1、水中总大肠菌群的测定四四 培养基的配制培养基的配制（1）乳糖蛋白胨培养液：按照说明称取适量培养基，溶于蒸馏水中，分）乳糖蛋白胨培养液：按照说明称取适量培养基，溶于蒸馏水中，分装于试管中，每个试管装于试管中，每个试管10ml，倒置一德汉氏小管，于，倒置一德汉氏小管，于115高压灭菌器中高压灭菌器中灭菌灭菌20min，贮存于冷暗处备用。，贮存于冷暗处备用。（2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述制备方法配制，除蒸馏水外，三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述制备方法配制，除蒸馏水外，培养基用量增加至三倍，分装于试管中，每个试管培养基用量增加至三倍，分装于试管中，每个试管5ml。（3）伊红美培养基：按照说明
2、称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏伊红美培养基：按照说明称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏水溶解，水溶解，115高压灭菌高压灭菌15min，待冷却至，待冷却至4550，倒平板待用。，倒平板待用。培养基配制操作图示：培养基配制操作图示：3水中总大肠菌群的测定用漏斗分装培养基及摆斜面用漏斗分装培养基及摆斜面培养基的分装：培养基的分装：一般制作斜面培养基时，每只一般制作斜面培养基时，每只1515150150毫米的试管，约装毫米的试管，约装3 34 4毫升（毫升（1/41/41/31/3试管高度），如制作深层培养基，每只试管高度），如制作深层培养基，每只2020220220毫米毫米的试管约装的试管
3、约装12121515毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。半为宜。4水中总大肠菌群的测定包扎1培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。套做一包，待灭菌。2吸管：在距其粗头顶端约吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端
4、，与报纸约呈报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。角，并将右端多余的报纸打一小结。3三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打一小结。角，并将右端多余的报纸打一小结。4.玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱160170灭菌灭菌2 h.5水中总大肠菌群的测定6水中总大肠菌群的测定7水中总大肠菌群的测定 1.1.灭菌器内加入一定量的水，将用灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎防水纸包扎好的物品放入其中。好的物品放入其中。2.2.接通电
5、源，进行加热。接通电源，进行加热。3.3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm0.5kg/cm2 2时再打开排气阀，待压力回复到时再打开排气阀，待压力回复到0 0时时再关闭排气阀。再关闭排气阀。4.4.当压力达当压力达15bl/in15bl/in2 2（即（即1.05kg/cm1.05kg/cm2 2）时，此时灭菌器内的温度为）时，此时灭菌器内的温度为1211210 0C C，维持维持30min30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨
6、基酸等物时，应适当降。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。低压力，延长时间。5.5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。开灭菌器盖，取出物品。灭菌8水中总大肠菌群的测定高压蒸汽自动高压蒸汽自动灭菌锅灭菌锅手提式高压蒸手提式高压蒸汽灭菌锅汽灭菌锅9水中总大肠菌群的测定倒平板操作法示意图倒平板操作法示意图斜面摆放与冷凝斜面摆放与冷凝10水中总大肠菌群的测定五五 操作步骤操作步骤1 水样的采取水样的采取（1）检测自来水）检测自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼
7、先将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌，再开放水龙头使水流灭菌，再开放水龙头使水流5 min后，后，在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，迅速地进行分析。在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，迅速地进行分析。（2 2）检测池水、河水或湖水）检测池水、河水或湖水 应取距水面应取距水面101015cm15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即好，再从水中取
8、出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即检测，否则需放入冰箱中保存。检测，否则需放入冰箱中保存。11水中总大肠菌群的测定3 初发酵试验初发酵试验（1）生活饮用水生活饮用水 在两个装有已灭菌的在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在。在10支装有已灭菌的支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样匀的水
9、样10mL，混匀后置于，混匀后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h。（2）水源水水源水在装有在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；水样品；于各装有于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各水样；再于各装有装有10mL乳糖蛋白胨培养液的乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10稀释的水样。共计稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于
10、37恒温箱内培养恒温箱内培养48h。（可以根据水的污染程度选择（可以根据水的污染程度选择3个稀释度）个稀释度）12水中总大肠菌群的测定4 分离培养分离培养 将初发酵的阳性管将初发酵的阳性管(产酸产气产酸产气)的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培养基平板。置养基平板。置361温箱内，培养温箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态。，然后取出，观察菌落形态。选择符合大肠菌群菌落特征的菌落选择符合大肠菌群菌落特征的菌落:深紫黑色，有金属光泽；深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，紫黑色，不带或略带金属光泽；不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深淡紫红色，中心颜色较深,
11、挑取一部分，进行革挑取一部分，进行革兰氏染色。兰氏染色。平板划线分离操作法示意图13水中总大肠菌群的测定5 复发酵试验复发酵试验 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒置管），每一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒置管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落13个，然后置于个，然后置于37恒温箱中恒温箱中培养培养24h，有产酸、产气者，即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群，有产酸、产气者，
12、即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠，报告每升水样中的大肠菌群数。菌群数。每组：每组：三倍浓缩乳糖蛋白胨（三倍浓缩乳糖蛋白胨（5 ml）15管管 普通浓度乳糖蛋白胨（普通浓度乳糖蛋白胨（10 ml）15管管伊红美兰培养基伊红美兰培养基 150 ml(5个平板个平板)三角瓶三角瓶1个（装个（装27mL蒸馏水灭菌）、蒸馏水灭菌）、10ml吸管吸管 2支、支、1ml吸管吸管2支包扎灭菌支包扎灭菌14水中总大肠菌群的测定表表2 最可能数最可能数(MPN)表表（接种（接种5份份10mL水样、水样、5份份1mL水水样、样、5份份0.1mL水水样时，不同阳性样时，不同阳性及阴及阴 性情况下性情况下100mL水样中细水样中细菌数的最可能数菌数的最可能数和和95%可信限值）可信限值）15水中总大肠菌群的测定思考题1.何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属？2.假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？3.为什么接种100、10 mL水样，用的是3倍 浓缩的乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、0.1、0.01、0.001 mL水样，则用乳糖蛋白胨培养基？16水中总大肠菌群的测定
