1、 多肽类药物的研究进展与发展方向 LOGO 多肽是一类在氨基酸构成及其连接方式上与蛋白质相同,但在某些性质方面又有别于蛋白质的物质,如其空间结构较简单、稳定性较高、免疫原性较低或无免疫原性等。所有生物细胞都能合成多肽,同时,也受各种多肽的调节。多肽作为药物和健康产品开发较多,并且已经形成了一定的产业化规模。LOGO自1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽 催产素以后，20世纪50年代都集中于脑垂体所分泌的各种多肽激素的研究。60年代，研究的重点转移到控制脑垂体激素分泌的各种多肽激素的研究。70年代，神经肽的研究进入高潮。生物胚层的发育渊源关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推动了
2、肠胃激素研究的进展。LOGO1 多肽药物的主要功能及重要性肽具有极强的活性和多样性。肽在生物体内作为神经递质，传递信息。肽在生物体内作为载体和运输工具，将人们平常所食的营养物质输送到人体各个部位，充分发挥营养物质功能。肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，而且具有特殊的生物学功能，可防治血栓、高血脂、高血压，延缓衰老，抗疲劳，提高机体免疫力，促进人体对蛋白质、维生素、氨基酸等营养物质和钙、铁、锌、镁、铜等多种有益的微量元素的吸收。LOGO2 多肽类药物的分类按来源分生化药物 来源于动植物有机体基因工程药物 来源于基因工程菌表达生产的药物习惯分法多肽生化药物、细胞生长因子、抗体药物、抗菌肽、酶
3、类药物LOGO 2.1 生化类药物多肽类激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘脑多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶，辅酶Q10等。LOGO多肽类激素是机体的特定腺体合成并释放的一种物质，通过与远程敏感细胞内或细胞表面的受体相互作用而使靶细胞发生变化。主要包括垂体多肽激素、下丘脑多肽激素、甲状腺多肽激素、胰岛多肽激素、肠胃道多肽激素和胸腺多肽激素等。LOGO多肽类生化药物功能特性r调节各种各样的生理活动和生化反应；r生物活性高；r分子小，结构易于改造；r许多活性多肽都是由无活性的蛋白质前体经酶加工剪r切转化而来LOGO 2.2 基因工程药物激素类及神经
4、递质类药物：人生长激素释放抑制因子，人胰岛素，人生长激素细胞因子类药物：人干扰素，人白细胞介素，集落刺激因子，促红细胞生成素酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。LOGO2.2.1 细胞生长因子细胞因子是多种细胞所分泌的能调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合等小分子多肽的统称。大多数细胞因子作用于或产生于构成免疫与炎症系统的白细胞。白细胞包括所有的有核血细胞，是免疫细胞的基本构成。通过灭活或者破坏异源物质而发挥保护机体的功能。某些白细胞也具有识别和破坏自身变异细胞的能力。LOGO
5、作用特点p绝大多数细胞因子是低分子量（1530kDa）的蛋白或糖蛋白。p高效能作用：细胞因子可以自分泌、旁分泌、或内分泌的方式发挥作用。一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子。p多重调节作用（多效性/重叠性）：主要与调节机体的免疫应答、造血功能和炎症反应有关，还具有其他调节功能。与激素、神经肽、神经递质共同组成细胞间信号分子系统。LOGO2.2.2 抗体药物抗体是机体在抗原性物质的刺激下所产生的一种免疫球蛋白，能与细菌、病毒或毒素等异源性物质结合而发挥预防、治疗疾病作用。第一代抗体药物 动物多价抗血清第二代抗体药物 利用杂交瘤技术制备的单克隆 抗体及其衍生物
6、第三代抗体药物 基因工程抗体LOGO 基因工程抗体特点y可降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；y分子量较小，可部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶核心部位；y可制备新型抗体；y可采用多种表达形式，大量表达抗体分子，从而降低生产成本。LOGO2.3 多肽抗生素多肽抗生素是指分子量在10kDa以下，具有某种抗菌活性的多肽类物质。特点：以物理的方式作用于细菌细胞膜，使细胞膜穿孔，细胞质外溢而达到杀菌的目的。膜通道的形成能力对抗菌肽的活性起决定性作用。只对原核生物细胞产生特异性的溶菌活性，对最低等的真核生物及某些植物的原生质体、某些肿瘤细胞等也有一定的杀伤力，而对人体正常的细胞无损伤作用。
7、LOGO 3 多肽药物的合成方法多肽的合成主要有两条途径:化学合成和生物合成。化学合成主要通过氨基酸缩合反应来实现。多肽的化学合成有固相合成和液相合成之分,其主要的区别在于是否使用固相载体。LOGO多肽液相合成主要有逐步合成和片段组合两种策略,逐步合成简洁迅速,被用于各种生物活性多肽片段的合成;片段组合法为合成含100个以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路线,并已成功地合成了多种有生物活性的多肽,其最大的特点是易于纯制。在生物合成多肽方面,除了常用的发酵法、酶解法外,随着生物工程技术的发展,DNA 重组技术也被应用于合成多肽。LOGO 3.1 氨基酸的羧内酸酐法氨基酸的羧内酸酐是氨基酸的一种衍生
8、物,它的氨基保护基也活化羧基。NCA法属于阴离子开环聚合机理,其引发剂可选用多种亲核试剂或碱类。采用NCA法合成多肽的基本反应包括:在碱性条件下,氨基酸阴离子进攻NCA形成较为稳定的氨基甲酸根离子,在酸化时该离子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又进攻其它的NCA,如此反复进行下去。NCA法具有合成周期短、操作简单、成本较低、产物分子量高等优点,在目前多肽合成中所占比例较大,技术也较为通用。但是,采用NCA逐步法只能合成短链多肽片段。LOGO 3.2 液相分段合成法液相分段合成法是多肽片段在溶液中依据其化学专一性或化学选择性,自发连接成长肽的合成方法,其优点是能得到长肽,但技术还不完善。常用的连
9、接技术主要有:天然化学连接、化学区域选择连接、可去除辅助基连接、光敏感辅助基连接、施陶丁格连接和正交化学连接。LOGO 3.3 组合化学法组合化学法是20世纪80年代在固相多肽合成的基础上发展起来的。它将氨基酸的构建单元按某种组合方式连接起来,合成出包含大量化合物的化学库,并从中筛选出具有某种物理、化学或药理活性化合物的一套合成策略和筛选方案。与传统合成方法不同的是,传统合成方法一次只合成一种化合物,而组合化学法可同时合成多种化合物。LOGO 3.4 酶解法用酶解法合成多肽,又称酶法多肽,就是用生物酶降解蛋白质,将动植物大分子蛋白质降解成小分子活性多肽。酶解蛋白质所用的酶,大多数是肽酶类。近年
10、来，人们运用酸、碱降解蛋白质获得多肽收获甚微,固定投资大,周期长,污染严重,风险大,未能实现工业化生产。LOGO酶法多肽具有以下优点:酶解不降低蛋白质的营养价值,可获得比原食品蛋白质更多的功能;可保持多肽营养纯天然绿色属性,不含任何化学物质等。但酶解得到的是一系列多肽,分离纯化难度较大,因此不适于合成单一的多肽。另外,肽酶的催化具有专一性,因此,寻找合适的肽酶也是该方法的一个难点。LOGO 3.5 基因工程法DNA 重组技术的诞生为合成序列确定的多肽奠定了基础,即可通过设计合适的DNA 模板来控制多肽的序列。利用DNA 重组技术,可以通过重组 DNA 产生的工程菌来大量高效地合成多种生物活性多
11、肽。基因工程法合成多肽具有表达定向性强、产品安全卫生、原料来源广泛等优点,可以得到质量高疗效好且具有天然活性的多肽类药物,但存在高效表达等技术难题,分离困难,产率低,成本昂贵,难以用于大规模生产。LOGO 4 多肽药物研究的主要类型对于多肽药物的研究依据不同用途或靶向目标，可分为9大类，主要包括多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、其他药用小肽、诊断用多肽等。LOGO4.1多肽疫苗和核酸疫苗一样，多肽疫苗是目前疫苗研究领域内备受关注的研究方向之一。这里主要介绍合成多肽疫苗、多抗原肽疫苗、脂肽疫苗。LOGO合成多肽疫苗(synthet
12、ic peptide vaccine)就是用化学合成抗原表位氨基酸序列法制备而成的具有保护性作用的类似天然抗原决定簇的多肽疫苗。这种疫苗不含核酸，是最为理想的安全新型疫苗，也是目前研制预防和控制感染性疾病和恶性肿瘤的新型疫苗的主要方向之一。LOGO多抗原肽疫苗(multiple antigen peptide，MAP)是将病原微生物蛋白表面的多种T细胞或B细胞表位的氨基酸连接于树枝状的多聚赖氨酸骨架上而形成的一种具有独特三维空间结构的大分子疫苗。主要具有抗HIV-1、V3、抗裂体吸虫、脂多糖结合蛋白能模拟抗原位置等作用，在很大程度上促进了多抗原肽疫苗的发展。LOGO脂肽疫苗(lipopepti
13、de vaccines)是最近10多年来才开发出的一种多肽疫苗,它是将具有佐剂活性的脂质分子共价连接于抗原多肽链而制备成的。这种疫苗不需其它佐剂就能诱导机体产生广泛的免疫应答,而且没有佐剂的副作用,是一种很有应用前景的疫苗设计方法。例如,用脂肽 P3C核心作为内源性佐剂,将蛋白的T 细胞表位和 B 细胞表位与水溶性的脂肽P3C 通过肟键连接制成四分枝的聚肟疫苗(polyoxime vaccine),在没有任何外源性佐剂的情况下即具有良好的免疫原性。LOGO 4.2 抗肿瘤多肽肿瘤的发生是多种原因综合作用的结果，但最终都要涉及到癌基因的表达调控。不同的肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同。现在已发
14、现很多肿瘤相关基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点。小分子多肽不仅广泛存在于自然界，也可通过人工方法合成，在肿瘤的临床治疗上有重要的价值。美国科学家发现了一种含6个氨基酸的小肽能在体内显著抑制包括肺、胃及在大肠腺癌等腺癌的生长，为治疗这一死亡率很高的恶性肿瘤开辟了一条新的途径。LOGO 4.3 抗病毒多肽病毒感染后一般要经过吸附(宿主细胞)、穿入、脱壳、核酸复制、转录翻译、包装等多个阶段。阻止以上任意过程的进行均可防止病毒复制，而最有效的抗病毒药物是作用在病毒吸附及核酸复制2个阶段，因此筛选抗病毒药物主要考察药物的抗病毒吸附和复制能力。病毒通过与宿主
15、细胞上的特异受体结合吸附细胞，依赖其自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸复制。因此可从肽库内筛选与宿主细胞受体结合的多肽或能与病毒蛋白酶等活性位点结合的多肽，用于抗病毒的治疗。LOGO 4.4 多肽导向药物传统的抗癌药物在肿瘤治疗过程中通过血液循环，化学药物在体内扩散后分布于身体各个脏器，并且药物的选择性差，在杀死病变细胞同时也攻击正常细胞，产生很大的毒副作用。很多毒素(如绿脓杆菌外毒素)、细胞因子(如白细胞介素系列)等均有较强的肿瘤细胞毒性，如果长期或大量使用时，它亦可以损伤正常细胞，给机体带来了很大的副作用，影响对肿瘤的治疗效果。针对上述缺点，科学家开展了靶向药物的研究。利用特异性作用于肿瘤
16、组织或器官的结合分子能解决这个问题，从而改善抗癌药物的传递系统，提高药物导向的特异性，实现治疗的针对性和安全性。LOGO 4.5 细胞因子模拟肽细胞因子是由免疫系统细胞以及其他类型细胞主动分泌的一类小分子量的可溶性蛋白质，包括淋巴因子、干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、趋势化因子和集落刺激因子等。它是免疫系统细胞间以及免疫系统细胞与其他类型细胞间联络的核心，能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质，通过与细胞特异的膜受体而起作用。利用已知细胞因子的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽，成为近年来国内外研究的热点。现已经筛选出的肽类小分子模拟物主要包括竞争性结合受体和非竞争性结合受体2种类型的模拟肽。国外
17、已筛选到人促红细胞生成素、人促血小板生成素、人生长激素等多种生长因子的模拟肽。LOGO 4.6 抗菌性活性肽昆虫在受到微生物或其他外源物质的浸染时，血淋巴会产生相当数量的抗菌蛋白或抗菌肽，这些肽类物质主要是由脂肪体合成后分泌到血淋巴中，是一种十分有效的防御机制，可用来迅速杀死或清除外源的微生物。很多抗菌肽不仅有很强的抗菌、杀菌能力,而且还能杀死肿瘤细胞。LOGO 4.7 用于心血管疾病的多肽很多植物中药有降血压、降血脂、溶血栓等作用，不仅可用作药物，亦可用作保健食品。但由于其作用成分不能确定，其应用受到很大限制。据文献报道多肽在心血管牛理和病理活动的调常和信号传导中发挥着不可替代的作用，是一种
18、诊断、预防和治疗心血管疾病的有效方法。现已发现很多有效成分是小分子多肽，比如我国科学家从大豆内加工分离出的活性多肽，可通过小肠直接吸收，能防治血栓、高血压和高血脂，还能延缓变老，提高肌体免疫力。从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管疾病的小肽。LOGO 4.8 其他药用小肽许多生理必需的调节因子都是很小的肽类，生物技术的发展也促进了大量小分子肽药物的出现，使得小分子肽药物变得越来越重要。除上述几大方面已取得较大进展外，在其他很多领域也取得一些进展。如某种合成肽能促进伤口血管的再生，加速皮肤深度伤口的愈合。另外2种合成肽能抑制破骨细胞对骨质的重吸收。LOGO 4.9 诊断用多肽多肽最
19、主要的用途是用作抗原检测病毒、细胞、支原体、螺旋体等微生物和囊虫、锥虫等寄生虫的抗体，多肽抗原比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，且易于制备，因此装配的检测试剂，其检测抗体的假阴性率和本底反应都很低，易于临床应用。现在用多肽抗原装配的抗体检测包括：甲、乙、丙、庚肝病毒、艾滋病病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、梅毒螺旋体、囊虫、锥虫、莱姆病及类风湿等。使用的多肽抗原大部分是从相应致病体的天然蛋白内分析筛选获得，有些是从肽库内筛选的全新小肽。LOGO 5 多肽药物给药途径的研究多肽类药物相对于一般的西药来说稳定性较差,其稳定性易受温度、pH值等的影响,在体内易降解,半衰期短。这些特殊性使得该类药物
20、的主要临床应用剂型为注射剂,但是注射剂,尤其是对于胰岛素等需频繁给药的药物来说,不仅患者的依从性差,并且副作用也大。因此,相对于注射制剂,蛋白质多肽类药物的口服、经呼吸道以及经皮肤或黏膜给药制剂更具优越性。LOGO 5.1 口服给药途径胃肠道对多肽类药物的低吸收及其中的酶对药物的降解是口服给药面临的两个最大障碍。因此,寻找合适的吸收位点,避免胃肠道的酶降解作用以及肝脏的首过效应是解决问题的关键。除对药物的结构进行化学修饰,加入吸收促进剂、酶抑制剂等方法外,脂质体、微囊、微球、纳米粒、乳剂等微粒给药系统也可有效地促进药物经胃肠道吸收入血液循环,提高多肽类药物口服的生物利用度。LOGO 5.2 呼
21、吸道给药途径制备蛋白质多肽类药物鼻腔制剂的关键在于克服鼻腔纤毛的清除作用、鼻黏膜中3种氨肽酶(氨基肽酶N、氨基肽酶A、氨基肽酶B)对肽类药物的降解作用以及选择何种剂型以使药物在鼻腔内合理的分布。肺泡吸收面积很大,血液循环丰富,其上皮细胞的通透性很高,肽类水解酶的活性也很低,而且还能避免肝脏的首过效应,这些都有益于多肽类药物的吸收。目前粉雾剂是肺部给药的主要剂型。LOGO 5.3 经皮给药途径多肽类药物经皮给药必须克服皮肤角质层牢固的屏障作用,对药物成分进行处理、修饰或瞬间提高皮肤渗透性以及各种绕过或清除最外层皮肤的方法都可促进药物进入皮肤。目前应用较多的一种技术为离子导入技术。即借助电流控制离
22、子化药物释放速度和释放时间,并促进药物进入皮肤。电流电压、皮肤阻抗、离子强度等因素都可影响药物离子电导入，而将离子导入技术与电致孔、超声导入技术以及化学促渗剂相结合则能较好地解决以上问题。LOGO多肽类药物制剂研究面临的主要问题是多肽的稳定性不好,提高其稳定性的途径有以下几点：定点突变：通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基,可提高多肽稳定性。化学修饰：多肽的化学修饰方法很多,研究最多的是聚乙二醇(PEG)修饰。添加剂：通过加入添加剂,如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类,可提高多肽稳定性。冻干：多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、-消除、水解等都需要水参与,水还可作为其他反应剂的流动相。另外,降低水分含量可使多肽的变性温度升高,因此,冻干可提高多肽稳定性。
