1、改变花色的转基因矮牵牛花改变花色的转基因矮牵牛花转入荧光素酶蛋白基转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草因的发荧光烟草蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想基因工程已将它变为现实基因工程已将它变为现实转转 基基 因因 西西 红红 柿柿 由于细菌个体微小、遗传物质较为由于细菌个体微小、遗传物质较为简单，易于人工培养，繁殖速度快，突简单，易于人工培养，繁殖速度快，突变型容易识别和检出。因此，细菌一直变型容易识别和检出。因此，细菌一直被用做研究生物遗传与变异规律的实验被用做研究生物遗传与变异规律的实验材料。材料。利用人工诱变或杂交选育医药或食利用人工诱变或杂交选育医药或食品工业中所需要的
2、高产菌株。品工业中所需要的高产菌株。利用分子生物学技术，构建利用分子生物学技术，构建“基因基因工程菌工程菌”，生产新药、疫苗、食品添加，生产新药、疫苗、食品添加剂，或者用于环保等。剂，或者用于环保等。一、一、细菌遗传的物质基础细菌遗传的物质基础二、细菌的基因二、细菌的基因小胸泳衣小胸泳衣突变突变三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组四、微生物基因组学四、微生物基因组学五、基因工程菌株的构建五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异细菌的遗传与变异 细菌染色体是一个裸露的闭合环状细菌染色体是一个裸露的闭合环状的双链的双链DNA分子，有核蛋白，缺乏组蛋分子，有核蛋白，缺乏组蛋白，无核膜包裹。
3、白，无核膜包裹。细菌基因组结构的主要特征：细菌基因组结构的主要特征：（1）遗传信息是连续的，不含内含）遗传信息是连续的，不含内含子。很少有重复序列。子。很少有重复序列。（2）通常，编码相关功能的基因高）通常，编码相关功能的基因高度集中，组成操纵子度集中，组成操纵子（operon）结构，自结构，自一个启动子开始转录成多基因的一个启动子开始转录成多基因的mRNA分子，翻译成多种功能相关的蛋白质。分子，翻译成多种功能相关的蛋白质。（plasmid）是细菌染色体外的遗传物质，大多由是细菌染色体外的遗传物质，大多由闭合环状双链闭合环状双链DNA组成。组成。具有自我复制的能力。具有自我复制的能力。所携带的
4、基因赋予宿主菌某些生物学所携带的基因赋予宿主菌某些生物学 性状性状（如（如F质粒、质粒、R质粒、毒力质粒、质粒、毒力质粒、代谢质粒）代谢质粒），增加，增加小胸泳衣小胸泳衣细菌的存细菌的存活机会。活机会。非生存所必需，可自行丢失或消除。非生存所必需，可自行丢失或消除。可在细菌之间转移。可在细菌之间转移。质粒质粒DNA的特征的特征v1)1)致育质粒（致育质粒（F F质粒）质粒）与有性生殖功能关联；与有性生殖功能关联；v2)2)耐药性质粒耐药性质粒 编码细菌对抗菌药物或重金属盐编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。分两类，一是类的耐药性。分两类，一是接合性接合性耐药质粒（耐药质粒（R R质质粒），
5、另一是非接合耐药性质粒；粒），另一是非接合耐药性质粒；v3)3)毒力质粒（毒力质粒（ViVi质粒）质粒）http:/ 编码与该菌致病性有关编码与该菌致病性有关的毒力因子；的毒力因子；v4)4)细菌素质粒细菌素质粒 编码细菌产生细菌素；编码细菌产生细菌素；v5)5)代谢质粒代谢质粒 编码产生相关的代谢酶。编码产生相关的代谢酶。（transposon）是一个是一个DNA片段（片段（2kb），可在质），可在质粒与质粒之间或质粒与染色体之间随机转粒与质粒之间或质粒与染色体之间随机转移，故又称为移，故又称为“跳跃基因跳跃基因”。转座子不能自我复制。转座子不能自我复制。转座子转座子质粒质粒转座子的结构特点
6、转座子的结构特点 能为整合能为整合酶所识别，与插入功能有关。酶所识别，与插入功能有关。带有遗传信息，如常带有遗传信息，如常带有耐药基因、细菌毒素基因、整合酶带有耐药基因、细菌毒素基因、整合酶（或转座酶）基因。（或转座酶）基因。当转座子插入到某一基因组中，可当转座子插入到某一基因组中，可能会产生什么遗传学效应？能会产生什么遗传学效应？可引起插入基因失活，可引起插入基因失活，产生基因突变。产生基因突变。在插入部位又出现一个在插入部位又出现一个或多个耐药基因，使细菌或多个耐药基因，使细菌产生耐药性或多重耐药性。产生耐药性或多重耐药性。（bacteriophage）噬菌体噬菌体是感染细菌、是感染细菌、
7、真菌、放线菌或螺旋真菌、放线菌或螺旋体等微生物的体等微生物的病毒。病毒。转座子转座子质粒质粒一、细菌遗传的物质基础一、细菌遗传的物质基础三、细菌的基因转移三、细菌的基因转移小胸泳衣小胸泳衣与重组与重组四、微生物基因组学四、微生物基因组学五、基因工程菌株的构建五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异细菌的遗传与变异（gene mutation）：）：细菌染色细菌染色体基因发生突然而稳定的结构改变，包括体基因发生突然而稳定的结构改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换（或置换（点突变：点突变：point mutation），），导致细菌性状的遗传性变异。导致细菌性
8、状的遗传性变异。随机发生，不定向随机发生，不定向 稳定稳定 自发突变产生频率为自发突变产生频率为10-1010-6 可诱发性：可诱发性：野生株、突变株野生株、突变株 耐药性突变：耐药性突变：选择标记选择标记 毒力突变：毒力突变：疫苗研制、新现传染病疫苗研制、新现传染病 营养缺陷体突变：营养缺陷体突变：新药诱变作用检测新药诱变作用检测 高产突变：高产突变：抗生素等药品、食品生产抗生素等药品、食品生产 抗原性突变：抗原性突变：逃逸免疫机制逃逸免疫机制 日本发生过一次细菌性痢疾大流行。日本发生过一次细菌性痢疾大流行。从病人粪便中分离到从病人粪便中分离到痢疾杆菌敏感痢疾杆菌敏感株和耐药株（同时耐链霉素
9、、氯霉素、四株和耐药株（同时耐链霉素、氯霉素、四环素、磺胺类），且环素、磺胺类），且有完全相同的多重耐药性。多重耐药性传有完全相同的多重耐药性。多重耐药性传播迅速。耐药菌在传代、保藏过程中可播迅速。耐药菌在传代、保藏过程中可耐药性。耐药性。能否用基因突变解释以上现象？能否用基因突变解释以上现象？二、细菌的基因突变二、细菌的基因突变四、微生物基因组学四、微生物基因组学五、基因工程菌株的构建五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异细菌的遗传与变异 供体菌供体菌（donor）将遗传物质转移至受将遗传物质转移至受体菌体菌（recipient），使后者获得新的生物学，使后者获得新的生物学性状，称为基因转移
10、性状，称为基因转移（gene transfer）。细菌通过水平方向的基因转移和重组，细菌通过水平方向的基因转移和重组，产生新的基因型个体，以适应随时改变的产生新的基因型个体，以适应随时改变的环境环境。基因转移的概念基因转移的概念 质粒质粒（plasmid）转座子转座子（transposon）温和噬菌体温和噬菌体（temperate phage）基因转移的元件基因转移的元件 接合（接合（conjugation）转化转化（transformation）转导转导（transduction）转座转座（transposition）基因转移的方式基因转移的方式1、接合、接合（conjugation）接合：
11、接合：供体菌通过性菌毛与受体菌供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，并将遗传物质直接接触，并将遗传物质（主要是质粒（主要是质粒DNA）转移给受体菌，转移给受体菌，http:/使受体菌获得新使受体菌获得新的遗传性状。的遗传性状。质粒质粒质粒接合转移示意图质粒接合转移示意图染色体染色体性菌毛性菌毛受体菌受体菌供体菌供体菌赋予宿主菌赋予宿主菌的耐药性的耐药性 编码性菌毛，编码性菌毛，决定自主复制决定自主复制与接合转移与接合转移 R质粒主要以质粒主要以接合方式接合方式从耐药菌传递从耐药菌传递给敏感菌，使后者变为耐药菌。给敏感菌，使后者变为耐药菌。R质粒在同一种属或不同种属细菌之质粒在同一种属或不同种属细菌
12、之间传递，造成耐药性的广泛传播，尤其在间传递，造成耐药性的广泛传播，尤其在肠道杆菌肠道杆菌中比较普遍，给临床治疗带来很中比较普遍，给临床治疗带来很大困难大困难。日本发生过一次细菌性痢疾大流行。日本发生过一次细菌性痢疾大流行。从病人粪便中分离到从病人粪便中分离到痢疾杆菌敏感痢疾杆菌敏感株和耐药株（同时耐链霉素、氯霉素、四株和耐药株（同时耐链霉素、氯霉素、四环素、磺胺类），且环素、磺胺类），且有完全相同的多重耐药性。多重耐药性传有完全相同的多重耐药性。多重耐药性传播迅速。耐药菌在传代、保藏过程中可播迅速。耐药菌在传代、保藏过程中可耐药性。耐药性。能否用基因突变解释以上现象？能否用基因突变解释以上现
13、象？F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组F+F+Hfr三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组FFFFFF-FF-三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组雄性菌株雄性菌株 Hfr菌株菌株 F 菌株菌株 菌株菌株 （雌株）（雌株）因子和接合因子和接合 F+菌株菌株三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组FF+F+F+F+FFF+FHfrHfrF（多数情况下）F+HfrHfrHfr（少数情况下）雄性菌株与雌性菌株接合
14、结果三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组Griffith肺炎链球菌感肺炎链球菌感染小鼠实验（染小鼠实验（1928）无荚膜活菌无荚膜活菌有荚膜活菌有荚膜活菌有荚膜死菌有荚膜死菌有荚膜的活菌？有荚膜的活菌？活的无荚膜肺炎链球菌从死的有荚膜活的无荚膜肺炎链球菌从死的有荚膜肺炎链球菌中获得荚膜肺炎链球菌中获得荚膜（毒力决定因子）（毒力决定因子）编码基因，称之为转化编码基因，称之为转化（transformation）。引起转化现象的物质称为转化因子。引起转化现象的物质称为转化因子。Avery研究揭示，转化因子的本质是研究揭示，转化因子的本质是DNA，即遗传物质是，即遗传物质是DNA。1944
15、年，获年，获得诺贝尔医学生理学奖。得诺贝尔医学生理学奖。2、转化、转化（transformation）转化：转化：受体菌从周围环境中直接摄取受体菌从周围环境中直接摄取供体菌游离的供体菌游离的DNA片段，并整合入受体菌片段，并整合入受体菌基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的过程。的过程。（1）转化的前提条件）转化的前提条件 1020 个基因个基因同源性高的、未变同源性高的、未变 性的双链性的双链DNA；质粒质粒DNA。处于处于“感受态感受态”（2）自然转化过程）自然转化过程1 1、受体菌处于感受态、受体菌处于感受态(competence)(competenc
16、e)CaCa2 2诱导法、电穿孔法诱导法、电穿孔法 受体细胞经过一些特殊方法处理后受体细胞经过一些特殊方法处理后,细细胞膜的通透性发生了暂时性的改变胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能成为能允许外源允许外源DNADNA分子进入的感受态细胞。分子进入的感受态细胞。转化因子的结合与进入转化因子的结合与进入 双链双链DNA与感受态受体菌表面的与感受态受体菌表面的DNA结合受体结合。其中一条链被降解产生能结合受体结合。其中一条链被降解产生能量；另一条链与特异量；另一条链与特异DNA结合蛋白形成复结合蛋白形成复合物，进入菌体内。合物，进入菌体内。转化因子的整合转化因子的整合 单链单链DNA不经复制，与
17、受体菌同源不经复制，与受体菌同源DNA区段的单链配对，被取代的受体菌区段的单链配对，被取代的受体菌DNA单链被降解，最终单链被降解，最终产生转化子。产生转化子。有荚膜的活菌？有荚膜的活菌？3、转导、转导（transduction）以以温和噬菌体温和噬菌体为媒介，将供体菌为媒介，将供体菌DNA片段片段（染色体（染色体DNA、非接合性质粒、非接合性质粒DNA）转移到受体菌内，通转移到受体菌内，通过基因重组而使受体过基因重组而使受体菌获得新的遗传性状。菌获得新的遗传性状。（1）转导的概念）转导的概念 是感染细菌、放线菌、真菌等的病毒。是感染细菌、放线菌、真菌等的病毒。分为头部和尾部。头部由核心（核酸
18、）分为头部和尾部。头部由核心（核酸）和衣壳（蛋白质）构成。和衣壳（蛋白质）构成。能通过细菌滤器。能通过细菌滤器。须寄生在活的易感宿主须寄生在活的易感宿主 菌体内。菌体内。（2）噬菌体）噬菌体（phage）（3）温和噬菌体）温和噬菌体 烈（毒）性噬菌体烈（毒）性噬菌体（virulent phage）：噬菌体在宿主菌体内复制增殖，产生大量噬菌体在宿主菌体内复制增殖，产生大量子代噬菌体，并最子代噬菌体，并最终裂解细菌，建立终裂解细菌，建立溶菌周期。溶菌周期。温和噬菌体温和噬菌体（temperate phage）：感：感染宿主菌后，不立即增殖，而是将其核染宿主菌后，不立即增殖，而是将其核酸整合到宿主菌
19、染色体基因组中，与宿酸整合到宿主菌染色体基因组中，与宿主菌主菌DNA一起复制，一起复制，并随细菌的分裂而传并随细菌的分裂而传至子代细菌。至子代细菌。前噬菌体前噬菌体溶原性细菌溶原性细菌 有些温和噬菌体可使溶原性细菌的有些温和噬菌体可使溶原性细菌的表型发生相应改变，称之为溶原性转换表型发生相应改变，称之为溶原性转换（lysogenic conversion）。）。例如，白喉棒状例如，白喉棒状杆菌若携带杆菌若携带噬菌体时，可产生白喉毒素。噬菌体时，可产生白喉毒素。溶原性细菌能正常以二分裂方式繁溶原性细菌能正常以二分裂方式繁殖，前噬菌体也一代一代传下去。但有殖，前噬菌体也一代一代传下去。但有时也会自
20、发终止（发生时也会自发终止（发生率率10-5），从染色体上），从染色体上脱落，进入溶菌周期。脱落，进入溶菌周期。（4）转导的机制）转导的机制 前噬菌体从染色体前噬菌体从染色体上脱离进行增殖，装配上脱离进行增殖，装配成新的子代噬菌体。大成新的子代噬菌体。大约在约在105107次装配中次装配中发生一次错误，误将大发生一次错误，误将大小合适的供体菌小合适的供体菌DNA片段装入噬菌体头部，片段装入噬菌体头部，成为成为“假噬菌体假噬菌体”。假噬菌体假噬菌体供体菌供体菌 当当“假噬菌体假噬菌体”（转导噬菌体）（转导噬菌体）再再度感染受体菌时，度感染受体菌时，将供体菌将供体菌DNA带入带入受体菌内。受体菌内
21、。完全转导与流产转导完全转导与流产转导普遍性转导、局限性转导普遍性转导、局限性转导假噬菌体假噬菌体受体菌受体菌供体菌供体菌DNA（transposition）转座子在质粒之间或质粒与染色体转座子在质粒之间或质粒与染色体之间的自行转移现象，称之为转座之间的自行转移现象，称之为转座。转座子能在转座子能在2个没有任何同源性的基个没有任何同源性的基因组之间转座（即插入到某一基因），并因组之间转座（即插入到某一基因），并能引起一系列遗传效应。能引起一系列遗传效应。可引起插入基因失活，产生基因突变。可引起插入基因失活，产生基因突变。在插入部位引入一个或多个新的基因在插入部位引入一个或多个新的基因 （如耐药
22、基因、毒素基因。（如耐药基因、毒素基因。转座子的自行转移不需要核苷酸碱转座子的自行转移不需要核苷酸碱基对同源才能插入，可在革兰阴性菌和基对同源才能插入，可在革兰阴性菌和革兰阳性菌之间转移。革兰阳性菌之间转移。二、细菌的基因突变二、细菌的基因突变三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组五、基因工程菌株的构建五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异细菌的遗传与变异 微生物基因组学微生物基因组学（Genomics）是利用是利用全基因组全基因组DNA序列研究微生物基因及其序列研究微生物基因及其功能的学科。功能的学科。细菌是研究和分析基因组序列与相细菌是研究和分析基因组序列与相关生物学功能关系的理
23、想模式。关生物学功能关系的理想模式。首先，用超声波将细菌染色体首先，用超声波将细菌染色体DNA随机切割成一定大小的随机切割成一定大小的DNA片段，插入片段，插入到测序载体（质粒）中，以构建到测序载体（质粒）中，以构建DNA文文库，库，进行大规模的测序，进行大规模的测序，对对DNA序列加序列加以拼接。以拼接。1、核苷酸序列测定、核苷酸序列测定 经过计算机分析，完成全基因组各经过计算机分析，完成全基因组各个区域的编号和注释，最后存入数据库，个区域的编号和注释，最后存入数据库，并在互联网上发表，以供全世界的科学并在互联网上发表，以供全世界的科学家参考和使用。家参考和使用。细菌全基因组序列测定完成后，
24、更细菌全基因组序列测定完成后，更重要的任务是鉴定基因及尽可能确定基重要的任务是鉴定基因及尽可能确定基因的功能，称之为因的功能，称之为后基因组学后基因组学。2、微生物基因组结构与功能研究、微生物基因组结构与功能研究 根据病原菌全基因组序列，应用现根据病原菌全基因组序列，应用现代生物信息软件对基因序列进行分析，代生物信息软件对基因序列进行分析，可确定哪些基因与毒力、体内定居或体可确定哪些基因与毒力、体内定居或体内持续感染有关，从而阐明病原菌致病内持续感染有关，从而阐明病原菌致病基因及其产物。基因及其产物。（1）揭示病原微生物的致病机制）揭示病原微生物的致病机制 从分子和细胞水平上，揭示微生物从分子
25、和细胞水平上，揭示微生物与宿主之间的相互作用，更深入地阐明与宿主之间的相互作用，更深入地阐明病原微生物的致病机制，诸如毒素作用病原微生物的致病机制，诸如毒素作用机制、宿主细胞中微生物的受体，侵入机制、宿主细胞中微生物的受体，侵入细胞内微生物的定位和新表位的发现，细胞内微生物的定位和新表位的发现，对宿主免疫系统的反应等。对宿主免疫系统的反应等。（2）建立灵敏特异的基因诊断技术）建立灵敏特异的基因诊断技术 传统的病原体诊断依赖于致病微生物传统的病原体诊断依赖于致病微生物的形态、培养和生化特征。的形态、培养和生化特征。通过测定多种致病与非致病微生物的通过测定多种致病与非致病微生物的基因组序列，可以获
26、得大量的基因信息。基因组序列，可以获得大量的基因信息。如特异如特异DNA序列用于诊断，菌株特异性序列用于诊断，菌株特异性基因用于分型。基因用于分型。图图2 2 引物特异性单重引物特异性单重PCRPCR电泳结果电泳结果m 100bp Marker，1 CMCC51252,2 CMCC51572,3 CMCC51592,4 GIM-Shi1,5 GIM-Shi2,6 ATCC9027,7 ATCC15442,8 CMCC10104,9 GIM-Ps,10 ATCC43889,11 GDCIQ-O157-1,12 GDCIQ-O157-2,13 CMCC50093,14 CMCC50071,15 C
27、MCC50115,16 CMCC47001,17 GIM-Vp,18 GDCIQ-Vp（3）开发新型抗菌药物）开发新型抗菌药物 病原菌全基因组序列的测定，一方病原菌全基因组序列的测定，一方面，能揭示细菌耐药的确切机制，对现面，能揭示细菌耐药的确切机制，对现有抗菌药物进行改造或开发新型药物。有抗菌药物进行改造或开发新型药物。另一方面，可使另一方面，可使药物的研发策略从药物的研发策略从筛选化合物库转向优先筛选靶位基因筛选化合物库转向优先筛选靶位基因，即以病原菌为目标，找出在人类基因组即以病原菌为目标，找出在人类基因组中缺失，对耐药菌生存必不可少并在感中缺失，对耐药菌生存必不可少并在感染过程中优先表
28、达的基因；选择这些基染过程中优先表达的基因；选择这些基因作为抗菌药物的靶位点，可设计出具因作为抗菌药物的靶位点，可设计出具有针对性很强的药物有针对性很强的药物（窄谱抗生素）（窄谱抗生素）。病原菌全基因组序列的测定，还可大病原菌全基因组序列的测定，还可大大加速新疫苗的研制。大加速新疫苗的研制。（4）开发新型疫苗）开发新型疫苗 通过生物信息学软件，对全基因组序通过生物信息学软件，对全基因组序列进行分析，可预测出病原体的具有很高列进行分析，可预测出病原体的具有很高免疫原性的保护性抗原及其表位。免疫原性的保护性抗原及其表位。将抗原或表位编码基因在合适的载体将抗原或表位编码基因在合适的载体系统中表达，分
29、离纯化目的抗原或表位。系统中表达，分离纯化目的抗原或表位。最后，检测抗原的安全性和有效性。最后，检测抗原的安全性和有效性。随着微生物基因组被解码和微生物随着微生物基因组被解码和微生物功能基因组的研究与开发，微生物学正功能基因组的研究与开发，微生物学正面临着面临着革命性的飞跃革命性的飞跃。微生物基因组研。微生物基因组研究所获得的信息将迅速转化为生产力，究所获得的信息将迅速转化为生产力，微生物感染性疾病的诊、防、治，将会微生物感染性疾病的诊、防、治，将会彻底得到改观。彻底得到改观。二、细菌的基因突变二、细菌的基因突变三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组四、微生物基因组学四、微生物基因组
30、学细菌的遗传与变异细菌的遗传与变异目的基因目的基因重组质粒重组质粒转化转化目的蛋白目的蛋白重组重组DNA技术技术基因工程菌基因工程菌 质粒作为一种独立的复制子，容易从质粒作为一种独立的复制子，容易从细胞中分离出来、在体外进行遗传操作和细胞中分离出来、在体外进行遗传操作和转入到合适的受体细胞中，表达外源目的转入到合适的受体细胞中，表达外源目的基因。基因。自主复制，自主复制，可表达外源基因可表达外源基因 限制性酶切位点限制性酶切位点 选择性标记（耐药性）选择性标记（耐药性）质粒可作为表达载体，首先在体外构质粒可作为表达载体，首先在体外构建重组质粒（携带目的基因）；再转入原建重组质粒（携带目的基因）
31、；再转入原核表达系统核表达系统（大肠杆菌）（大肠杆菌）或真核表达系统或真核表达系统（酵母菌）（酵母菌）中，构建中，构建“基因工程菌株基因工程菌株”；大量表达目的基因，获得目的蛋白大量表达目的基因，获得目的蛋白（如氨（如氨基酸、味精、抗生素、胰岛素、干基酸、味精、抗生素、胰岛素、干扰素、生长激素、乙肝疫苗）扰素、生长激素、乙肝疫苗）。幽门螺杆菌幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的致病是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的致病菌，并与胃腺癌菌，并与胃腺癌和胃部淋巴瘤的和胃部淋巴瘤的发生密切相关。发生密切相关。立论依据立论依据 我国人口我国人口Hp感染率为
32、感染率为70%。目前主。目前主要采用的抗生素疗法（三联药物要采用的抗生素疗法（三联药物:埃索美埃索美拉唑阿莫西林克拉霉素拉唑阿莫西林克拉霉素）的疗效不）的疗效不甚理想，易复发。甚理想，易复发。疫苗被认为是控制疫苗被认为是控制Hp感染最有效的感染最有效的方法。方法。全菌灭活疫苗全菌灭活疫苗 亚单位疫苗亚单位疫苗 由于以上疫苗各自的缺陷，目前尚无由于以上疫苗各自的缺陷，目前尚无安全、有效的疫苗应用于临床。鉴于安全、有效的疫苗应用于临床。鉴于Hp经黏膜途径入侵人体，黏经黏膜途径入侵人体，黏膜免疫在抗感染免疫中起膜免疫在抗感染免疫中起有重要作用。有重要作用。构建高效表达幽门螺杆菌保护性抗构建高效表达幽
33、门螺杆菌保护性抗原原-黏附素的重组嗜酸乳酸菌，作为黏附素的重组嗜酸乳酸菌，作为活活载体口服疫苗载体口服疫苗，诱发有效的局部免疫应，诱发有效的局部免疫应答，保护机体抵抗感染。答，保护机体抵抗感染。设计幽门螺杆菌黏附素设计幽门螺杆菌黏附素BabBab引物，引入酶切位点引物，引入酶切位点培养幽门螺杆菌标准菌株培养幽门螺杆菌标准菌株 抽提核酸抽提核酸PCRPCR扩增扩增BabBab基因基因构建表达载体构建表达载体pMD18-TpMD18-T转化进转化进E.coli DH5E.coli DH5受体菌，筛选转化成功的细菌受体菌，筛选转化成功的细菌抽提质粒抽提质粒双酶切，鉴定，回收双酶切，鉴定，回收BabB
34、ab片断片断克隆入嗜酸乳杆菌质粒克隆入嗜酸乳杆菌质粒pMG36epMG36e 电穿孔法转化电穿孔法转化在嗜酸乳杆菌中表达，获得重组嗜酸乳杆菌在嗜酸乳杆菌中表达，获得重组嗜酸乳杆菌鉴定目的蛋白表达效果鉴定目的蛋白表达效果 pMG36e是组成是组成型表达质粒载体，可型表达质粒载体，可在乳酸菌、大肠杆菌在乳酸菌、大肠杆菌中自我复制中自我复制。大小为。大小为3.6kb，含红霉素耐药，含红霉素耐药基因、基因、P32启动子、多启动子、多克隆位点和克隆位点和prtp转录转录终止子。终止子。实验结果实验结果引物设计引物设计:P1 5-GGAATTCATGAAAACATTTGAA-3 EcoR IP2 5-GC
35、TCGAGTTAAGCCAAATGGGC-3 Xho I2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp PCR扩增扩增Bab基因基因 Bab基因测序及序列分析基因测序及序列分析 Bab基因克隆至表达载体基因克隆至表达载体 bp 100015000750050002500M 1 2 1：EcoR I/Xho I双酶双酶 切重组质粒切重组质粒2：PCR 扩增扩增Bab基因基因-5.0-4.0-3.0-2.0-1.00.01.02.03.04.05.011443773109napA.seq_TranslationHydrophilicityPosition Bab生物信息学分析生物信息学分析 Bab在嗜酸乳杆菌中的表达在嗜酸乳杆菌中的表达M 1 2 3Kda97.466.243.031.020.114.4Kda97.466.243.031.020.114.4M 1 2 哈哈，下 课 了 !
