1、军事医学科学院附属医院军事医学科学院附属医院全军造血干细胞研究所全军造血干细胞研究所军事医学科学院细胞与基因治疗中心军事医学科学院细胞与基因治疗中心陈陈 虎虎 张张 斌斌基因修饰基因修饰DC治疗白血病移治疗白血病移植后复发的临床研究植后复发的临床研究细胞治疗移植复发(二)异基因造血干细胞移植（异基因造血干细胞移植（Allo-HSCTAllo-HSCT）是目前治愈急）是目前治愈急性白血病的主要方法。移植后复发是影响患者存活的性白血病的主要方法。移植后复发是影响患者存活的主要障碍之一。主要障碍之一。移植后复发的治疗手段主要有二次移植和移植后复发的治疗手段主要有二次移植和DLIDLI（供者（供者淋巴
2、细胞输注）、停用免疫抑制剂和应用细胞因子等淋巴细胞输注）、停用免疫抑制剂和应用细胞因子等方式。方式。前前 言言细胞治疗移植复发(二)二次移植风险高，二次移植风险高，25%-50%25%-50%的患者死于感染、急性的患者死于感染、急性GVHDGVHD等治疗相关并发症，且二次移植后复发率亦高达等治疗相关并发症，且二次移植后复发率亦高达40-60%40-60%，两年无病存活仅，两年无病存活仅12%-21%12%-21%。DLIDLI后后GVHDGVHD总发生率为总发生率为60%60%，其中，其中40%40%、度度aGVHDaGVHD，20%20%左右左右、cGVHDcGVHD。迫切需要找到一种新的方
3、法来改迫切需要找到一种新的方法来改善其生存善其生存细胞治疗移植复发(二)免疫治疗的发展，使其逐渐成为白血病患免疫治疗的发展，使其逐渐成为白血病患者造血干细胞移植后复发的治疗手段之一者造血干细胞移植后复发的治疗手段之一。我们中心我们中心应用细胞免疫治疗急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移应用细胞免疫治疗急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移植患者的结果表明植患者的结果表明5 5 年生存率为年生存率为75%,75%,非细胞治疗组非细胞治疗组5 5年生存率为年生存率为45%45%，细胞组在累计生存率上明显优于非细，细胞组在累计生存率上明显优于非细胞治疗组。胞治疗组。细胞治疗移植复发(二)细胞免疫治疗大致分为两类：
4、细胞免疫治疗大致分为两类：一是疫苗治疗，即输注可在体内刺激抗白血病活一是疫苗治疗，即输注可在体内刺激抗白血病活性的细胞，如树突状细胞（性的细胞，如树突状细胞（DCDC）相关肿瘤疫苗等；）相关肿瘤疫苗等；二是过继性细胞免疫治疗，即输注有内在抗白血二是过继性细胞免疫治疗，即输注有内在抗白血病活性的免疫效应细胞，如细胞因子诱导杀伤病活性的免疫效应细胞，如细胞因子诱导杀伤（CIKCIK）细胞、细胞毒性）细胞、细胞毒性T T淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）等。）等。细胞治疗移植复发(二)DC DC：树突状细胞，抗原提呈细胞：树突状细胞，抗原提呈细胞 免疫反应的关键免疫反应的关键“决策细胞决策细胞”增强
5、针对肿瘤抗原免疫反应的理想靶点增强针对肿瘤抗原免疫反应的理想靶点 目前全球已有目前全球已有3 3支支DCDC肿瘤疫苗获标准肿瘤疫苗获标准细胞治疗移植复发(二)DCDC已由实验室走向临床已由实验室走向临床 DCDC临床反应仍有限：成熟度，临床反应，外源性临床反应仍有限：成熟度，临床反应，外源性负载的表位数较少等。负载的表位数较少等。基因修饰基因修饰DCDC：表达肿瘤抗原，增强免疫反应的刺：表达肿瘤抗原，增强免疫反应的刺激因子、细胞因子，下调免疫负调控分子。激因子、细胞因子，下调免疫负调控分子。-未来发展的一个重要方向未来发展的一个重要方向细胞治疗移植复发(二)基因修饰基因修饰DCDC的优势的优势
6、 无无MHCMHC限制性限制性 提供更多的抗原表位提供更多的抗原表位 保证持久的抗原表达保证持久的抗原表达 胞内抗原加工的抗原提呈更有效胞内抗原加工的抗原提呈更有效 表达外源基因的病毒载体能刺激和激活表达外源基因的病毒载体能刺激和激活DCDC 避免正常抗原负载可能存在的自身免疫反应避免正常抗原负载可能存在的自身免疫反应Shurin MR,et al.New York:Springer.2009.细胞治疗移植复发(二)T T细胞激活（细胞激活（3 3种信号）种信号）细胞治疗移植复发(二)基因修饰基因修饰DCDC策略策略 导入编码肿瘤抗原基因或表达抗原的导入编码肿瘤抗原基因或表达抗原的mRNAmR
7、NA 导入编码免疫刺激分子、细胞因子、趋化因子、抗导入编码免疫刺激分子、细胞因子、趋化因子、抗 凋亡分子和其他增强凋亡分子和其他增强DCDC功能因子的基因功能因子的基因Kikuchi T.Tohoku J Exp Med.2006.细胞治疗移植复发(二)修饰方法与靶分子选择修饰方法与靶分子选择Shurin MR,et al.Expert Opin Biol Ther.2010.细胞治疗移植复发(二)细胞治疗移植复发(二)Boudreau JE,et al.Mol Ther.2011.细胞治疗移植复发(二)基因修饰基因修饰DCDC临床结果临床结果细胞治疗移植复发(二)Sipuleucel-TSi
8、puleucel-T（美国，（美国，DendreonDendreon）Sipuleucel-TSipuleucel-T利用利用DCDC负载负载PAPPAP和和GM-CSFGM-CSF的融合蛋白，这提示的融合蛋白，这提示DCDC疫苗联合细胞因子可能改进治疗结果。疫苗联合细胞因子可能改进治疗结果。细胞治疗移植复发(二)AGS-003AGS-003（美国，（美国，Argos TherapeuticsArgos Therapeutics）转移性肾细胞癌转移性肾细胞癌 自体肿瘤来源自体肿瘤来源mRNA+mRNA+合成的合成的CD40L RNACD40L RNA细胞治疗移植复发(二)3 3期试验方案期试验
9、方案细胞治疗移植复发(二)病毒载体系统的优缺点病毒载体系统的优缺点Kikuchi T.Tohoku J Exp Med.2006.细胞治疗移植复发(二)载体对载体对DCDC生物学影响生物学影响Ribas A.Curr Gene Ther.2005.细胞治疗移植复发(二)最近研究发现，最近研究发现，APAAPA分子（分子（antigen presentation antigen presentation attenuatorsattenuators）为抗原呈递细胞内控制信号传导通路的关键）为抗原呈递细胞内控制信号传导通路的关键性抑制因子，阻止了有效的抗自身肿瘤抗原的免疫反应。性抑制因子，阻止了有
10、效的抗自身肿瘤抗原的免疫反应。SOCS1SOCS1（suppressor of cytokine signaling 1suppressor of cytokine signaling 1）是）是APAAPA中最关键性抑制因子之一。因此我们在常规采用细胞因子中最关键性抑制因子之一。因此我们在常规采用细胞因子促进促进DCDC细胞成熟的基础上，加上了针对细胞成熟的基础上，加上了针对APAAPA的小干扰的小干扰RNARNA以以特异性阻断其基因功能；加上特异性的肿瘤相关抗原特异性阻断其基因功能；加上特异性的肿瘤相关抗原（SurvivinSurvivin和和muc1muc1）负载，诱导的）负载，诱导的D
11、CDC细胞与细胞与T T细胞具有成熟细胞具有成熟度更高、功能与特异性更强的显著优点。度更高、功能与特异性更强的显著优点。细胞治疗移植复发(二)提高提高DCDC抗原呈递能力及肿瘤特异性抗原呈递能力及肿瘤特异性CTLCTL效应效应SOCS1SurvivinMuc1Flagellin中试放大中试放大急毒试验急毒试验安全性评价试验安全性评价试验人体细胞试验人体细胞试验Ad5细胞治疗移植复发(二)细胞免疫治疗的优点细胞免疫治疗的优点 体外活化、扩增和修饰免疫细胞可选择性的控制体外活化、扩增和修饰免疫细胞可选择性的控制其其GVLGVL；增殖速度快、杀伤活性高、副作用小等优点；增殖速度快、杀伤活性高、副作用
12、小等优点；体外培养绕过了体内免疫系统中复杂的负调控系体外培养绕过了体内免疫系统中复杂的负调控系统的影响，活性更强；统的影响，活性更强；输注免疫细胞可避免由于应用大剂量的某些细胞输注免疫细胞可避免由于应用大剂量的某些细胞因子引起的毒副反应。因子引起的毒副反应。细胞治疗移植复发(二)面面 临临 的的 问问 题题 为使制备的免疫细胞具有更好的为使制备的免疫细胞具有更好的GVLGVL效应，体外扩效应，体外扩增技术尚需进一步研究和完善；增技术尚需进一步研究和完善；治疗方法尚不完善治疗方法尚不完善,对于治疗时机、剂量、疗程、对于治疗时机、剂量、疗程、给药方法、挑选合适的佐剂及如何克服肿瘤免疫给药方法、挑选
13、合适的佐剂及如何克服肿瘤免疫逃逸等方面均有许多尚待解决和完善的问题；逃逸等方面均有许多尚待解决和完善的问题；针对白血病的免疫机制及细胞回输后在体内的作针对白血病的免疫机制及细胞回输后在体内的作用机制尚未完全阐明，一些细胞免疫治疗的疗效用机制尚未完全阐明，一些细胞免疫治疗的疗效还存在争议。还存在争议。细胞治疗移植复发(二)细胞免疫治疗的不良反应细胞免疫治疗的不良反应 免疫细胞是诱导、激活的自体细胞，这种免疫细胞是诱导、激活的自体细胞，这种治疗相当安全，有部分病例在细胞回输后治疗相当安全，有部分病例在细胞回输后2-102-10个小时内出现体温升高（个小时内出现体温升高（37.237.24040），
14、一），一般持续时间般持续时间2 26 6小时，可自行缓解，极少数高小时，可自行缓解，极少数高热病人使用解热药就可以完全缓解。热病人使用解热药就可以完全缓解。细胞治疗移植复发(二)研究方法及步骤研究方法及步骤 病人的选择：急性白血病异基因移植后复发（包括病人的选择：急性白血病异基因移植后复发（包括形态学复发、分子学复发和细胞遗传学复发）的患形态学复发、分子学复发和细胞遗传学复发）的患者。签署治疗知情同意书者。签署治疗知情同意书DC-CIKDC-CIK体外培养体外培养治疗方法治疗方法：4 4次次DCDC，2 2次次CIKCIK。观测指标：临床疗效、观测指标：临床疗效、治疗前后免疫功能变化治疗前后免
15、疫功能变化、治疗前后细胞因子的变化治疗前后细胞因子的变化。细胞治疗移植复发(二)采集供者或患采集供者或患者抗凝全血者抗凝全血50-60ml培养培养DC和和CIK细细 胞胞 回回 输输d7 d9 d11 d13DC DC DC DC CIK CIK治治 疗疗 方方 法法细胞治疗移植复发(二)细胞治疗移植复发(二)急性白血病异基因移植后复发急性白血病异基因移植后复发1717例，其中分子学例，其中分子学复发复发9 9例，骨髓复发例，骨髓复发7 7例，中枢神经系统白血病复例，中枢神经系统白血病复发发1 1例；例；细胞免疫治疗异基因移植后复发的完全缓解率为细胞免疫治疗异基因移植后复发的完全缓解率为82%
16、,GVHD82%,GVHD发生率为发生率为65%65%，均为，均为度以下度以下GVHDGVHD。临临 床床 资资 料料细胞治疗移植复发(二)细胞免疫治疗急性白血病移植后复发细胞免疫治疗急性白血病移植后复发病例病例性别性别/年龄年龄诊断诊断供者供者CIKCIK前治疗前治疗GVHDGVHD临床情况临床情况细胞治疗后细胞治疗后生存时间生存时间存活情况存活情况治疗前治疗前治疗后治疗后1 1F/35F/35AMLAML同胞同胞NONONONO分子学复发分子学复发CRCR14M14M29M29M2 2M/21M/21AMLAML无关无关格列卫格列卫 cGVHD cGVHD分子学复发分子学复发CRCR22M
17、22M31M 31M 3 3M/31M/31AMLAML无关无关NoNoGVHDGVHD分子学复发分子学复发CRCR17M17M21M21M4 4F/19F/19ALLALL单倍体单倍体NoNoGVHDGVHD分子学复发分子学复发CRCR10M10M27M27M5 5M/17M/17AML AML 无关无关NoNoNoNo分子学复发分子学复发CRCR15M15M32M32M6 6F/28F/28AMLAML无关无关NoNoGVHDGVHD分子学复发分子学复发CR-RLCR-RL3M3M死亡死亡7 7F/55F/55AMLAML同胞同胞DSIDSI肠道肠道GVHD GVHD 分子学复发分子学复发
18、复发复发6M6M死亡死亡8 8M/61M/61AMLAML同胞同胞NoNoGVHDGVHD分子学复发分子学复发CRCR5M5M死亡死亡 9 9M/8M/8AMLAML无关无关+单倍体单倍体NoNoGVHDGVHD分子学复发分子学复发CRCR14M14M34M34M1010F/34F/34MDS-AMLMDS-AML同胞同胞手术手术+放疗放疗+化疗化疗 NONO髓外复发髓外复发CRCR26M26M73M73M1111M/25M/25ALLALL无关无关化疗化疗NONO复发后复发后CRCRCRCR40M40M64M64M1212F/38F/38AMLAML同胞同胞手术手术+放疗放疗+化疗化疗 GV
19、HDGVHD复发后复发后CRCRCRCR31M31M129M129M1313M/38M/38ALLALL无关无关化疗化疗NONO复发后复发后CRCRCRCR8M8M26M26M1414F/15F/15AMLAML单倍体单倍体化疗化疗GVHDGVHD复发后复发后PRPR未缓解未缓解3M3M死亡死亡1515M/22M/22ALLALL单倍体单倍体化疗化疗GVHDGVHD复发后复发后NRNRCR-RLCR-RL4M4M死亡死亡1616M/30M/30AMLAML同胞同胞鞘注鞘注NONOCNLCNLNRNR17M17M35M35M1717F/35F/35 M3-CR3 M3-CR3同胞同胞砷剂砷剂cG
20、VHDcGVHD复发复发CRCR13M13M59M59MDSI 供者外周血造血干细胞输注供者外周血造血干细胞输注CR-RL CR后后3个月骨髓复发个月骨髓复发 病例病例9为第一次无关供者移植后为第一次无关供者移植后2月复发，化疗后未缓解，给予第二次单倍体移植后月复发，化疗后未缓解，给予第二次单倍体移植后9月分子学复发月分子学复发病例病例12为移植后为移植后5年髓外复发，给予手术和局部放疗，年髓外复发，给予手术和局部放疗，3个月后骨髓复发个月后骨髓复发细胞治疗移植复发(二)病例资料病例资料患者，女性，患者，女性，4949岁岁 2001.6 2001.6 诊断为急性髓性白血病诊断为急性髓性白血病M
21、2M2 DA DA方案化疗方案化疗1 1疗程后获疗程后获CRCR，巩固化疗，巩固化疗1 1疗程疗程 2001.9 HLA2001.9 HLA相合同胞外周血干细胞移植相合同胞外周血干细胞移植 2009.6 2009.6 胸壁髓外复发胸壁髓外复发 手术切除手术切除+放疗放疗+细胞免疫治疗细胞免疫治疗 2010.3 2010.3 髓外髓外+骨髓复发，骨髓复发，blast 87.5%blast 87.5%MA MA方案化疗方案化疗1 1疗程获疗程获CRCR 此后予细胞免疫治疗此后予细胞免疫治疗5 5次，持续次，持续CRCR状态状态 2012.5 2012.5 复查提示分子学复发，复查提示分子学复发，T
22、ATA方案化疗方案化疗+细胞免疫治疗，细胞免疫治疗，再次达再次达CRCR。细胞治疗移植复发(二)细胞免疫治疗前后残留变化细胞免疫治疗前后残留变化 DC+CIK TA方案化疗细胞治疗移植复发(二)00.050.10.150.20.250.30.350.40.45患者细胞免疫治疗前后残留变化患者细胞免疫治疗前后残留变化无关供者移植移植后+10月自体细胞免疫治疗+11月+15月+13月细胞治疗移植复发(二)细胞免疫治疗联合化疗治疗粒细胞肉瘤一例细胞免疫治疗联合化疗治疗粒细胞肉瘤一例 孙某，男性，孙某，男性，4343岁；岁；2011 2011年年9 9月以左颈部皮肤肿块起病，活检后病理经江苏省人民医月
23、以左颈部皮肤肿块起病，活检后病理经江苏省人民医院、江苏省肿瘤医院、北京大学病理科会诊，诊断为髓系肉瘤；院、江苏省肿瘤医院、北京大学病理科会诊，诊断为髓系肉瘤；先后接受先后接受DADA、MAMA（2 2疗程）、疗程）、FLAGFLAG（2 2疗程）方案共疗程）方案共5 5疗程化疗，疗程化疗，初始化疗效果可，随后化疗效果不佳，化疗后皮肤肿块不消失；初始化疗效果可，随后化疗效果不佳，化疗后皮肤肿块不消失；细胞治疗移植复发(二)2012 2012年年5 5月月2828日就诊我科；日就诊我科；5 5月月3030日开始给予日开始给予TA+VM-26TA+VM-26方案化疗，化疗后输方案化疗，化疗后输注注D
24、C+CIKDC+CIK细胞；细胞；7 7月月2020日开始给予日开始给予TA+VM-26TA+VM-26方案化疗，化疗后输方案化疗，化疗后输注注DC+CIKDC+CIK细胞；细胞；治疗过程中骨髓始终未受累。治疗过程中骨髓始终未受累。细胞治疗移植复发(二)5月月30日日6月月15日日7月月16日日8月月21日日化化 疗疗化化 疗疗细胞治疗移植复发(二)5月月30日日6月月15日日7月月16日日8月月21日日细胞治疗移植复发(二)AMLAML自体移植联合自体移植联合 DC-CIKDC-CIK治疗流程治疗流程急性髓性白血病（中低危，急性髓性白血病（中低危，M3M3除外）（留标本）除外）（留标本）诱导
25、化疗诱导化疗完全缓解（无完全缓解（无HLAHLA相合供者）相合供者）巩固强化巩固强化3-43-4个疗程个疗程自体移植自体移植 血象恢复（血象恢复（4 4周后）周后）DC-CIKDC-CIK细胞治疗细胞治疗细胞治疗移植复发(二)急非淋自体骨髓移植后免疫治疗结果（急非淋自体骨髓移植后免疫治疗结果（P=0.037)细胞治疗移植复发(二)细胞免疫治疗前后血清中细胞因子的对比细胞免疫治疗前后血清中细胞因子的对比 IFN-rIFN-r（pg/mlpg/ml）TNF-aTNF-a（pg/mlpg/ml）IL-10IL-10（pg/mlpg/ml）IL-6IL-6（pg/mlpg/ml）IL-4IL-4（pg
26、/mlpg/ml）IL-2IL-2（pg/mlpg/ml）治疗前治疗前7.087.082.552.554.204.203.273.273.803.800.0.78787 7.53534.104.107.727.723.243.246.256.250.600.60治疗后治疗后88.6288.62196.50196.5066.1266.12155.58155.5826.3626.3655.0455.0426.5826.5832.0132.0149.7549.7599.7099.7042.8742.8787.7187.71P P 值值0.0.48480.0.89890.0.12120.0.04040
27、.0.16160 0.0505细胞治疗移植复发(二)细胞治疗前后淋巴细胞亚群的对比细胞治疗前后淋巴细胞亚群的对比 CD3+CDCD3+CD4+CD8-4+CD8-（）CD3+CDCD3+CD4-CD8+4-CD8+（）CD3+CDCD3+CD19-19-（）CD3-CD3-CD19+CD19+（）CD3-CD3-CD56+CD56+（）CD3+CCD3+CD56+D56+（）CD3+HLCD3+HLA-DR-A-DR-（）CD3+HLCD3+HLA-DR+A-DR+（）CD3+CD2CD3+CD28+CD8+8+CD8+（）CD3+CD4CD3+CD4+CD25+CD25+（）治疗前治疗前25
28、25.3 31212.1 14141.9 91515.7 76 69 9.7 79 9.9 91414.6 69 9.4 49 9.6 64 4.8 84.4.6 63 3.4 45 59 9.8 81 12 2.7 78 8.4 46.6.7 71 11 1.5 53 3.7 70 0.7 70 0.4 4治疗后治疗后2727.4 41313.8 842.942.9.0.01616.3 37373.4 47 7.5 51 12 2.3 36 6.3 39.69.64 4.5 57.17.16 6.1 16161.3 31212.2 21 10 0.1 18 8.4 41 11 1.7 75
29、5.3 30 0.9 90.0.8 8P P 值值0.0.74744 40.90.902020.0.4134130.0.59590.0.9 90.3320.3320.0.8128120.60.663630.90.95 52 20.0.41413 3细胞治疗移植复发(二)细胞治疗前后细胞治疗前后Th1Th1、Th2Th2变化情况对比变化情况对比 Th1Th1Th2Th2治疗前治疗前3 3.1 14 4.0 00 0.5 50 0.4 4治疗后治疗后1010.8 89 9.1 11.41.41 1.5 5P P 值值0.0.0470470.0.116116细胞治疗移植复发(二)细胞治疗移植复发(二)
