1、实验七实验七 猪伪狂犬病猪伪狂犬病PCRPCR诊断诊断猪伪狂犬病的PCR诊断1实验目的：1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤；2、掌握猪伪狂犬病毒PCR检测的方法；实验内容：1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤，2、猪伪狂犬病毒PCR检测。猪伪狂犬病的PCR诊断2什么是什么是PCR？聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外序列体外引物定向酶促扩增技术。引物定向酶促扩增技术。一、PCR反应的原理、方法及操作步骤猪伪狂犬病的PCR诊断3PCR原理原理 PCR P
2、CR是一种选择性扩增是一种选择性扩增DNADNA或或RNARNA的方法，其基本原理是依的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的据体内细胞分裂中的DNADNA半保留复制机理，以及在体外半保留复制机理，以及在体外DNADNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNADNA变成单链；变成单链；单链单链DNADNA与人工合成的引物退火，以及在与人工合成的引物退火，以及在dNTPdNTP存在下，耐存在下，耐高温的高温的DNADNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链聚合酶
3、使引物沿单链模板延伸成为双链DNADNA。高。高温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目的的DNADNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。猪伪狂犬病的PCR诊断4PCR原理原理 PCRPCR技术在模板技术在模板DNADNA、dNTPdNTP、Mg2+Mg2+、合适、合适BufferBuffer等条件下，用耐热的等条件下，用耐热的TaqTaq聚合酶代替聚合酶代替DNADNA聚合酶，用合成的聚合酶，用合成的DNADNA引物代替引物代替RNARNA引物，经过引物，经过DNADNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸变性、引物与模板结合（复性）和延伸3
4、3个个步骤的反复循环步骤的反复循环 （2525 3030次）过程，使目的次）过程，使目的DNADNA呈指数呈指数扩增扩增 。猪伪狂犬病的PCR诊断5反应程序反应程序 变性：变性：93-94 2min93-94 2min 变性：变性：93-94 30s93-94 30s 复性：复性：55-65 30s55-65 30s 延伸：延伸：72 30s72 30s 延伸：延伸：72 2min72 2min3535个循环个循环猪伪狂犬病的PCR诊断6PCRPCR原理原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extension猪伪狂犬病的PCR诊断7PCR
5、productPCR product猪伪狂犬病的PCR诊断8标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul猪伪狂犬病的PCR诊断9猪伪狂犬病的PCR诊断10酶及其浓度酶及其浓度 目前有两种目前有两种 Taq DNA Taq DNA 聚合酶供应聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠
6、菌合成 一个典型的一个典型的 PCR PCR反应约需酶量反应约需酶量 2.5U 2.5U（指总反应（指总反应体积为体积为100 ul100 ul时）时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少物量减少猪伪狂犬病的PCR诊断11引物引物 引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键特异性反应的关键 PCR PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的程度互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，就能按其设序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用计互补的寡核苷酸
7、链做引物，用 PCR PCR就可将模板就可将模板DNADNA在在体外大量扩增体外大量扩增猪伪狂犬病的PCR诊断12引物在线设计网址：引物在线设计网址：primer/primer3_猪伪狂犬病的PCR诊断13猪伪狂犬病的PCR诊断14猪伪狂犬病的PCR诊断15PCRPCR产物分析产物分析 凝胶电泳分析法凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（可用琼脂糖（AgroseAgrose）或聚丙烯酰胺（）或聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）凝胶电）凝胶电泳检测泳检测PCRPCR扩增产物的大小。扩增产物的大小。同时应以标准同时应以标准DNADNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。猪伪狂犬病的PCR诊断16二 猪伪狂犬病毒感染PCR检测-试剂盒猪伪狂犬病的PCR诊断17猪伪狂犬病的PCR诊断18使用方法使用方法猪伪狂犬病的PCR诊断19注意事项：猪伪狂犬病的PCR诊断20作业作业1、叙述PCR反应的原理、操作方法及注意事项。2、叙述猪伪狂犬病毒感染PCR检测的方法及结果判定。猪伪狂犬病的PCR诊断21
