1、肺炎支原体及耐药位点核酸检测肺炎支原体及耐药位点核酸检测1流行病学分析2肺炎支原体耐药现状3 大环内酯抗生素耐药机制目录CONTENT5肺炎支原体耐药与临床3 体内诱导耐药株Part 141肺炎支原体及耐药突变检测项目简介 p1302儿童肺炎支原体肺炎 社区获得性肺炎社区获得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP)肺炎支原体肺炎肺炎支原体肺炎 (Mycoplasma pneumoniae,MP)MP 占CAP的1040%。支原体支原体：是介于细菌与病毒之间的微生物。已发现约60种，14种可致病.致呼吸道感染：肺炎支原体最常见，沙眼衣原体次之。实验室诊断实验室诊
2、断：病原学检查病原学检查包括包括：培养 血清学（特异性：Ag、Ab；非特异性）、核酸诊断技术（PCR ）分离培养分离培养：（1）咽喉、鼻咽、胸水或体液中分离培养出MP是诊断MP感染的可靠标准。（2）需1014天或更长，早期诊断意义不大，用于回顾性诊断和研究。（3）快速培养敏感性和特异性均不高，价值有限。1.儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识.中华实用儿科临床杂志.2015，30（17）：1304病原学检查：血清学病原学检查：血清学特异性诊断特异性诊断：检测抗原和抗体 1.1.明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验（PA）：检测IgM和 IgG混合抗体。单次抗体滴度1:160，诊断近期感染参考价值。恢复期
3、和急性期双份抗体滴度：4倍/4倍以上增高/减低时，确诊价值 2.2.酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）：可分别检测IgM和IgG，单次MP-IgM阳性：对诊断MP的近期感染有价值。恢复期和急性期IgM或IgG抗体滴度呈4倍或者4倍以上增高或减低时，可以确诊为MP感染。非特异性诊断非特异性诊断：冷凝集试验冷凝集试验（CA），参考价值。MP感染时阳性率仅为50%左右；腺病毒、巨细胞病毒、EB病毒等感染也可诱导血清冷凝集素的产生。1.儿童社区获得性肺炎管理指南.中华儿科杂志.2013，51（10）：7452.成人肺炎支原体肺炎诊治专家共识，中华结核和呼吸杂志，2010,33（9）：643
4、病原学检查：血清学病原学检查：血清学MP-IgM：(1)病程病程：感染后早期抗体，一般感染后45天出现，检测太早可假阴性。持续 13个月甚至更长；(2)年龄年龄：婴幼儿免疫功能不完善，产生抗体能力低，可出现假阴性或者低滴度的抗体，评价结果时需考虑患儿的病程及年龄。(3)厂家及方法厂家及方法：试剂盒生产厂家和检测方法不同，判断的阳性结果值有所差异。病原学诊断：核酸诊断技术方法：RT-PCR、环介导等温扩增（LAMP）技术、RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT）技术等。优点：（1）特异性强、敏感、快速，可用于早期诊断。（2）核酸扩增技术不受年龄、抗体产生能力、病程早晚及用药因素干扰，感染早期检测率最
5、高。注意：与感染后携带状态鉴别。有研究显示，MP感染后1个月，其DNA的检出率仍然高达50%，MP-DNA持续携带的中位数时间为7周，个别达7个月之久。联合检测：血清学和核酸检测联合，提高检出率。小结无论是分离培养，血清学检测，还是分子生物学检测，都存在各自的局限性，目前学者多推荐采用 2 种或 2 种以上诊断方法相结合，以提高诊断的准确性。针对不同的诊断方法，具体分析实验中出现的结果不一致现象，适当调整试验方法，综合考虑临床、经济性以及可操作性等问题，探索并制定出更适合于临床的快速、准确、经济的诊断方法，必将推动 MP 感 染 临 床 诊 断 和 治 疗 的 进 一 步 发 展。治疗肺炎支原
6、体肺炎常用抗菌药物：大环内酯类 氟喹诺酮类 四环素类抗感染治疗的疗程通常需要10-14天，部分难治性病例的疗程可延长至3周左右用药治疗大环内酯类大环内酯类：首选机理机理：与MP核糖体的特殊靶位的蛋白质结合，阻断转肽酶作用，感染mRNA移位，选择性抑制MP蛋白质合成。种类种类：第一代：红霉素 第二代：阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素；第三代酮内酯类：泰利霉素（telithromycin）,塞红霉素（cethromycin)用于MP治疗的主要是1、2代，三代尚未用于儿童。儿童社区获得性肺炎管理指南（2013修订），中华儿科杂志，2013,51（10）：745大环内酯类抗生素耐药形势严峻！大环内酯类抗生
7、素耐药形势严峻！自2001年日本首次分离到对大环内酯类抗生素耐药的MP后，世界多 国相继报道出现MP耐药株，日本及中国MP耐药率明显高于其他国家。日本MP对大环内酯类抗菌药物的耐药率达到40%；美国MP耐药率大约8.3%；多数欧洲国家，耐药率低于10%；在中国，有报道住院儿童MP耐药率80%，成人耐药率约为69%。我国肺炎支原体对大环内酯药物耐药严重 我国北京、上海两家医院，儿童呼吸道感染患者中肺炎支原体对大环内酯类抗生素的耐药率已经超过了80%Diagn Microb Infect Dis，2010(in press)/AAC 2009;53:21582159/AAC 2008;52:348
8、350 Clin Microbiol Infect.2009 Sep 17.Epub ahead of print/J Clin Microbiol.2007;45:35343539 肺炎支原体对于大环内酯类的耐药率高达69%356例成人患者中共分离到67株肺炎支原体：CAP患者肺炎支原体的分离率显著高于急性上呼吸道感染患者 69%(46株)肺炎支原体对于红霉素耐药(MIC值32 g/mL)Clin Infect Dis 2010;51:189194 大环内脂类抗生素耐药机制大环内脂类抗生素耐药机制研究发现，MP的耐药机制与大环内酯类抗生素的的结合位点有关，其中在23S rRNA上的2063和
9、2064两个位点的点突变，是引起 MP对大环内酯类抗生素耐药的主要原因。研究显示，发生耐药位点（2063位点和2064位点）突变的MP感染患者与未发生突变的MP感染患者相比，不仅发热时间、住院时间和大环内酯类药物的起效时间更长，且肺外并发症的发生率更高，影像学结果显示病情更严重。耐药突变给临床治疗带来众多问题，如患儿的临床症状加重、肺外并发症增多、住院时间延长、治疗经费增高等。非大环内酯类：四环素类四环素类 包括：包括：多西环素、米诺环素/美满霉素、替加环素、作用作用：对MP强大的抑菌活性。机理机理：作用于MP核糖体30S亚基，抑制蛋白质合成的肽链延长。副作用副作用：可能使牙齿发黄或者牙釉质发
10、育不良等，应用于8岁以上患儿。非大环内酯类：喹诺酮类喹诺酮类机理机理：与MP的DNA 解旋酶和拓扑异构酶发生交替作用，干扰和抑制蛋白质合成，对MP有抑制作用。品种品种：呼吸喹诺酮（左氧氟沙星、莫西沙星、吉米沙星）抗MP活性及组织穿透性、吞噬细胞内浓度均良好。环丙沙星抗MP活性好，但组织穿透性差；诺氟沙星、伊诺沙星抗MP活性差。副作用副作用:可能对骨骼产生不良影响，18岁以下儿童使用受到限制。目前在国内外尚未发现对喹诺酮类、四环素类耐药的肺炎支原体菌株报道。成人肺炎支原体肺炎诊治专家共识，中华结核和呼吸杂志，2010,33（9）：643耐药检测方法体外药敏方法集患儿的咽拭子标本，接种于MP培养基
11、中，混匀后置于37 二氧化碳孵箱中培养，对培养阳性的MP菌株进行体外药敏试验，测定其红霉素的最小抑菌浓度(MIC)，从而判断是否为耐药株。常规体外药敏试验方法是以MP培养为中心，但由于MP对营养条件要求高，培养所需时间较长(至少20天或更长时间)，分离阳性率低，故此方法不能及时的指导临床治疗，仅能作为回顾性的诊断和研究。分子药敏试验直接提取所采集咽拭子标本的DNA，运用PCR方法扩增与大环内酯类抗生素耐药有关的靶位基因，扩增产物进行DNA测序，测得序列与NCBI登录的MP标准株M129的相应基因序列作比对，检测耐药基因的变化。此方法能直接检测临床标本中的MP及其耐药性，具有特异性强、敏感性高、
12、快速等优点，应用在分离难度大、耗时长的MP更有意义，有非常广泛的应用前景。实时PCR检测方法法国Peuchant O等应用实时PCR检测MP的耐药性，制定了一种双重实时PCR检测与大环内酯类耐药有关的23S rRNA的6种突变和一种单一实时PCR鉴定A2063G突变。这两种方法依赖于荧光共振能量转移结合熔解曲线分析，、并直接适用于检测呼吸道I临床标本。但两种实时PCR方法的局限性在于，对每种探针来讲，检测低限均为10拷贝ml。该方法具有特异性强、准确、快速等优点，但由于对实验室条件和技术人员要求较高、经济耗费高等原因，尚不适宜广泛应用检测检测MP-DNAMP-DNA及耐药突变位点意义及耐药突变
13、位点意义m采用荧光PCR技术，可以一步检测，同时解决两大问题，明确病原体的同时确定是否耐药，即时给出用药指导。意义：m1、直接检测病原体，早期、快速、特异诊断；有利于临床症状分析及病情监测；2、对患者进行MP耐药基因突变检测，不仅可以辅助临床医生及时诊断和监测病情，同时有利于指导医生合理用药，避免滥用抗生素，3、有利于选择合理治疗方案，针对性治疗；有利于预判病程发展，向病人及家属解释病程情况 耐药MP感染的治疗抗生素治疗对于耐药MP感染来说，目前可应用为红霉素、阿奇霉素序贯疗法，即红霉素静滴37天，口服阿奇霉素3天，停4天，7天为一个疗程，根据病情按此方案重复24次，此治疗方案不良反应小、依从
14、性好，效果满意。对于重症病例也可联合使用利福平和大环内酯类药物，两者对MP有着协同的抑蔚作用。如患儿年龄大于8岁，使用大环内酯类药物治疗效果不满意时，可使用四环素类药物如米诺环素，因其作用机制不同，故对耐药MP有一定疗效。耐药MP感染的治疗中医药治疗中医认为肺炎属于温病范畴，肺炎的发生、发展、转归与毒无不相关，因此治疗肺炎的首要措施是祛邪解毒；同时肺为多气多血之脏，易出现气郁血瘀，可加用活血化瘀药。故肺炎的治疗主要以清热解毒及活血化瘀为主。中药的作用机制有别于大环内酯类抗牛素，而且单味药本身含多种成分并具有多种药理作用，虽不十分清楚，但I临床上已取得良好的疗效，故挖掘我同中医药伟大宝库，探索有
15、效的中药，也是耐药MP肺炎防治工作的当务之急。耐药MP感染的治疗免疫治疗目前研究认为MP肺炎是由于病原体本身及其激发的免疫反应共同所致。对耐药MP感染且具有多种肺外并发症的重症病例，及时、早期、短程应用肾上腺皮质激素是必要的，这对阻止炎性反应的发展、减轻感染中毒症状、预防和控制哮喘及其他并发症等有重要临床价值，可缩短治疗疗程和减少后遗症。其应用指征为：急性期病情严莺的MP感染；肺部病变迁延而出现肺不张、肺间质纤维化、支气管扩张及肺外并发症者。对于有明显免疫功能缺陷、药物性免疫抑制或伴心肺功能障碍者，尤其当MP感染后合并或继发混合感染，造成机体组织损伤较迅速且较严重时，作为补充疗法可应用丙种球蛋白或免疫调节剂进行积极的支持治疗。丙种球蛋白有增强机体自身免疫力、减轻炎性反应的作用。Part 2小结p 经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量p Study Constantly,And You Will Know Everything.The More You Know,The More Powerful You Will Be写在最后谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
