1、Table of Contents 1 基因治疗概述基因治疗概述 2 骨科基因治疗现状骨科基因治疗现状 3 动物实验研究动物实验研究 4 临床研究临床研究 5 基因治疗在骨质疏松性骨折中的运用基因治疗在骨质疏松性骨折中的运用 （重点）（重点）基因治疗概述基因治疗(gene therapy)是将某种形式的核酸转入患者体细胞内以减轻疾病的过程。就是把由一个或几个基因及其调控序列转移(gene transfer)到靶细胞并发挥遗传物质的作用以治疗疾病。目的基因选择载体的选择基因转移方法的选择靶细胞基因位点的选择步骤：步骤：基因治疗概述基因载体 导入基因的大小有限制导入基因的大小有限制 其转基因的效率
2、虽较高其转基因的效率虽较高 有免疫原性运用于人体治疗有免疫原性运用于人体治疗有较大的危险性有较大的危险性病毒病毒 安全性相对高安全性相对高 基因不能长期表达基因不能长期表达非病毒非病毒基因治疗概述基因治疗目的：(1)替代缺损基因；(2)加强常规基因的功能；(3)在DNA或RNA水平阻断致病基因的作用。基因治疗的根本点是使内源细胞产生特殊蛋白其包含4个关键步骤：转导、转录、翻译、表达。骨科基因治疗现状骨科基因治疗是分子生物学在骨科领域的重要应用，是极有前途的一种治疗方法，但目前仅限于实验室阶段，距离临床大量应用尚有一段距离（仅个别疾病开始了局部基因治疗的初期临床研究）。本小组成员阅读大量有关文献
3、，从动物实验研究与临床研究两方面进行简单介绍，重点叙述基因治疗在骨质疏松性骨折中的运用。动物实验研究一、骨愈合的基因治疗目的基因只需在骨诱导早期数天或数周短期表达以启动骨诱导即可。目前促进骨愈合基因治疗的热点集中在BMP-2、7、9 基因在脊柱融合、长骨缺损中的应用。将目的基因导入基质细胞,不仅可以提供目的基因表达产物,自身还可被诱导分化为骨祖细胞以弥补局部骨前体细胞的不足。BMP-2电泳结果经过转导后结果对比二、椎间盘疾病的基因治疗IVD 特有的解剖结构以及低氧、低营养、低pH 值的生理环境更适合活体直接转基因术的应用。（未来方向）三、肌腱和韧带的基因治疗腺病毒作为载体较为适宜。Hart 等
4、将重组了反义核心蛋白聚糖核苷酸的HVJ/脂质体注入兔的内侧副韧带损伤处。实验结果显示基因治疗有助于腱愈合和避免腱粘连动物实验研究四、关节和软骨的基因治疗滑膜覆盖了关节囊的所有内表面,故滑膜内衬细胞是较为理想的靶细胞。Frisbie等将Ad-EqIL-1Ra 注入马的OA 关节内,术后关节评分显著增高,关节滑液渗出减少,关节病变程度减轻。基因转染治疗骨性关节炎基因转染治疗骨性关节炎动物实验研究五、脊髓和周围神经损伤的基因治疗由于髓磷脂的抑制作用、神经胶质瘢痕形成和细胞死亡,脊髓损伤后几乎没有自发性的再生。Ad-NGF、Ad-FGF-2 注入损伤背根的神经胶质中FGF-2 或NGF 的表达诱导了明
5、显的局部轴突生长,温度觉基本恢复正常。临床研究目前骨科基因治疗的临床研究仅限于RA 的基因治疗。在有效性和安全性试验的基础上,1996 年美国开展了第一例基因治疗RA,它不仅是首例基因治疗的骨科疾病,也是首次应用基因治疗非致命性疾病。另有二个临床试验是在关节内转导单纯疱疹病毒携带的胸苷激酶基因,表达产物促使滑膜细胞凋亡,进行“基因滑膜切除术”。基因治疗在骨质疏松性骨折中的运用4040岁人群岁人群骨质疏松症骨质疏松症男性男性 11.15%11.15%女性女性 19.19%19.19%低骨量的患病率低骨量的患病率男性男性 45.18%45.18%女性女性 32.14%32.14%一、骨质疏松性骨折
6、的愈合能力较差一、骨质疏松性骨折的愈合能力较差：老年人缺乏间充质干细胞,且功能低下；来自骨质疏松症患者的细胞比正常细胞合成更少的型胶原纤维。二、促进骨质疏松性骨折愈合的必要性：二、促进骨质疏松性骨折愈合的必要性：将大大降低由于内固定失败和长期制动而产生的并发症的发生率。骨折愈合中的重要基因产物生长因子大多数实验聚焦在转基因表达骨形成蛋白(BMP)的使用上。BMP-2 和BMP-7 cDNA具有克服调节屏障的优势而用于临床,最新研究显示BMP-6 和BMP-9 cDNA 是更有效的成骨性因子转录因子LIM矿化蛋白-1(LMP-1),其在啮齿类动物中,低浓度时促进成骨并能引起脊柱融合。其它细胞因子
7、大多数细胞因子的作用在于增加骨形成,从而促进骨折的早期愈合。实验研究显示:给予IL-1 受体拮抗剂(IL-1RA)或一种可溶形式的TNF-1 受体能引起去卵巢大鼠或小鼠的骨丢失。基因治疗在骨质疏松性骨折中的运用三、基因治疗骨质疏松性骨折的基因治疗正在探索,目前大多数的研究都处在动物实验阶段,但却展示出诱人的前景,主要采取的方式有两种:一种是直接体内基因转移；另一种是先体外后体内的基因转移方式。直接体内基因转移1、直接体内基因转移体内基因转移包括通过转导局部的细胞将基因转移到特定的解剖部位。技术简单,易于临床应用,而且费用较低;其不足之处是靶向转导困难,转导效率较低目前主要有两种体内转移方式:一
8、种是植入掺在胶原海绵(作为基因活化基质)里的质粒DNA;另一种则直接注射病毒载体。直接体内基因转移包含编码PTH1-34 和BMP-4 质粒的基因活化基质技术(GAM)能够修复愈合达5 mm的大鼠股骨缺损。当这一技术用于狗的临界大小胫骨缺损上,含有PTH1-34 cDNA 的GAM获得了6 周的转基因表达。（很有热点）直接体内基因转移重组腺病毒提供了一个可供选择的体内基因转移载体。与体内基因传递相比,腺病毒的一个优势是能够原位感染细胞。但是病毒载体微粒引起的免疫反应,因为这会抑制转基因的表达。直接体内基因转移第一代含编码BMP-2(或BMP-2 前体)的cDNA 的腺病毒载体会通过注射诱导引起
9、异位骨化;但是,在具有免疫活性的大鼠,骨形成会被抑制。而在无胸腺大鼠模型上,通过在缺损部位注射Ad-BMP-2 修复了临界大小的下颌骨缺损。对于这一反应,可以通过注射环磷酰胺引起暂时的免疫抑制从而预防对病毒载体的炎症反应,增加骨形成。直接体内基因转移抗腺病毒载体的免疫反应,限制了其分泌蛋白的生物活性。虽然实验性的暂时免疫抑制有一定作用,但其临床应用变得更加困难。骨内给药效果更好：现在已证实,通过直接体内应用Ad-BMP-2 可以治愈具有免疫活性的大鼠的临界大小的骨缺损。利用修饰基质策略将病毒与胶原基质结合,可以进一步减轻对腺病毒的免疫反应。先体外后体内的基因转移方式在大鼠临界大小骨缺损模型中,
10、Lieberman 的团队应用第一代腺病毒重组体将人BMP-2cDNA 转导入来自骨髓的成骨性间质细胞。这些细胞中可能包含有间充质干细胞。在人巨细胞病毒早期转录子调节下,转录细胞表达高水平的人BMP-2。这些细胞种植在胶原基质和精确植入临界大小骨缺损部位,接受了遗传修饰细胞的部位获得了骨性愈合,而对照组未能愈合。先体外后体内的基因转移方式主要缺点是需要来自患者的自体细胞培养。因此,要是能够使用同种异体细胞,那将可以建立广泛的供体体。干细胞能够被成功地同种异体移植将十分有助于解决这一问题,而对此的努力十分有意义。但是,在大鼠部分缺损模型中,使用同种异体间充质干细胞转导的BMP-2 只有在给于免疫抑制剂FK-506下才能使缺损愈合总结间充质干细胞是一种多能干细胞,但其在骨质疏松症中增殖和分化能力降低。基因工程间充质干细胞在培养中显示出增强的增殖和成骨性分化的能力,这为骨折的基因治疗提供了一个崭新的平台。从骨质疏松患者获得的间充质干细胞通过BMP-2 基因转导使其恢复成骨活性,这一重要发现为将来的骨质疏松性骨折的基因治疗提供了新的可能。
