1、基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识基因结构与表达异常与疾病基因结构与表达异常与疾病n人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等的发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。人体内蛋白质蛋白质分子结构和功能的异常是疾病的发生和发展的主要原因。2基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识基因结构与表达异常与疾病基因结构与表达异常与疾病n细胞微环境的变化，包括基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常特定基因表达的异常都和疾病发生有关。越来越多的证据显示基因表达的异常将导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤形成。3基因与疾病主题医学知识基因与疾病
2、主题医学知识4基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 现在已知道的遗传性疾病约有6000种，其中单基因缺陷疾病占30%，多基因缺陷疾病占70%。多基因缺陷疾病包括恶性肿瘤、心脑血管疾病、内分泌疾病、自身免疫系统疾病等。如我国高血压患者占人口11%，约30%有家庭遗传背景，其中4种为单基因突变，多数为多基因疾病，与30多个基因有关。老年性痴呆、耳聋、精神病也都与基因缺陷有关。经过对数千名孪生者研究证明：武断个性60%源于遗传背景，幸福愉快感80%源于遗传背景，XXY男性有暴力倾向。分子遗传学家认为，这些研究进展揭示：人群的致病危险大小、人群的个性特征与行为举止与人的基因有一定的关系。5基因
3、与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识一、基因病的概念一、基因病的概念以基因为基础，从疾病和健康的角度考以基因为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有故有“基因病基因病”概念产生。根据这一概念，概念产生。根据这一概念，人类疾病大致分为三类：人类疾病大致分为三类：（一）单基因病（一）单基因病 （二）多基因病（二）多基因病 （三）获得性基因病（三）获得性基因病 6基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识家族性结肠息肉家族性结肠息肉（familial polyposis coli,FPC)又称为家族性腺瘤样息肉病（又称为家
4、族性腺瘤样息肉病（familial adenomatous polyposis,FAP），是一种常染色体显性遗传病，由），是一种常染色体显性遗传病，由它恶变导致的癌症占所有结直肠癌的它恶变导致的癌症占所有结直肠癌的1%。该病在人。该病在人群中的发病率为群中的发病率为1/10000 1/8000。7基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 1991年研究人员从5q21克隆了家族性腺瘤样息肉病基因，即APC基因。该基因含有15个外显子，编码2843个氨基酸的蛋白质。APC基因具有肿瘤抑制基因的功能。8基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识良性)恶性TumorCarcinoma癌Sarco
5、ma 肉瘤Leukemia 白血病Cancer(癌症)9基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识增生增生 异常异常 Inherited susceptibility Chemical carcinogens Radiation Infectious agents DNA repair system General health(diet,stress,etc)Immune systemCancer Cell:Contributing FactorsCancer EtiologyMultiple CarcinogenCancer:Three Characteristics10基因与疾病主题医
6、学知识基因与疾病主题医学知识growthdifferentiationdeath?PoorFastDecreased cell death11基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识、multiple stagesTreatmentMultiple factors,Cancer 12基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识Characteristics of cancer13基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识一、一、基因结构与表达异常与疾病发生基因结构与表达异常与疾病发生 1 1基因结构改变基因结构改变 2细胞间信号异常细胞间信号异常3 细胞内因素细胞内因素14基因与疾病主题
7、医学知识基因与疾病主题医学知识 在自然界中有许多因素可以引起DNA结构的改变。虽然细胞内具有修复DNA损伤的功能，但并非所有的损伤都能被修复。一些未能修复的损伤有可能形成可遗传的突变。如果突变是发生在结构基因中，将使基因编码的蛋白质发生结构改变，失去原有的功能，导致分子病的发生。15基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识基因变异致病类型基因变异致病类型内源基因的变异内源基因的变异:基因结构突变基因结构突变:镰状红细胞贫血镰状红细胞贫血基因表达异常基因表达异常:肿瘤肿瘤外源基因的入侵外源基因的入侵:乙肝，乙肝，艾滋病等（病毒）艾滋病等（病毒）16基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识
8、 遗传物质的结构改变而引起的遗传遗传物质的结构改变而引起的遗传 信息改变，均可称为信息改变，均可称为突变突变（mutation）在复制过程中发生的在复制过程中发生的DNA突变称为突变称为DNA损伤损伤（DNA damage）从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分分子上碱基的改变。子上碱基的改变。17基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 是指体内代谢过程中产生的自由基或是指体内代谢过程中产生的自由基或某些环境因素引起的某些环境因素引起的DNA一级结构改变。一级结构改变。引起引起DNA一级结构改变的原因主要有两类：一级结构改变的原因主要有两类：自发突变自发突变 （spon
9、taneous mutation）诱发突变诱发突变 （induced mutagenesis）这种突变频率极低，约为这种突变频率极低，约为10-9，即每合成，即每合成109核苷核苷酸可能会有一次碱基与模板不相配的错误。酸可能会有一次碱基与模板不相配的错误。是指是指DNA复制时碱基的偶然性错配。复制时碱基的偶然性错配。18基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 1碱基和核苷酸类似物碱基和核苷酸类似物2烷化剂烷化剂3亚硝酸盐亚硝酸盐4电离辐射和紫外线照射电离辐射和紫外线照射19基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 突变类型突变类型1.点突变点突变2.缺缺 失失3.插插 入入4.倒倒
10、位位20基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 突变的遗传效应突变的遗传效应1.遗传密码的改变遗传密码的改变2.对对mRNA剪接的影响剪接的影响3.蛋白质肽链中的片段缺失蛋白质肽链中的片段缺失21基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识1.遗传密码的改变遗传密码的改变（2）无义突变无义突变（3）同义突变同义突变（4）移码突变移码突变22基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 DNA分子中碱基对的取代，使得分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种不同的氨基酸，使得多肽链酸就变成另一种不同的氨基酸，使
11、得多肽链中氨基酸的顺序也相应地发生改变，这种突中氨基酸的顺序也相应地发生改变，这种突变称为错义突变。变称为错义突变。错义突变错义突变（missense mutation）：）：23基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识G A AC T T G A A谷氨酸谷氨酸G T AC A T G U A 缬氨酸缬氨酸碱基取代引起的错义突变碱基取代引起的错义突变 A T DNAmRNA氨基酸氨基酸24基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识无义突变无义突变（nonsense mutation）：）：由于碱基的取代，使原来可翻译某种氨基由于碱基的取代，使原来可翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子
12、，这被称为无酸的密码子变成了终止密码子，这被称为无义突变。义突变。UAUUAA颠颠 换换（酪氨酸）（酪氨酸）（终止密码子）（终止密码子）25基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能编码原来的正常蛋白质，即所谓移码突变。编码原来的正常蛋白质，即所谓移码突变。移码突变移码突变（frame-shifting mutation）：）：26基因与疾病主题医学知识基因
13、与疾病主题医学知识无论是哪一种形式，都可导致无论是哪一种形式，都可导致mRNA的错误剪接，产生异常的的错误剪接，产生异常的mRNA，最终产生异常的表达产物。，最终产生异常的表达产物。mRNA前体：前体：剪剪 接接mRNA原有的剪接位点消失原有的剪接位点消失异常异常mRNA产生新的剪接位点产生新的剪接位点异常异常mRNA27基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 无义突变无义突变 DNA片段的缺失片段的缺失造成蛋白质肽链中片段缺失的原因：造成蛋白质肽链中片段缺失的原因：移码突变移码突变 移码突变不仅使翻译后的肽链中氨基酸序列发移码突变不仅使翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中
14、的大片段缺失。因为生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。因为移码使阅读框发生改变后，在结构基因中往往会移码使阅读框发生改变后，在结构基因中往往会出现多个终止密码子，无法翻译出全长的肽链。出现多个终止密码子，无法翻译出全长的肽链。UAUUAA（酪氨酸）（终止密码子）28基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识29基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识着色性干皮病（xeroderma pigmentosum，XP）XP是一种核苷酸切除修复缺陷所致的疾病，已经发现7个基因与之相关。这7个基因均与DNA的切除修复相关，不同XP患者的临床表现与涉及的具体基因及突变类型有关。30基因与疾病主题医
15、学知识基因与疾病主题医学知识(一）基因突变导致蛋白质功能改变一）基因突变导致蛋白质功能改变n多肽链合成正常多肽链合成正常n各级结构正常各级结构正常n亚细胞定位和分拣正常亚细胞定位和分拣正常n多聚体形成正常多聚体形成正常n与辅助因子或辅基结合正常与辅助因子或辅基结合正常n稳定性正常稳定性正常（1）正常蛋白质功能实现所需的条件）正常蛋白质功能实现所需的条件31基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识（2 2）基因突变对蛋白质功能的影响水平）基因突变对蛋白质功能的影响水平1.1.基因突变影响基因突变影响mRNAmRNA合成，间接影响蛋白合成，间接影响蛋白质合成质合成,影响多肽链的折叠和结构影响多
16、肽链的折叠和结构2.2.基因突变影响蛋白质（多肽链）亚细胞基因突变影响蛋白质（多肽链）亚细胞水平的定位水平的定位3.3.基因突变影响亚单位组装和多聚体形成基因突变影响亚单位组装和多聚体形成4.4.基因突变影响辅基或辅助因子与肽链的基因突变影响辅基或辅助因子与肽链的结合或去除结合或去除5.5.基因突变影响蛋白质的稳定性基因突变影响蛋白质的稳定性原发因素：基因本身；继发因素：调节因子、修饰等A B32基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识基因突变影响基因突变影响 hnRNA hnRNA 的剪接的剪接 基因突变发生在基因突变发生在 hnRNA 的一级结的一级结构上特定的剪接位点上，导致构上特定
17、的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的的剪接错误，产生异常的 mRNA，最，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。物性状。33基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识第二节第二节 基因变异导致的常见疾病基因变异导致的常见疾病 一一 遗传学疾病遗传学疾病（一）单基因遗传病（一）单基因遗传病 以-地中海贫血地中海贫血为例介绍单基因变异导致的遗传病为例介绍单基因变异导致的遗传病 -地中海贫血是因珠蛋白链的合成明显减少或完全不能地中海贫血是因珠蛋白链的合成明显减少或完全不能合成导致合成导致.珠蛋白基因结构简单珠蛋白基因结构简单,只有只有1.8KB
18、1.8KB长长,含有含有3 3个外显子个外显子,2,2个内显子个内显子,编码编码146146个氨基酸个氨基酸,-,-地中海贫血的基因缺陷地中海贫血的基因缺陷,主要由于点突变或移码突变所致主要由于点突变或移码突变所致,突变对基因表达的影响突变对基因表达的影响大致分为大致分为6 6种类型种类型:1.转录水平降低转录水平降低 2.RNA剪接异常剪接异常34基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 3.翻译缺陷翻译缺陷 4.RNA修饰缺陷修饰缺陷 5.生成不稳定的生成不稳定的珠蛋白珠蛋白 6.基因缺失引起的基因缺失引起的地中海贫血地中海贫血35基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识苯丙酮尿症
19、（苯丙酮尿症（phenylketonuriaphenylketonuria，PKUPKU）n遗传学遗传学 一种严重的常染色体隐性遗传性一种严重的常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病，首次发现于氨基酸代谢病，首次发现于19341934年，因年，因病人尿中排泄大量的苯丙酮酸而得名。病人尿中排泄大量的苯丙酮酸而得名。国外发病率约国外发病率约1/45001/45001/100,0001/100,000，我国，我国发病率约为发病率约为1/165001/16500。疾病基因已定位于。疾病基因已定位于12q24.112q24.1并已被克隆。并已被克隆。36基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识n发病机制发病
20、机制 PKUPKU患者患者PAHPAH基因突变使患者肝脏内苯基因突变使患者肝脏内苯PAHPAH缺乏，苯丙氨酸不能转变为酪氨酸，只能缺乏，苯丙氨酸不能转变为酪氨酸，只能转化为苯丙酮酸和苯乳酸并在体内累积，并转化为苯丙酮酸和苯乳酸并在体内累积，并导致血液和尿液中苯丙氨酸及其衍生物排出导致血液和尿液中苯丙氨酸及其衍生物排出增多。增多。37基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识苯丙氨酸酪氨酸-羟苯丙酮酸尿黑酸延胡索酸 乙酰乙酸PHA尿黑酸氧化酶PKUAlkaptonuria38基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识n过量过量的的苯丙氨酸使旁路代谢活苯丙氨酸使旁路代谢活跃，产生苯丙氨酸、苯乳
21、酸、跃，产生苯丙氨酸、苯乳酸、苯乙酸等，它们从尿液和汗液苯乙酸等，它们从尿液和汗液排出，使患儿的头发、皮肤和排出，使患儿的头发、皮肤和尿均有特殊气味。尿均有特殊气味。39基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识n过量过量的的苯丙氨酸抑制酪氨酸脱苯丙氨酸抑制酪氨酸脱羧酶的活性，影响去甲肾上腺羧酶的活性，影响去甲肾上腺素和肾上腺素的合成，也减少素和肾上腺素的合成，也减少黑色素的合成，使患者毛发和黑色素的合成，使患者毛发和肤色较浅肤色较浅40基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识n过量过量的的苯丙氨酸竞争性的抑制苯丙氨酸竞争性的抑制色氨酸羟化作用影响色氨酸的色氨酸羟化作用影响色氨酸的代谢。
22、代谢。此外，旁路代谢产物堆积此外，旁路代谢产物堆积还抑制还抑制L-L-谷氨酸脱羧酶的活性，使谷氨酸脱羧酶的活性，使氨基丁酸和氨基丁酸和5-5-羟色胺生成减少，导羟色胺生成减少，导致脑发育障碍。致脑发育障碍。41基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识临床表现临床表现3 34 4个月智力发育不全。个月智力发育不全。脑电图异常，骨骼发育异常，门脑电图异常，骨骼发育异常，门齿疏松。齿疏松。有较严重的呕吐，皮肤、毛发颜有较严重的呕吐，皮肤、毛发颜色变浅，虹膜颜色减退。色变浅，虹膜颜色减退。尿、汗有特殊腐臭尿、汗有特殊腐臭42基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识n治疗治疗 目前临床上常在婴儿
23、出生后立即进行目前临床上常在婴儿出生后立即进行PKUPKU的的筛查，一经肯定，立即给患儿停乳，喂给低筛查，一经肯定，立即给患儿停乳，喂给低苯丙氨酸水解蛋白，禁荤食、乳类、豆类和苯丙氨酸水解蛋白，禁荤食、乳类、豆类和豆制品，可以达到临床痊愈。豆制品，可以达到临床痊愈。43基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识(二）多基因遗传病二）多基因遗传病 糖尿病是一种异质性疾病。分为原发型和继发型两种。原发型分为胰岛素依赖性胰岛素依赖性(IDDM)(IDDM)和非胰岛素依赖性非胰岛素依赖性(NIDDM).NIDDM(NIDDM).NIDDM是多个遗传因子与环境因子共同作用的结果，包括：（1 1）胰岛素
24、基因胰岛素基因 （2 2）胰岛素受体基因胰岛素受体基因 (3)(3)葡萄糖激酶基因葡萄糖激酶基因 （4 4）糖原合酶基因糖原合酶基因 （5 5）线粒体线粒体tRNAtRNA基因基因 44基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识遗传性胰岛素抵抗糖尿病遗传性胰岛素抵抗糖尿病v 受体合成障碍受体合成障碍v 受体向胞膜运输受阻受体向胞膜运输受阻v 受体与胰岛素亲和力降低受体与胰岛素亲和力降低v 受体活性降低受体活性降低v 受体降低加快受体降低加快胰岛素受体基因突变胰岛素受体基因突变靶细胞对胰岛素反应性降低靶细胞对胰岛素反应性降低(型糖尿病型糖尿病)45基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识二
25、、神经系统疾病 以老年性痴呆为例来说明神经系统疾病的发生与基因以老年性痴呆为例来说明神经系统疾病的发生与基因变异的关系。变异的关系。AD是一种复杂的基因病,通过基因分析已确定有三种导致早发性AD发病的基因,它们分别位于1,14和21号染色体,而晚发性AD发病的遗传危险因素位于19号染色体.(一一)淀粉样前体蛋白淀粉样前体蛋白(APP)基因基因 APP是一种广泛存在于全身组织细胞的糖蛋白,正常情况下,APP由分泌酶裂解为可溶性A.基因突变或其他因素可以导致APP氨基酸序列或裂解部位的改变,从而产生易于沉淀的A.46基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 (二二)早老素基因早老素基因(PS)
26、APP基因的突变所致AD仅占FAD的2%3%.而大多数AD的病因为PS基因的突变.PS1基因与70%80%的早发AD有关,突变类型包括错义突变和剪切位点突变.PS2基因突变家族AD发病较晚.(三三)载脂蛋白载脂蛋白E(ApoE)基因基因 ApoE的等位基因4与晚发AD相关联。47基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识三、三、肿肿 瘤瘤 癌基因的激活，抑癌基因的丢失或失活均会癌基因的激活，抑癌基因的丢失或失活均会引起肿瘤的发生，发展。引起肿瘤的发生，发展。（一）癌基因激活与肿瘤的发生（一）癌基因激活与肿瘤的发生 1.ras基因变异与肿瘤发生 2.myc基因变异与肿瘤发生 3.bcl-2基因
27、与肿瘤发生 4.mdm2基因 48基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识49基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识growthdifferentiationdeathchemicalphysicalvirus+-Genes50基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 (二二)抑癌基因失活与肿瘤发生抑癌基因失活与肿瘤发生 以以p16为例说明抑癌基因失活与肿瘤发生的关为例说明抑癌基因失活与肿瘤发生的关系系 p16基因基因:又称为多肿瘤抑制因子,编码细胞周期依赖性激酶CDK4的抑制蛋白,p16蛋白既是细胞周期的有效调控者,又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子.正常情况下,cyclinD和p
28、16对CDK4的作用处于平衡状态,当p16基因异常时,cyclinD则与CDK4以优势结合,使细胞生长失去控制.51基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）遗传性恶性肿瘤 RB1基因共有27个外显子，长180kb。RB1蛋白由928个氨基酸组成，是一种磷酸化蛋白。52基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识Retinoblastomaautosomal dominant inheritancenPaediatric tumour of the retina 1/20,000 births two forms of the diseas
29、e familial and sporadicnDue to mutations in the Retinoblastoma(Rb)tumour suppressor gene53基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识The RB1 GenenLarge gene spanning 27 exons,with more than 100 known mutations.nGreater than 200kb of DNA in sizenRNA is 4.7 kbnGene encodes Rb protein which is involved in cell cycle regula
30、tion1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 17 18 19 20 21 22 23 25 27 54基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识G2G2G1G1S SM MCell cycleDPE2FDNA synthesis-related genesE2FRbPE2FCyclin D1CDK4RbPPPPPRbPPPPP55基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识(三三)肿瘤发生中的多基因协同肿瘤发生中的多基因协同作用作用一种肿瘤的发生一种肿瘤的发生,往往同时存在多种遗传缺陷往往同时存在多种遗传缺陷.目前普遍接受目前普遍接受的是细胞癌变的多基因协同假说。该假说认为
31、细胞癌变是的是细胞癌变的多基因协同假说。该假说认为细胞癌变是多步骤，多重影响的复杂过程。且这种基因之间协同效应多步骤，多重影响的复杂过程。且这种基因之间协同效应的产生并非是两种癌基因之间的随机组合。而是符合一定的产生并非是两种癌基因之间的随机组合。而是符合一定的规律。核内癌基因产物最易与胞浆癌基因产物发生协同的规律。核内癌基因产物最易与胞浆癌基因产物发生协同作用作用。56基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识（3 3）基因突变对蛋白质功能影响的效应）基因突变对蛋白质功能影响的效应n基因突变导致蛋白功能丢失基因突变导致蛋白功能丢失n数量降低数量降低n结构丧失导致活性丧失结构丧失导致活性丧失
32、n基因突变导致蛋白功能加强基因突变导致蛋白功能加强n结构改变导致活性增强结构改变导致活性增强n数量增加数量增加n基因突变导致蛋白产生新的特征或功能基因突变导致蛋白产生新的特征或功能Fast57基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识二、疾病相关基因的鉴定二、疾病相关基因的鉴定（一）检测人类基因变异或突变（一）检测人类基因变异或突变（二）疾病时基因组差异表达分析（二）疾病时基因组差异表达分析（三）染色体制图定位及疾病相关基因克隆（三）染色体制图定位及疾病相关基因克隆 58基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识第第 一一 节节 基基 因因 诊诊 断断Genetic Diagnosis59
33、基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识一、一、基因诊断的概念及常用技术基因诊断的概念及常用技术 n患者临床表现：中医的望闻问切与西医患者临床表现：中医的望闻问切与西医的影像学检查的影像学检查n细胞形态、生化检测及免疫学检验：生细胞形态、生化检测及免疫学检验：生命活动的结构和物质基础命活动的结构和物质基础 Concept of Gene Diagnosis60基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 基因诊断的概念基因诊断的概念n基因诊断的出现：基因诊断的出现：1976年加州大年加州大学华裔科学家学华裔科学家 Kan YW用核酸分子用核酸分子杂交首次对一例杂交首次对一例珠蛋白生成障碍珠
34、蛋白生成障碍性贫血进行性贫血进行诊断诊断61基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 狭义狭义:在基因（在基因（DNADNA或或RNA)RNA)水平，用水平，用PCRPCR、核酸、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。表达状态的过程，对疾病作出诊断。基因诊断的概念基因诊断的概念62基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识特点特点针对性强针对性强 特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高 适应性强适应性强一、基因诊断的概念和特点一、基因诊断的概念和
35、特点定义定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。否正常，从而对疾病作出诊断的方法。63基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 是以是以DNA和和RNA为诊断材料，通过检为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断（gene diagnosis）64基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 是检测是检测DNA或或RNA的结构变
36、化与否，量的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。疾病确诊的依据。基本原理基本原理65基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识临床意义 对疾病作出早期、确切诊断对疾病作出早期、确切诊断 确定个体对疾病的易感性确定个体对疾病的易感性 疾病的分期分型疾病的分期分型 疗效监测疗效监测 预后判断预后判断66基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识一、基因诊断中常用的分子生物学技术（二）聚合酶链式反应（PCR）（三）单链构象多态性检测（四）限制酶酶谱分
37、析（五）DNA序列测定（六）DNA芯片技术（一）核酸分子杂交67基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识（一）基因突变的诊断2.少数核苷酸缺失或插入的诊断4.基因重排（染色体易位）的诊断5.基因扩增的诊断（2）诊断未知的突变二、基因诊断的基本方法68基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识（allele specific oligonucleotide，ASO）等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸 DNA芯片芯片诊断已知的点突变：PCR PCR 反应反应69基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识PCR-PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交等位基因特异性寡核苷酸探针斑
38、点杂交(PCR-ASO(PCR-ASO，PCR-DB)PCR-DB)ASO:Allele Specific OligonucleotideASO:Allele Specific Oligonucleotide 1).wild probe 1).wild probe vsvs mutant probe mutant probe 2).2).已知突变的验证性检测已知突变的验证性检测 3).3).可区分纯合子和杂合子可区分纯合子和杂合子 70基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识ATATCGCGCGATG正常探针正常探针突变探针突变探针A PCR样品点样品点 样在滤膜上样在滤膜上斑点或狭缝斑点
39、或狭缝杂交杂交斑点或狭缝斑点或狭缝杂交杂交71基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识寡核苷酸杂交分析寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特和等位基因特异寡核苷酸杂交异寡核苷酸杂交 72基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识引物1引物2 5 5PCRATAT3 3CGCG1 1CGAT2 2TC73基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 PCR 多重多重PCR法法74基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识引物 4引物 3引物 2引物 1531：（：（1+2）2：（：（3+4）4：（：（3+4）片段缺失片段缺失3：（：（1+2）片段缺失片段缺失5：分子量标准分子量标准75基因与
40、疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识提取基因组提取基因组DNAPCR基因片段扩增基因片段扩增特定限制酶酶切特定限制酶酶切分析酶切后产物分子的有无、分析酶切后产物分子的有无、大小，判断是否有疾病基因。大小，判断是否有疾病基因。电泳电泳（设计引物）76基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识person Aperson B5 A33 T5 5 G33 C5 DNA多态性：多态性：在人群中，个体间基因组的核苷酸序列在人群中，个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性，存在着差异性，称为称为DNA多态性。多态性。77基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识Bam HIBam HIBam HI酶切片
41、段酶切片段位点消失位点消失位点获得位点获得片段缺失片段缺失片段插入片段插入 能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多多态性位点态性位点，但片段长度变化还可以由其它原因引起。，但片段长度变化还可以由其它原因引起。78基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识RFLP的产生有两种情况：的产生有两种情况：1：位点多态性：位点多态性 在限制酶识别位点发生在限制酶识别位点发生单个碱基置换单个碱基置换，导致这，导致这 一一多态性位点的丢失或获得，多态性位点的丢失或获得，称为位点多态性。称为位点多态性。由于限制酶识别位点之间的由于限制酶识别位点之间的DNA序列缺失
42、、插序列缺失、插入或重复，入或重复，限制酶的识别序列不发生改变，但它在限制酶的识别序列不发生改变，但它在基因组中相对位置发生了变化。基因组中相对位置发生了变化。2：片段多态性：片段多态性79基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 人类基因的基因内或旁侧序列存在许多人类基因的基因内或旁侧序列存在许多重复序列（如微卫星重复序列（如微卫星DNA、小卫星、小卫星DNA等），等），由于重复单位的数目不同而形成多态性，即由于重复单位的数目不同而形成多态性，即DNA重复序列多态性。重复序列多态性。DNA重复序列多态性重复序列多态性80基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 小卫星小卫星 DNA是
43、由是由924bp为重复单位的串联重复顺序构成，为重复单位的串联重复顺序构成，总长度约为总长度约为0.120kb，重复次数变化很大（从数次到数百，重复次数变化很大（从数次到数百次）。分布于所有染色体，往往位于近端粒处，个体间的差次）。分布于所有染色体，往往位于近端粒处，个体间的差异很大。异很大。微卫星微卫星DNA是由是由15bp为重复单位的寡核苷酸串联重复序为重复单位的寡核苷酸串联重复序列构成，总长度常小于列构成，总长度常小于150bp，重复次数，重复次数1060次左右。存在次左右。存在于内含子、间隔于内含子、间隔DNA中，也可以存在于编码区。中，也可以存在于编码区。81基因与疾病主题医学知识基
44、因与疾病主题医学知识若显示与正常人不同的杂交条带，据此诊断疾病。若显示与正常人不同的杂交条带，据此诊断疾病。1).选用特定限制酶选用特定限制酶酶切酶切DNA特异探针特异探针Southern印迹杂交印迹杂交+提取基因组提取基因组DNA1.限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析（1）限制酶酶切图谱直接分析法）限制酶酶切图谱直接分析法 82基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 2.2.PCRPCRRFLPRFLP：通过通过PCRPCR将包含待将包含待测位点的测位点的DNADNA片段扩增后，用识别相应片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根据所位点的限制性核酸内切酶水解，
45、根据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。产生限制性片段的数量和长度作出诊断。用于已知突变位点的验证性诊断用于已知突变位点的验证性诊断 83基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 2).提取基因组提取基因组DNAPCR基因片段扩增基因片段扩增特定限制酶酶切特定限制酶酶切分析酶切后产物分子的有无、分析酶切后产物分子的有无、大小，判断是否有疾病基因。大小，判断是否有疾病基因。电泳电泳（设计引物）84基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识RFLP-Restriction Fragment Length Polyhmorphism85基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识RLFP分析
46、法分析法86基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析87基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析88基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识限制酶酶切图谱直接分析法：限制酶酶切图谱直接分析法：分析点多态性分析点多态性 分析缺失、插入或重组引起
47、的多态性分析缺失、插入或重组引起的多态性 诊断疾病基因结构多态性变异已经明确的疾病诊断疾病基因结构多态性变异已经明确的疾病89基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 人类基因组的人类基因组的位点多态性位点多态性和和串联重复顺序串联重复顺序多态性多态性都是按孟德尔规律遗传的，都是按孟德尔规律遗传的，具有体细具有体细胞稳定性和种系稳定性，因此可用它们作为染胞稳定性和种系稳定性，因此可用它们作为染色体上疾病基因座位的遗传标记。色体上疾病基因座位的遗传标记。用于检测疾病基因的携带者，产前诊断。用于检测疾病基因的携带者，产前诊断。在法医学上可用于个体（罪犯）鉴定以及在法医学上可用于个体（罪犯）鉴定
48、以及亲子鉴定等。亲子鉴定等。90基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识 PCR-PCR-单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（PCR-PCR-SSCP)SSCP)将将PCRPCR产物变性为单链后进行非变性（中产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成改变即可造成DNADNA单链构象的改变，进而导单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。致电泳速率变化，从而检测出基因突变。1 1）单链核酸碱基）单链核酸碱基-构象构象-电泳速率电泳速率2 2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 91基因与疾
49、病主题医学知识基因与疾病主题医学知识PCR/单链构象多态性分析单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。定致病基因的存在。92基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意93基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变Leber 病患者病患者 PCR/SSCP分析
50、分析+94基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识（三）（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基序列测定是最直接、最准确的基 因诊断技术因诊断技术例：四色荧光自动测序分析结果例：四色荧光自动测序分析结果95基因与疾病主题医学知识基因与疾病主题医学知识微生物学、免疫学和血清学等方法检测微生物学、免疫学和血清学等方法检测核酸分子杂交或核酸分子杂交或PCR等技术，等技术，细菌、病毒、支原体、细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体和寄衣原体、立克次体和寄生虫等生虫等（灵敏度不高，或特异性较低，不能早期诊断）（灵敏度不高，或特异性较低，不能早期诊断）（可早期、快速、敏感、特异性高）（可早期、快速、敏感
