1、实验四、伪狂犬病抗体检测实验四、伪狂犬病抗体检测（阻断阻断ELISA)实验三伪狂犬病抗体检测1酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯聚苯乙烯微量反应板乙烯微量反应板)表面，从而使酶标记的抗原抗表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。反应来判定是否有免疫反应的存在。实验三伪狂犬病抗体检测2一、实验目的一、实验目的1.1.了解了解ELISAELISA的原理和
2、类型的原理和类型2.2.掌握阻断掌握阻断ELISAELISA操作程序操作程序实验三伪狂犬病抗体检测3二、实验原理二、实验原理1.抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；并保持其免疫学活性；2.抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；3.酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。实验三伪狂犬病抗体检
3、测4实验三伪狂犬病抗体检测5实验三伪狂犬病抗体检测6间接间接ELISAELISA实验三伪狂犬病抗体检测7 实验三伪狂犬病抗体检测8单抗单抗血清血清？底物显色底物显色阻断阻断ELISAELISA实验三伪狂犬病抗体检测9 实验三伪狂犬病抗体检测10 实验三伪狂犬病抗体检测111.1.酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪2.2.包被缓冲液：包被缓冲液：0.025M pH9.60.025M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液3.3.猪伪狂犬病毒（猪伪狂犬病毒（PRVPRV）抗原抗原4.4.样品稀释液：样品稀释液：pH7.4 PBSpH7.4 PBS三、实验材料三、实验材料实验三伪狂犬病抗体检测124.4.阴性
4、对照（阴性对照（EPEP管中，已稀释）管中，已稀释）5.5.阳性对照（阳性对照（EPEP管中，已稀释）管中，已稀释）6.6.样品样品 待测猪血清（待测猪血清（EPEP管中，已稀释）管中，已稀释）7.7.APAP标记猪标记猪PRVPRV单抗单抗 酶标单抗（酶标单抗（EPEP管中，已管中，已稀释）稀释）8.8.洗涤液：含洗涤液：含0.05%0.05%TweenTween 20 20的的0.01M pH7.4 0.01M pH7.4 PBSPBS（青瓶）（青瓶）实验三伪狂犬病抗体检测13常用酶及底物常用酶及底物常用酶常用酶底物底物反应后颜色反应后颜色辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）邻苯二
5、胺（邻苯二胺（OPDOPD）棕黄色棕黄色碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TMBTMB）蓝色蓝色实验三伪狂犬病抗体检测149.9.底物缓冲液：底物缓冲液：pH5.0pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液10.10.底物溶液：底物溶液：TMBTMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30%H30%H2 2O O2 2，新鲜配制新鲜配制11.11.终止液终止液实验三伪狂犬病抗体检测151.1.抗原处理：抗原处理：2.2.抗原包被：抗原包被：以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次四、实验方
6、法四、实验方法实验三伪狂犬病抗体检测163.3.加待测血清：加待测血清：标记各孔，加入相应液体标记各孔，加入相应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性待待测测阳阳性性待待测测4.4.加单抗：加单抗：3737，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标单抗各孔加入酶标单抗100L/100L/孔孔3737，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液
7、100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min,10min,加终止液加终止液1 1滴滴6.6.观察结果观察结果实验三伪狂犬病抗体检测171.1.取稀释好的被检血清取稀释好的被检血清2 2份和阴、阳性对照血清，每孔加入份和阴、阳性对照血清，每孔加入100l100l，置，置3737温育温育3030分钟。分钟。2.2.洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l200l，静置，静置3 3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3 3次。次。3.3.每孔加酶标单抗每孔加酶标单抗100l100l，置，置3737温育温
8、育3030分钟。分钟。4.4.洗板：同步骤洗板：同步骤2 2。5.5.显色与终止：每孔先加底物显色与终止：每孔先加底物A A液、再液、再B B液各液各1 1滴滴(50l)(50l)，混匀，室温，混匀，室温（18-25 18-25）避光显色）避光显色1010分钟后。分钟后。6.6.终止：每孔加终止液终止：每孔加终止液1 1滴滴(50l)(50l)（0.25%0.25%氢氟酸），终止反应。氢氟酸），终止反应。7.7.1010分钟内测定结果。采用波长分钟内测定结果。采用波长630nm630nm的酶标仪测定的酶标仪测定ODOD值。值。8.8.结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均结果判定：试验成立
9、的条件是：阴性对照孔平均OD630OD630值与阳性对照值与阳性对照孔平均孔平均OD630OD630值之差值之差0.40.4。9.9.S=S=样品孔样品孔OD630OD630值，值，N=N=阴性对照孔阴性对照孔OD630OD630值值10.10.如果如果S/NS/N比值比值0.60.6，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阳性抗体阳性;11.11.如果如果S/NS/N比值比值0.70.7但但 0.6 0.6，样品可疑，样品可疑;12.12.如果如果S/NS/N比值比值 0.7 0.7，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阴性。抗体阴性。实验三伪狂犬病抗体检测18五、结果与分析五、结果与分析
10、1.1.阴阳性对照样品的阴阳性对照样品的OD630 OD630?2.2.S/NS/N?，被检血清是阴，被检血清是阴/阳性？阳性？3.3.结果与预期的不符，可能的原因是什么？结果与预期的不符，可能的原因是什么？实验三伪狂犬病抗体检测19l 阳性：无色阳性：无色l 阴性：蓝色阴性：蓝色1 2 3 4阳性阳性阳性阳性阴性阴性被检被检单抗单抗血清血清？底物显色底物显色被检被检？实验三伪狂犬病抗体检测201.1.ELISAELISA前血清样品前血清样品3737灭活灭活3030分钟。分钟。2.2.在在ELISAELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。结合的抗原及杂质，用力甩干。3.3.加入底物液后应室温避光，结果判断须在加入底物液后应室温避光，结果判断须在1010分钟内。分钟内。4.4.实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。六、注意事项六、注意事项实验三伪狂犬病抗体检测21思考题思考题1.1.间接间接ELISAELISA和阻断和阻断ELISAELISA有什么异同？有什么异同？2.2.伪狂犬的抗体检测方法还有哪些？伪狂犬的抗体检测方法还有哪些？实验三伪狂犬病抗体检测22
