1、大肠杆菌基因工程细菌与基因工程密不可分。细菌与基因工程密不可分。19731973年，年，BoyerBoyer和和CohenCohen首次首次完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。几年后，第一个基因工程产品几年后，第一个基因工程产品利用构建基因的基因工利用构建基因的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的产业时代。产业时代。细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举细菌不仅在基
2、因重组技术的诞生和技术进步中起到了举足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。大肠杆菌基因工程27-1.大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌
3、的遗传不稳定性及其对策3一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物4大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素5二、外
4、源基因在大肠杆菌中高效表达的原理二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数6（一）启动子（一）启动子v启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测目的基因EEA启动子启动子A 酶切开酶切开Bal31酶解酶解目的基因EE7v启动子的筛选启动子的筛选AprorigalKpKO1采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克片段克隆到启动子探针质粒隆到启动子探针质粒pKO1上；上；受体细胞染色体受体细胞染色体DNA上的上的galE、galT与质粒上与质粒上报告基因报告基因galk的表达产物联合作用，可将
5、培养的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质。基中的半乳糖酵解成红色素物质。转化转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆8v启动子的构建启动子的构建-35 区序列区序列-10 区序列区序列PLPrecAPtrpPlacPtraAPtac启动子启动子T T G A C AG A T A C TT T G A T AT A T A A TT T G A C AT T A A C TT A G A C AT A A T G TT T T A C AT A T A A TT T G A C AT
6、A T A A T9v启动子的可控性启动子的可控性PF乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性的可控性：OPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖 异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的野生型的Plac与其控制区与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基底水平表达；底水平表达；基底水平转录诱导物可以使启动子诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高。介导的转录大幅提高。10PlacO高效转录高效转录葡萄糖代谢葡萄糖代谢野生型的野生型的Plac上游附近拥有上游附近拥有代谢激活因子代谢激活因子（CAP）结合结合区，区，cAMP激活激活
7、CAP，CAP结合启动子控制区，进而促结合启动子控制区，进而促进进Plac介导的转录。介导的转录。基底水平转录基底水平转录葡萄糖代谢使葡萄糖代谢使cAMP减少，减少，也能阻遏也能阻遏Plac介导的转录。因介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即遏的突变型，即Plac UV5。CAPcAMPcAMP浓度降低浓度降低Plac UV5O高效转录高效转录PlacOF乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性的可控性：11色氨酸启动子色氨酸启动子Ptrp的可控性：的可控性：除去除去色氨酸色氨酸色氨酸启动子色氨酸启动子Ptrp受
8、色氨酸受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态；录呈基底状态；在培养系统中去除色氨酸或在培养系统中去除色氨酸或者加入者加入3-吲哚丙烯酸（吲哚丙烯酸（IAA），），便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。基底水平转录基底水平转录在正常的细菌培养体系中在正常的细菌培养体系中,除除去色氨酸是困难的，因此基因去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加工程中往往添加IAA诱导诱导Ptrp介导的目基因的表达。介导的目基因的表达。色氨酸色氨酸或加或加3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸高效转录高效转录PtrpOtrp阻遏蛋白阻遏蛋白 （IAA）OtrpPtrp高效转录高效转
9、录OtrpPtrp12l l噬菌体噬菌体启动子启动子Pl lL的可控性：的可控性：噬菌体启动子噬菌体启动子PL受受CI阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因突变基因cI857控制控制PL。cI857阻遏蛋在阻遏蛋在42时失活脱落，时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达便可介导目的基因的表达.PtrpAcI857BPL目的基因阻遏作用BPLPtrpA表达色氨酸但在大型细菌培养罐中迅速升温但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统控制系统，用色氨酸
10、间接控制目的用色氨酸间接控制目的基因表达。基因表达。13（二）终止子（二）终止子1.强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性v外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的粒上邻近的DNADNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNAmRNA混合物；混合物；v过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。表达。14如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因
11、或DNA功功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；致重组质粒的不稳定性；转录产物越长，转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子聚合酶转录一分子mRNA所需的时间所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；过长的过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形
12、成理想的二级结更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。大肠杆菌基因工程152.强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上操纵子上的的rrnT1T2以及以及T7噬菌体噬菌体DNA上的上的Tf f；pCP1AproriTcr筛选筛选Apr、Tcs的转化子的转化子对于一些终止作用较弱的终止子，对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以
13、增强其转录终止作用；殊结构，以增强其转录终止作用；终止子也可以象启动子那样，从细终止子也可以象启动子那样，从细菌或噬菌体基因组菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。中克隆筛选。终止子序列终止子序列16（三）核糖体结合位点（三）核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时
14、可高达数百倍。数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其5 端的结构序端的结构序列所决定，称为列所决定，称为核糖体结合位点核糖体结合位点（RBS）17四个特征结构要素：四个特征结构要素：1.核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构Shine-Dalgarno（SD）序列：序列：位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的6-8个个核苷酸序列核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的基中的16S rRNA 3端区域端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，并与之专一性结合，将将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译
15、；定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子：翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架作为阅读框架的起始位点的起始位点,但有些基因也使用但有些基因也使用GUG或或UUG作为翻译起始密码子；作为翻译起始密码子；SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。基因编码区基因编码区5 端若干密码子的碱基序列。启始密码子后为端若干密码子的碱基序列。启始密码子后为GCAU或或AAAA时，翻译效率最高。时，翻译效率最高。182.核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列的影响序列的影响：一般
16、来说，一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列序列与与16S rRNA的碱基互补性，其中以的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成个换成C或或T，均会导致翻译效率大幅度降低均会导致翻译效率大幅度降低。19SD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响：紧邻紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，
17、对于大肠杆菌大肠杆菌b b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳而言，在这个位置上最佳的碱基组合是的碱基组合是UAU或或CUU，如果用如果用UUC、UCA或或AGG取取代之，则酶的表达水平低代之，则酶的表达水平低20倍。倍。SD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAA或或UUUU，翻译效率最高；翻译效率最高；而而CCCC或或GGGG的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的50%和和25%。20SD序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在在核糖体上定位
18、后，翻译起始密码子核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体正好处于核糖体复合物结构中的复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下在很多情况下,SD序列位于序列位于AUG之前大约之前大约7 7个碱基处，个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。始效率不同程度的降低。21起始密码子及其后续若干密码子的影响：起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别分子可以同时识别AUG、GUG和和UUG三种起始密码子，但其识别频
19、率并不相同三种起始密码子，但其识别频率并不相同,通常通常GUG为为AUG的的50%而而UUG只及只及AUG的的25%。除此之外，从除此之外，从AUGAUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与至少这一序列不能与mRNAmRNA的的5 5 端非编码区形成茎环结构，否端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰则便会严重干扰mRNAmRNA在核糖体上的准确定位；在核糖体上的准确定位；目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最有与启动
20、子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。佳的。22(四四)密码子密码子1.生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。爱性。23生物基因组中的碱基含量：在富含生物基因组中的碱基含量：在富含ATAT的生物（如单链的生物（如单链DNADNA噬菌噬菌体体fX174fX174）基因组中基因组中,密码子第三位上的密码子第三位上的U U和和A A出现的频率较高出现的频率较高;而而在在GCGC丰富的生物（如链霉菌）
21、基因组中丰富的生物（如链霉菌）基因组中,第三位上含有第三位上含有G G或或C C的简的简并密码子占并密码子占90%90%以上的绝对优势。以上的绝对优势。密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律细胞内细胞内tRNAtRNA的含量的含量如如GGGGGG、CCCCCC、GCGGCG、GGCGGC、AAAAAA、UUUUUU、AUAAUA、UAUUAU等使用少；等使用少；如如GUGGUG、CACCAC、UCGUCG、AGCAGC、ACAACA、UGUUGU、AUCAUC、UUGUUG等使用多；等使用多；v偏爱密码子的决定因素：偏爱密码子的决定因素
22、：大肠杆菌基因工程242.密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相
23、关tRNA编码基因编码基因25v按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。这种方法。外源基因全合成外源基因全合成26对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。编码基因同步
24、克隆表达的策略较为有利。同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因27为了提高人尿激酶原为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高效表达的编码基因克隆在另一个高效表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。细胞对外源基因高效表达的制约作用。例如，在人尿激酶原例如，在人尿激酶原cDNA的的412个密码子中，共含有个密码子中，共含有22个个精氨酸密码子，精氨酸密码子，其中其中7个个AGG、2个个A
25、GA，而大肠杆菌受而大肠杆菌受体细胞中体细胞中tRNAAGG和和tRNAAGA的丰度较低。的丰度较低。大肠杆菌基因工程28（五）质粒拷贝数（五）质粒拷贝数1.质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势质粒分子的过度增
26、殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。292.质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制在在28时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为60oripCP3PLMCSApr在在42时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至300-600在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时控制质粒活。因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的
27、表达拷贝数和基因的表达pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子拥有一个温度可诱导型的复制子30三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建31（一）包涵体型异源蛋白的表达（一）包涵体型异源蛋白的表达1.包涵体及其性质包涵体及其性质包涵体包涵体(Inclusion Bodies，IB)：在某些生长条件下，在某些生长条
28、件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶性结构。性结构。32富含蛋白质的包涵体多见于生长在富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物含有氨基酸类似物培养基的培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同由高效表达质粒构建的大肠杆菌
29、工程菌大量合成非天然性的同源或源或异源蛋白质，异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋和脂多糖等非蛋白分子。白分子。大肠杆菌基因工程332.以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋菌体经超声波裂解后，直接通过高速
30、离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。白从细菌裂解物中分离出来。在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 34包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，丧失了原有的生物活性，必必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构须通过有效的变性复性
31、操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题然而，这也是一个技术难题,尤其当目标蛋白分子中的尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过超过30%。353.以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作如果未进行特殊设计如果未进行特殊设计(如分泌型表达或融合型表达如分泌型表达或融合型表达),),外外源基因在大
32、肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。处所在。364.包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作C 共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质1）蛋白质变性复性的动力学原理：）蛋白质变性复性的动力学原理：C1C2CnCUI 1I nNX1X2XnXAgAgAgAgI 有效变复
33、性过程中的中间状态有效变复性过程中的中间状态X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态N 天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质U 变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质A 集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质v在细菌细胞内，集聚状态和在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作
34、。372）包涵体的溶解与变性：）包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化促溶剂促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应形成的氰酸盐污
35、染，后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应条件下发生修饰反应385.包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refolding）：）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的将多肽链中被拆开的游离巯基游离巯基重新折叠重新折叠通过通过次级键次级键的形成使蛋白质复性的形成使蛋白质复性39包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refolding）：）：复性操作复性操作1
36、)包涵体复性操作的方法包括：包涵体复性操作的方法包括：一步稀释法：一步稀释法：蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大分段稀释法：分段稀释法：逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生试剂添加法：试剂添加法：精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法：蛋白修饰法：氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法：产物隔离法：将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法：分子伴侣法：GroEL、Gro
37、ES、DnaK，固定化，共表达固定化，共表达40包涵体的复性与重折叠包涵体的复性与重折叠(refolding)：二硫键形成二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。41化学氧化法（化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二
38、硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠。残基的蛋白质的重折叠。二硫键交换（二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和和GSSG），），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。效果好。形成二硫键的方式主要有：形成二硫键的方式主要有：HSHS S S2e+2H+AHSHS S-S-R HS+BR-S-S-R S S2R-SH大肠杆菌基因工程42（二）分泌型异源蛋白的表达（二）分泌型异源蛋白的表达即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在
39、于细胞质中；即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外 膜进入培养基中。膜进入培养基中。蛋白产物蛋白产物N端端信号肽信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：为两种形式：431.以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，重组人胰岛素原
40、若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的其稳定性大约是在细胞质中的1010倍。倍。目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白相当多的真核生物成熟蛋白N端并不端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质蛋白质N N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。v 如若将外源基因与大肠如若将外源基因与大肠杆菌的杆菌的信号肽编码序列重组在一起，信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽端的甲硫氨酸残基便可在信号
41、肽的剪切过程中被有效除去。的剪切过程中被有效除去。44分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点：外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多；要比包涵体方式低很多；相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全；并不健全；因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。菌尽管有，但并不普遍。452.蛋白质的分泌机制蛋白质的分泌机制因
42、此与包涵体相比，分因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白的回收率增加，且对蛋白酶不敏感。酶不敏感。信号肽信号肽胞内胞内胞外胞外目标蛋白目标蛋白内膜内膜外膜外膜周质周质胞壁胞壁信号肽剪切酶系信号肽剪切酶系原核细菌周质中含有多原核细菌周质中含有多种种分子伴侣分子伴侣可阻止分泌蛋可阻止分泌蛋白的随机折叠白的随机折叠，分泌在细分泌在细胞周质或培养基中的重组胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二蛋白很少形成分子间的二硫键交联；硫键交联；463.分泌型目的蛋白表达系统的构建分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大肠
43、杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中；（细菌素）分泌到培养基中；这一过程严格依赖于这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。47因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。质粒上即可构建完全分泌型的受
44、体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。肠杆菌中的完全分泌。大肠杆菌基因工程48（三）融合型异源蛋白的表达（三）融合型异源蛋白的表达除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。质编
45、码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。融合蛋白。在这种融合蛋白在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于C端。端。通过在通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。蛋白。491.以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高目
46、的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲 和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白溶解性好目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内 形成良好的空间构象，且大多具有水溶性形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收目的蛋白需要回收 融合蛋白需要
47、裂解和进一步分离，才能获目的融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的 蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就 在该工段在该工段502.融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建1 1）融合蛋白表达质粒的构建原则：）融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化；亲和层析进行特异性简单纯化；外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体
48、结构供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件；量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件；两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺；定着融合蛋白的裂解工艺；两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。512 2）用于融合蛋白构建的受体蛋白：）用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶（GST）维持良好空间构象维持良好
49、空间构象麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBP）促进分泌促进分泌硫氧化还原蛋白（硫氧化还原蛋白（TrxA）维持良好空间构象维持良好空间构象 pTrxFus金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫亲和层析免疫亲和层析 pRIT2T-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ）免疫亲和层析免疫亲和层析外膜蛋白（外膜蛋白（OmpF）促进分泌促进分泌泛素蛋白（泛素蛋白（Ubi）维持良好空间构象维持良好空间构象523)目的蛋白的回收目的蛋白的回收融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导白的空间构象和生物活性
50、，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。序。酶促裂解法酶促裂解法 化学断裂法化学断裂法 融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：53 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基硫醚基 反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在
