也可以发生化学反应。环外氨基在适当条件下，也可以发生化学反应。胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变
28、改变DNADNA的碱基组成。的碱基组成。腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别形成次黄嘌呤核苷（形成次黄嘌呤核苷（I I）和黄嘌呤核苷（）和黄嘌呤核苷（X X）。）。这种变化，将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向这种变化，将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向，导致，导致DNADNA复制错误，是引起基因突变的重要原因之一复制错误，是引起基因突变的重要原因之一。52核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的合成或天然化合物，由于它们的
29、结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNADNA链中，干扰链中，干扰DNADNA的正常复制和转录。的正常复制和转录。常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物。例如。例如5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU5-BU），它与胸腺嘧啶碱），它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代基的结构相似，能取代T T与与A A配对。配对。又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物（2,3,7,8-2,3,7,8-四氯四氯-二苯二苯-二恶英，简称二恶英，简称TCDDTCDD），），是一种
30、具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入细胞并与细胞并与DNADNA结合，导致结合，导致DNADNA复制发生错误，从复制发生错误，从而可能诱发癌变。而可能诱发癌变。53核酸和蛋白质的生物合成 医学知识l碱基顺序颠倒，如碱基顺序颠倒，如TATA被颠倒成被颠倒成ATAT54核酸和蛋白质的生物合成 医学知识55核酸和蛋白质的生物合成 医学知识w胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNADNA的的碱基组成。碱基组成
31、。56核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 少了或多了一对或几对碱基，例如：少了或多了一对或几对碱基，例如：5 5 ATGG ATGG TATGC 3TATGC 3 变成变成 5 5 ATGGTATGC 3 ATGGTATGC 3 3 3 TACC TACC ATACG 5ATACG 5 3 3 TACCATACG 5 TACCATACG 557核酸和蛋白质的生物合成 医学知识遗传变异的化学本质遗传变异的化学本质 DNADNA结构的改变将导致相应蛋白质一级结结构的改变将导致相应蛋白质一级结构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生物特征或性状发生变异。物特征或性状发生变异
32、。所以，一切生物的变异和进化都可以认所以，一切生物的变异和进化都可以认为是由于为是由于DNADNA结构的改变而引起蛋白质组结构的改变而引起蛋白质组成和性质变化的结果。成和性质变化的结果。58核酸和蛋白质的生物合成 医学知识指针对已发生了的缺陷而实行的补救机指针对已发生了的缺陷而实行的补救机制，主要有光修复、切除修复、重组修复和制，主要有光修复、切除修复、重组修复和SOSSOS修复。修复。1、光修复、光修复（photoreactivation）可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧
33、啶二聚体。光修复酶59核酸和蛋白质的生物合成 医学知识60核酸和蛋白质的生物合成 医学知识2、切除修复（、切除修复（excision repair）是细胞内最重要的修复机制在一系列酶（DNA聚合酶、连接酶、解旋酶）的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。61核酸和蛋白质的生物合成 医学知识3、重组修复（、重组修复（recombination repair）62核酸和蛋白质的生物合成 医学知识4 4、SOSSOS修复修复63核酸和蛋白质的生物合成
34、 医学知识基因重组与基因重组与DNADNA克隆（基因工程）克隆（基因工程）能识别能识别DNADNA特定核苷酸序列的核酸内切酶特定核苷酸序列的核酸内切酶主要在微生物中。主要在微生物中。特异性，即识别特定核苷酸序列，特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。切割特定切点。产生黏性未端（碱基互补配对）。产生黏性未端（碱基互补配对）。大肠杆菌的一种限制酶能识别大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。64核酸和蛋白质的生物合成 医学知识v 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割
35、点上将特定的切割点上将DNA DNA 分子切断。目前已发现的限制酶分子切断。目前已发现的限制酶有有400400500500多种。多种。65核酸和蛋白质的生物合成 医学知识66核酸和蛋白质的生物合成 医学知识l DNADNA重组与克隆重组与克隆67核酸和蛋白质的生物合成 医学知识PCRPCR(polymerase Chain reaction)(polymerase Chain reaction)聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNADNA复制。靶复制。靶DNADNA分子变性后解链，两条单链分子变性后解链，两条单链DNA
36、DNA分别与两条引物互补分别与两条引物互补结合，在结合，在4 4种种dNTPdNTP存在和合适和条件下，由耐热的存在和合适和条件下，由耐热的Taq Taq DNADNA聚合酶催化引物由聚合酶催化引物由5 5 3 3 扩增延伸，形成两条新的扩增延伸，形成两条新的双链双链DNADNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板复性、延伸循环，模板DNADNA增加一倍。经过增加一倍。经过30305050个循环，个循环，可使原可使原DNADNA量增加量增加106106109109倍。倍。68核酸和蛋白质的生物合成 医学知识69核酸和蛋白质
37、的生物合成 医学知识 PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键，引物位置和产物长度 根据不同目的和要求确定，长度一般在200800bp之间 引物的长度 一般为1825bp 末端核苷酸 3端不得有任何修饰 GC含量和Tm值 一般在4060%之间，两条相差23 70核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 DNA DNA携带的遗传信息传递给携带的遗传信息传递给RNARNA分子的过程称分子的过程称转录转录（transcription）。在生物界，在生物界，RNARNA合成有两种方合成有两种方式：一是式：一是DNADNA指导的指导的RNARNA合成，此为合成，此为生物体内的主要合成方
38、式。另一种生物体内的主要合成方式。另一种是是RNARNA指导的指导的RNARNA合成，此种方式常合成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本见于病毒。转录产生的初级转录本是是RNARNA前体（前体（RNA precursorRNA precursor），需），需经加工过程（经加工过程（processingprocessing）方具有）方具有生物学活性。生物学活性。71核酸和蛋白质的生物合成 医学知识一、原核生物中的基因转录一、原核生物中的基因转录72核酸和蛋白质的生物合成 医学知识73核酸和蛋白质的生物合成 医学知识合成方向：合成方向：5 533从头合成。从头合成。连接方式：连接方式：3 3
39、,5,5磷酸二酯键。磷酸二酯键。5 5-末端的起始核苷酸常为末端的起始核苷酸常为GTPGTP或或ATPATP。合成过程合成过程:连续连续转录特点：转录特点：不对称转录不对称转录-DNA-DNA片段转录时，双链片段转录时，双链DNADNA中只有一条链作为转录中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。的模板，这种转录方式称作不对称转录。模板链模板链(template strand)(template strand)及及反义链反义链(antisense strand):(antisense strand):指导指导RNARNA合成的合成的DNADNA链为模板链，又称反义链。链为模板链，
40、又称反义链。编码链编码链(coding strand)(coding strand)及有义链及有义链(sense strand)(sense strand)：不作为转录的另一条不作为转录的另一条DNADNA链为编码链，又称有义链。链为编码链，又称有义链。由于基因分布于不同的由于基因分布于不同的DNADNA单链中，即某条单链中，即某条DNADNA单链对某个基因是模板链，单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。而对另一个基因则是编码链。原料：原料：四种三磷酸核苷四种三磷酸核苷NTP,DNANTP,DNA中的中的T T在在RNARNA合成中变为合成中变为U U。74核酸和蛋白质的生物合成
41、医学知识75核酸和蛋白质的生物合成 医学知识76核酸和蛋白质的生物合成 医学知识调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP复合物复合物mRNAmRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶77核酸和蛋白质的生物合成 医学知识终止位点终止位点起始位点起始位点78核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 大肠杆菌的大肠杆菌的RNARNA聚合酶聚合酶 全酶由全酶由5 5种亚基种亚基2 2 组成组成。因子与其它部分的结合因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与不是十分紧密，它易于与2 2分离。分离。没有没有亚基的酶亚基
42、的酶称为核心酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。只催化链的延长，对起始无作用。只有全酶能够找到转录的起始位点并起始。只有全酶能够找到转录的起始位点并起始。五种亚基的功能分别为：五种亚基的功能分别为：亚基：亚基：与启动子结合功能，决定转录的基因类型。与启动子结合功能，决定转录的基因类型。亚基：亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键，参与转含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键，参与转录的全过程。录的全过程。亚基：亚基：在全酶中存在，功能不清楚。在全酶中存在，功能不清楚。亚基：亚基：与与DNADNA模板结合功能。参与转录的全过程。模板结合功能。参与转录的全过程。亚基：亚基：识别
43、起始位点，转录延长时脱落。识别起始位点，转录延长时脱落。79核酸和蛋白质的生物合成 医学知识80核酸和蛋白质的生物合成 医学知识81核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 启动子是基因起始处的启动子是基因起始处的DNADNA序列。序列。识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：-35-35序列提供了序列提供了RNARNA聚合酶全酶识别的信号；聚合酶全酶识别的信号；-10-10序列是酶的紧密结合位点（富含序列是酶的紧密结合位点（富含ATAT碱基，利于碱基，利于双链打开）；第三部分是双链打开）；第三部分是RNARNA合成的起始点。合成的起始点。解
44、旋从解旋从RNARNA聚合酶结合的启动子部位开始，然后从起始位点的核苷酸处起始聚合酶结合的启动子部位开始，然后从起始位点的核苷酸处起始RNARNA链的合成。第一位点被定义为基因序列的链的合成。第一位点被定义为基因序列的+1+1位置。位置。53+1转录起始点转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5335序列序列 Sextama 框框 10序列序列Pribnow框框+1对解旋很重要最保守最保守82核酸和蛋白质的生物合成 医学知识加入的第一个核苷三磷酸常是加入的第一个核苷三磷酸常是GTPGTP或或ATPATP。所形成的启动。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物
45、，第一个子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，亚基就会被释放脱亚基就会被释放脱离核心酶。离核心酶。-35-10pppG 或 pppA5 55 53 33 3模板链模板链E 83核酸和蛋白质的生物合成 医学知识3.3.链的延伸链的延伸 以以NTPNTP为原料和能量为原料和能量,DNA,DNA模板链为模板，模板链为模板，靠核心靠核心酶的催化，酶的催化，核苷酸间通过核苷酸间通过3 3,5,5-磷酸二酯键成核糖磷酸二酯键成核糖核酸链核酸链(RNA)(RNA)。转录的第一个核苷酸总是。转录的第一个核苷酸总是pppGpppG或或
46、pppApppA。84核酸和蛋白质的生物合成 医学知识4.4.转录终止转录终止 转录终止在特殊的终止子序列。转录终止信号分两类：一类是不依赖因子(即蛋白)，另一类是依赖因子。不依赖于不依赖于因子的这一类因子的这一类，其DNA链的3 端附近有富含GC的回文区域和随后的一段富含AT的序列。当以这段终止信号为模板转录出的RNA即形成具有茎环的发夹形结构(hairpin structure)，其3 端含有一串UUUU的尾巴（图8.40），这种发夹结构阻碍了聚合酶的进一步延伸，RNA链的合成即终止。85核酸和蛋白质的生物合成 医学知识 另一类依赖因子的终止另一类依赖因子的终止，其DNA链的3端附近的回文
47、序列没有富含G-C碱基的区域，后面也没有连续的A存在，需因子的参与才能完成链的终止。因子是由基因编码的相对分子质量为55 000的蛋白质。现在一般认为因子是与正在合成的RNA链相结合，并利用水解ATP或其他核苷三磷酸释出的能量从5-3 端移动，当聚合酶遇到终止信号时，聚合酶移动速度减慢，因子就很快追赶上来，使转录终止，释放RNA，并使RNA聚合酶与因子一起从DNA上脱落下来。86核酸和蛋白质的生物合成 医学知识二、真核生物的转录作用二、真核生物的转录作用酶酶类类分分布布产产 物物活性活性分子量分子量(KDa)(KDa)反应条件反应条件核核仁仁rRNArRNA（5.8S5.8S、18S18S、2
48、8S 28S）50507070500500低离子强度要低离子强度要求求MgMg2+2+或或MnMn2+2+核核质质mRNAmRNA、snRNAsnRNA20204040700700高离子强度高离子强度核核质质tRNAtRNA、5SrRNA5SrRNA、snRNAsnRNA、7sRNA7sRNA1010700700高高MnMn2+2+浓度浓度1.1.真核真核RNARNA聚合酶聚合酶2.2.转录转录 真核真核RNARNA转录基本过程与原核类似，但其产生的转录基本过程与原核类似，但其产生的mRNAmRNA为为“单顺反子单顺反子”，只编码一条肽链。，只编码一条肽链。87核酸和蛋白质的生物合成 医学知识
49、 在细胞内，由在细胞内，由RNARNA聚合酶合成的原初转录物（聚合酶合成的原初转录物（primary primary transcripttranscript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5 5 和和3 3 末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的接和编辑等过程，才转变为成熟的RNARNA分子。此过程总称分子。此过程总称为为RNARNA的成熟的成熟或称为或称为RNARNA的转录后加工的转录后加工。原核生物的原核生物的mRNAmRNA转录后一般不需要加工，转录的同时转录
50、后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。即进行翻译（半寿期短）。rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工tRNA前体的加工前体的加工真核真核mRNA前体的加工前体的加工 88核酸和蛋白质的生物合成 医学知识rRNArRNA前体的加工前体的加工 r rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。加工过程：加工过程：1、剪切作用：需核酸酶参与。2、甲基化修饰：修饰在碱基上。3、自我剪接：一种核酶的作用。原核原核rRNArRNA加工：加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA 真核真核rRNArRNA加工：加工：1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，
