1、培养基灭菌医学知识培养基灭菌医学知识l一、消毒与灭菌的区别：一、消毒与灭菌的区别：l所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢。生物的营养体和芽孢。l消毒是指消灭一切致病微生物（病原消毒是指消灭一切致病微生物（病原体）。体）。l二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用l牛奶巴氏消毒法：牛奶巴氏消毒法：80-9580-95，10min10minl发酵培养基的灭菌发酵培养基的灭菌:121,20min:121,20min培养基灭菌医学知识2l三、灭菌方法：三、灭菌方法：l1 1、干热灭菌：灼烧灭菌；加热方式有电、干热灭菌：灼烧灭菌；
2、加热方式有电热、红外线加热等；相对与湿热灭菌，热、红外线加热等；相对与湿热灭菌，干热要求时间长，温度高（一般干热要求时间长，温度高（一般160160，2hr2hr）l1）火焰焚烧法：接种环、试管口等）火焰焚烧法：接种环、试管口等l2）干烤法：利用热空气灭菌）干烤法：利用热空气灭菌l 用法：用法：160,2小时小时 l 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死。所以温度高、时脱水状态下不易杀死。所以温度高、时间长。间长。培养基灭菌医学知识3l2 2、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白质变性。质变性。l特点：温度
3、低、时间短、灭菌效果好特点：温度低、时间短、灭菌效果好l原因：原因：l 1)菌体内含水量越高，则凝固温度越低；菌体内含水量越高，则凝固温度越低；l 2)蒸汽冷凝会放出潜热；蒸汽冷凝会放出潜热；l 3)饱和水蒸汽穿透力强；饱和水蒸汽穿透力强；l 4)湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。性，主要破坏氢键结构。培养基灭菌医学知识4湿热灭菌优点：湿热灭菌优点：1 1）蒸气来源易，低价无）蒸气来源易，低价无毒；毒；2 2）蒸气穿透力强灭菌彻）蒸气穿透力强灭菌彻底；底；3 3）蒸气冷凝释放热量；）蒸气冷凝释放热量；4 4）蒸气易输送，易调节，）蒸气易
4、输送，易调节，易管理。易管理。湿热灭菌缺点：湿热灭菌缺点：1 1）设备费用高；）设备费用高；2 2）不能用于怕受潮的物）不能用于怕受潮的物料；料；培养基灭菌医学知识5l3 3、射线灭菌法：、射线灭菌法：l 1）电离辐射：）电离辐射：、射线射线。原理原理：引起水和其他物质的电离，产生：引起水和其他物质的电离，产生游离基，破坏游离基，破坏DNA，从而造成细胞损伤。，从而造成细胞损伤。l 特点；穿透力强，无专一性，对所有生特点；穿透力强，无专一性，对所有生物均有杀伤作用。物均有杀伤作用。l 适用：菌种诱变。适用：菌种诱变。培养基灭菌医学知识6l2）非电离辐射（紫外线）非电离辐射（紫外线）l方法：在波
5、长方法：在波长265-266nm处，杀菌力最强。处，杀菌力最强。l原理：原理：l（1）作用于）作用于DNA，使同链，使同链DNA相邻嘧啶间形相邻嘧啶间形成嘧啶二聚体，引起成嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光复活酶可修复）复活酶可修复）l（2）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。l适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。l特点：穿透力差。特点：穿透力差。培养基灭菌医学知识7l 采用介质过滤的方法阻截微生物达到除菌的目的l 主要用于空
6、气灭菌培养基灭菌医学知识8l方法：浸泡、熏蒸、喷洒、擦拭等，常用化学药品：方法：浸泡、熏蒸、喷洒、擦拭等，常用化学药品：l1 1）表面消毒剂：）表面消毒剂：l（1）酚类）酚类：l 石炭酸（苯酚），石炭酸（苯酚），0.1%抑菌；抑菌；1%杀菌杀菌l 甲酚皂（甲酚甲酚皂（甲酚+肥皂）：肥皂）：3-5%皮肤消毒皮肤消毒l 机理：作为表面活性剂，使膜损伤；蛋白质变性机理：作为表面活性剂，使膜损伤；蛋白质变性l P.C.（石炭酸系数）：为消毒剂杀菌效率的标准。（石炭酸系数）：为消毒剂杀菌效率的标准。l是在一定时间内（是在一定时间内（10min）被测试的药剂能杀死全部）被测试的药剂能杀死全部供试微生物的最
7、高稀释度与达到同样效果的酚最高稀供试微生物的最高稀释度与达到同样效果的酚最高稀释度的比值。释度的比值。培养基灭菌医学知识9l（2）醇类：）醇类：l乙醇：乙醇：70-75%杀菌效率最高杀菌效率最高l机理：具脱水作用，能穿透菌体进入蛋机理：具脱水作用，能穿透菌体进入蛋白质分子肽链间隙，使蛋白质变性或脱白质分子肽链间隙，使蛋白质变性或脱水沉淀，造成微生物死亡。水沉淀，造成微生物死亡。l无水乙醇：表面蛋白凝固，保护膜，杀无水乙醇：表面蛋白凝固，保护膜，杀菌力差菌力差l甲醇可使眼睛失明，故不宜做消毒剂；甲醇可使眼睛失明，故不宜做消毒剂；其他醇因不溶于水，一般不用。其他醇因不溶于水，一般不用。培养基灭菌医
8、学知识10l（3 3）醛类：）醛类：l甲醛：甲醛：机理：蛋白质烷化剂；机理：蛋白质烷化剂；应用：福尔马林（应用：福尔马林（40%40%）；）；10%10%的甲醛熏蒸，用于空气灭菌。的甲醛熏蒸，用于空气灭菌。l（4 4）表面活性剂：）表面活性剂：l 可降低表面张力效应的物质。可降低表面张力效应的物质。l机理：使菌体细胞膜破损；使菌体蛋白质变性。机理：使菌体细胞膜破损；使菌体蛋白质变性。l种类：洗必泰、新洁尔灭等种类：洗必泰、新洁尔灭等l特点：快速、彻底、效率高特点：快速、彻底、效率高培养基灭菌医学知识11l（5 5）氧化剂类：）氧化剂类：l机理：破坏蛋白质的巯基，强氧化剂可破坏蛋机理：破坏蛋白质
9、的巯基，强氧化剂可破坏蛋白质的氨基与酚羟基白质的氨基与酚羟基l碘酒碘酒 7g I 7g I：5g KI5g KI，溶于，溶于100ml 95%100ml 95%乙醇。乙醇。l 1%1%碘酒碘酒10min10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌，可杀死芽孢杆菌和部分真菌，l 并使流感病毒灭活。并使流感病毒灭活。l漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物）漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物）培养基灭菌医学知识12l（7 7）pH pH的杀菌作用的杀菌作用l酸酸:蛋白质变性蛋白质变性 l无机酸无机酸:杀菌力与杀菌力与H+H+浓度成正比。浓度成正比。l有机酸有机酸:与不电离的部分成正比与不电离的部分成正比,故有时有机
10、酸故有时有机酸的灭菌效果的灭菌效果 无机酸，分子杀菌力大于离子。无机酸，分子杀菌力大于离子。l碱碱:强碱造成蛋白质、核酸大分子变强碱造成蛋白质、核酸大分子变 性、水解，使菌死亡。性、水解，使菌死亡。培养基灭菌医学知识14l机理：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争机理：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争性拮抗作用（与相应酶竞争性结合）。只有当性拮抗作用（与相应酶竞争性结合）。只有当正常代谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才正常代谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才有用。有用。l种类：磺胺种类：磺胺抑制叶酸合成抑制叶酸合成l 6-巯基嘌呤巯基嘌呤抑制嘌呤合成抑制嘌呤合成l 5-甲基色氨酸甲基色氨酸抑制
11、氨基酸合成抑制氨基酸合成l机理：磺胺机理：磺胺对氨基苯甲酸的类似物，竞争对氨基苯甲酸的类似物，竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，抑制叶酸合成性地与二氢叶酸合成酶结合，抑制叶酸合成培养基灭菌医学知识15 （1）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物或其衍生物，在低浓度下抑制或影响其他生物或其衍生物，在低浓度下抑制或影响其他生物的生命活动。的生命活动。l（2）抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，）抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，将这一范围称该抗生素的抗菌谱。将这一范围称该抗生素的抗菌谱。l 广谱：对多种微生物有作用（四环素广谱：对多种微生物有作用（四环素G+，G-）
12、l 窄谱：仅对某一类微生物有作用（青霉素窄谱：仅对某一类微生物有作用（青霉素G+）l （3）效价：抑菌圈大小，生物活性单位，标）效价：抑菌圈大小，生物活性单位，标准曲线准曲线培养基灭菌医学知识16l抗生素作用机理：抗生素作用机理：l 1）对细胞壁形成有抑制作用；（如：青）对细胞壁形成有抑制作用；（如：青霉素）霉素）l 2）影响细胞膜功能；（如：多粘菌素）影响细胞膜功能；（如：多粘菌素）l 3）抑制蛋白质合成；（如：绿霉素、链）抑制蛋白质合成；（如：绿霉素、链霉素）霉素）l 4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、灰）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、灰黄霉素）黄霉素）l抗药性：变异、适应、进化抗药性：变
13、异、适应、进化l原因：药物无效；药物被修饰；原因：药物无效；药物被修饰；l R质粒（药物抗性基因）质粒（药物抗性基因）培养基灭菌医学知识17l1.1.微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。概念。l 相对热阻：两种微生物的热阻之比。相对热阻：两种微生物的热阻之比。l例如：芽孢例
14、如：芽孢/大肠杆菌大肠杆菌=3000000/1=3000000/1；（表；（表3-13-1）l 病毒病毒/大肠杆菌大肠杆菌=15/1=15/1l致死温度：杀死微生物的极限温度；致死温度：杀死微生物的极限温度；l致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物的时间；致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物的时间；l 温度越高，致死时间越短。温度越高，致死时间越短。培养基灭菌医学知识182.2.微生物的热致死动力学：对数残留定律。微生物的热致死动力学：对数残留定律。菌体是一个复杂的高分子体系，其受热被杀菌体是一个复杂的高分子体系，其受热被杀死，主要的原因是高温能使蛋白质变性，这种反死，主要的原因是高温能使蛋
15、白质变性，这种反应属于单分子反应（一级反应），因此，杂菌在应属于单分子反应（一级反应），因此，杂菌在一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程加以描述。加以描述。-dN/dt=k-dN/dt=k*N N式中式中dN/dtdN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率 N N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数 K K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数培养基灭菌医学知识19l上式的积分形式为：上式的积分形式为：l t=（2.303/k）lnN0/Nt l式
16、中式中N0，Nt：分别表示灭菌前、灭菌后培分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个养基中菌体的浓度（个/ml）l灭菌时间灭菌时间 t 取决于污染程度取决于污染程度N0、灭菌程度、灭菌程度 Nt 与与灭菌速度常数灭菌速度常数Kl灭菌程度：对于灭菌程度：对于 Nt，如果取，如果取Nt=0，那么，那么，t=，这显然是与现实情况不符。，这显然是与现实情况不符。l 对于如何对于如何Nt取值？通常取取值？通常取Nt=10-3，即灭菌，即灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产
17、过程中的技术管理水平。过程中的技术管理水平。培养基灭菌医学知识20l3.3.热致死反应的速度常数热致死反应的速度常数K Kl K K是表达微生物耐热性的特征常数，是表达微生物耐热性的特征常数，K K除了决定于菌体的种类及存在形式外，除了决定于菌体的种类及存在形式外，还是温度的函数（与普通化学反应一还是温度的函数（与普通化学反应一样），因此灭菌温度的选择是灭菌操作样），因此灭菌温度的选择是灭菌操作的核心。的核心。lK K越小，该微生物越耐热，越小，该微生物越耐热，121121细菌芽细菌芽孢孢K K为为1min1min-1-1,而营养细胞为而营养细胞为10-1010-101010minmin-1-
18、1l4 4、杀灭芽孢的温度和时间、杀灭芽孢的温度和时间l不同芽孢耐热性不同不同芽孢耐热性不同,培养条件不同培养条件不同,耐耐热性也不同。热性也不同。培养基灭菌医学知识21l5.5.灭菌温度的选择灭菌温度的选择l温度对化学反应的影响特别显著，主要温度对化学反应的影响特别显著，主要是影响速度常数。是影响速度常数。l灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：l1 1）微生物的热致死温度，应高于该温度，）微生物的热致死温度，应高于该温度，通常以芽孢为准。通常以芽孢为准。l2 2）高温对营养成分的破坏，灭菌的过程）高温对营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，因
19、此，实质上也是营养成分破环的过程，因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。分的破坏。培养基灭菌医学知识22l速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公式）：式）：K=Ae-E/RT l式中式中K：速度常数，：速度常数，1/Sl E,：活化能（：活化能（J/mol）l R：气体常数，：气体常数，1.987*4.18 J/mol*kl T：反应的绝对温度，：反应的绝对温度，kl上式也可表示为：上式也可表示为：llgK=-E/2.303RT+lgAl 对于
20、某种特定的细菌，活化能对于某种特定的细菌，活化能E E也是一定也是一定的，因此，灭菌速度常数的对数的，因此，灭菌速度常数的对数lgKlgK与灭菌温与灭菌温度度T T成反比。成反比。培养基灭菌医学知识23l温度温度:致死温度，蛋白质变性致死温度，蛋白质变性l灭菌时间：灭菌需维持一段时间才能达到效果灭菌时间：灭菌需维持一段时间才能达到效果l培养基成分：保护作用；培养基成分：保护作用；lpHpH值：值：pH pH值值6-86-8，微生物最耐热，表，微生物最耐热，表3-43-4；l培养基中的颗粒：颗粒大，灭菌难；培养基中的颗粒：颗粒大，灭菌难；l泡沫：不利于灭菌。泡沫：不利于灭菌。l水分含量：水少水分
21、含量：水少-温高时长温高时长l微生物数量的影响：数量多，灭菌时间长微生物数量的影响：数量多，灭菌时间长培养基灭菌医学知识24l分批灭菌：分批灭菌操作要点分批灭菌：分批灭菌操作要点l(1)(1)定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。冷却管道，夹套。l(2)(2)培养基升温时，打开所有的排气阀门，培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气。排掉空气。l(3)(3)培养基升温时开动搅拌系统，以使培养培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到基内部传热均匀，当温度升温到100100时，时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方停止搅
22、拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到面，当培养基的温度升温到100100时，培养时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。基的沸腾，可以起到搅拌作用。培养基灭菌医学知识25l(4)(4)注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。l保温期间温度：保温期间温度：118121118121，时间：，时间：3030分钟。分钟。l(5)(5)灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的证罐内压力后方可冷却，目的是防止
23、培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。冷却使罐内形成负压，易染菌。l分批灭菌时间的计算：例分批灭菌时间的计算：例3-13-1l连续灭菌时间计算：连续灭菌时间计算：t=（2.303/k）lnN0/Nt 式中式中N0、Nt分别为单位体积培养基灭菌前后菌数分别为单位体积培养基灭菌前后菌数培养基灭菌医学知识26l 连续灭菌又称为连消，即在一套专门灭菌设备中，培养基连续进料、瞬时升温、短时保温、尽快降温的过程。培养基灭菌医学知识27l连续灭菌的优点：连续灭菌的优点：l1 1、可采用高温短时，培养基破坏少；、可采用高温短时，培养基破坏少；l2 2、发酵罐利用率高；、发酵罐利用率高；l3 3、蒸汽负荷均衡；、蒸汽负荷均衡；l4 4、可节约能源；、可节约能源；l5 5、劳动强度小。、劳动强度小。培养基灭菌医学知识28l1 1、分批灭菌：、分批灭菌：121121，30min30min，适用于一，适用于一般培养基、消泡剂等；般培养基、消泡剂等；l2 2、连续灭菌：、连续灭菌：130 130，5min5min，也有，也有115 115，6-8min6-8minl3 3、其他：如尿素溶液、其他：如尿素溶液105 105，5min5min培养基灭菌医学知识29l1.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。培养基灭菌医学知识30
