1、我国人用狂犬病疫苗我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信株病毒糖蛋白生物信息学分析息学分析【摘要】目的 测定我国人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白G 基因序列，并对其进行生物信息学分析。方法RT-PCR 扩增3 株病毒糖蛋白G 基因，分别克隆至pGEM-T 载体中，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆，进行测序。应用DNAstar MegAlign 软件分析3 株病毒糖蛋白的同源性，AntheProt 5.0 及DNAstar Protean 软件分析3 株病毒糖蛋白的结构及潜在B 细胞抗原表位的差异。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析2 狂犬病是由狂犬病
2、病毒（Rabies virus，RV）引起的人兽共患疾病，一旦发病，几乎100死亡，疫苗接种是预防该病的重要措施。目前，我国人用狂犬病疫苗生产用毒株主要有aG、CTN-1V 和PV2061 株，其中aG 株和CTN-1V 株为我国自行分离并传代适应，PV2061 株来源于法国巴斯德株。上述病毒株生产的人用狂犬病疫苗经临床应用显示，具有良好的保护效果。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析3 我国人用狂犬病疫苗生产用原始种子4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白（Glycoprotein，G）全基因序列进行测定，分析3 株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋
3、白生物信息学分析41.材料与方法 1.1 菌毒株 狂犬病病毒原始种子批4aGV、CTN-1V 和PV2061均由中国食品药品检定研究院病毒一室保存；感受态大肠杆菌DH5。1.2 主要试剂 QIAamp Viral RNA Mini Kit Reverse Transcription System TaKaRa LA Taq誖DRR002A EZNA誖Gel Extraction Kit pGEM-T vector system 我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析5 1.3 引物设计及合成 根据GenBank 中登录的aG、CTN、PV 株病毒M、L 区基因序列，应用Primer Pr
4、emier5.0 软件设计位于M 区及L 区的上下游引物，见表1。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析6我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析71.4 病毒G 区基因的扩增 用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒RNA，Reverse Transcription System 提供的随机引物逆转录 合成cDNA 第一链，再以其为模板，PCR 扩增目的基因。反应体系为：c DNA 2 l，10 buffer 5 l，2.5 mmol L dNTP 4 l，上下游引物各2 l（10 pmol L），LA Taq 1 l，去离子水补足体积至50 l。反应条件为：
5、95预变性5 min；95 30 s，53 30 s，72 2 min，共30个循环；72再延伸10 min。扩增产物经1琼脂糖 凝胶电泳鉴定，EZNA誖Gel Extraction Kit 纯化回收。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析8 1.5 克隆测序 将PCR 纯化产物与pGEM-T vector 连接，转化 感受态大肠杆菌DH5，蓝白斑筛选阳性克隆，经菌落PCR 鉴定后，送北京三博远志生物技术有限公司测序，每个片段至少送6 个阳性克隆。1.6 病毒糖蛋白生物信息学分析 应用DNAstar 中的MegAlign 软件分析3 株病 毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列的同源性；应用 An
6、theProt 5.0 及DNAstar 中的Protean 软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B 细胞抗原表位的差 异。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析92.结果 2.1 病毒G 区基因扩增产物的鉴定 应用配对引物分别扩增4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒G 区基因，扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳分 析，均可见约2 300 bp 的特异条带，大小与预期相符；应用3 对引物分别扩增4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒G 区基因，仅配对引物扩增出相应条带。尽 管应用aG-MGL-F R 引物对PV2061 株病毒G 区 基因进行扩增时有条带出现，但该条带大小及扩增
7、产物浓度均与目的片段明显不符，为非特异性扩增。因此3 对引物均具有特异性，与其他毒株无特异性 配对。见图1。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析10图1 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因扩增产物电泳图我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析112.2 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因序列同源性分析 4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白测序结果已提交到GenBank，登录号分别为JN234411、JN234418 和JN234424。测序结果表明，3 株病毒均为基因型狂犬病病毒；其基因组M-G 区间序列长度均为5 bp，CT
8、N-1V 株M-G 区间序列为CTTTT，4aGV 与PV2061 株为CTATT；3 株病毒G 区全序列均具有5端AACA 和3端polyA 尾结构，其中CTN-1V、4aGV 株G 区基因长度为2 067 bp，PV2061 株为1 675 bp，基因同源性为76.0 88.4；3 株病毒G 区ORF 基因均为1 575 bp，基因同源性为84.4 91.5；CTN-1V、4aGV 株G-L 区间序列长度为24 bp，PV2061 株为423 bp。对推导的3 株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性分析表明，3株病毒糖蛋白均由524 个氨基酸组成，同源性为90.5 92.2，见表2。我国人用狂犬病
9、疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析122.3 糖蛋白信号肽分析 对4aGV、CTN-1V 和PV2061 株的糖蛋白信号肽分析发现，三者前19 位氨基酸均存在潜在信号肽结构，其中第19 位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点，4aGV 株病毒糖蛋白第17 位氨基酸为潜在信号肽断裂位点，见图2。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析14我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析152.4 糖蛋白跨膜区结构分析 对4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白氨基酸结构进行跨膜区域分析，结果显示，3 株病毒糖蛋白分别在第463 476、464 475 及463 475位氨基酸存在潜在可折叠螺旋
10、的疏水性区域，可判断为明显跨膜区域，见图3。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析16图3 4aGV（A）、CTN-1V（B）和PV2061 株（C）糖蛋白潜在跨膜区域预测我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析17 2.5 糖蛋白的二级结构预测 应用AntheProt5.0 软件中的Gibrat 法对4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白二级结构进行预测，结果显示，4aGV、CTN-1V 和PV2061 株糖蛋白氨基酸残基均富含潜在 螺旋、折叠及卷曲结构，其比例分别为30、31、39，28、30、41和29、30、41，3 株病毒糖蛋白发生扭曲、折叠的几率较高，易形成
11、丰富的二级结构，见图4。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析18我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析192.6 糖蛋白B 细胞抗原表位预测结合4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白一级、二级及局部特殊结构，选取各株病毒糖蛋白亲水性强，无 螺旋、片层规则结构，并具有 转角的可塑性较大区域及表面可能性和抗原指数高的区域，分别得到3 株病毒株糖蛋白潜在B 细胞抗原表位区域，三者表位位置与数量相似，见图5 和表3。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析20我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析21我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析22 信号肽结构常指
12、新合成多肽链中用于指导蛋白 质跨膜转移（定位）的N-末端氨基酸序列，其至少含 有1 个带正电荷的氨基酸，中部有一高度疏水区以 通过细胞膜，并具有种属特异性。4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒在N-末端前19 位氨基酸均存在潜 在信号肽结构，可引导病毒糖蛋白在细胞膜上表达。此外，3 株病毒潜在信号肽结构氨基酸同源性仅为 78.9 94.7，这可能是在传代减毒过程中，病毒 对不同传代基质细胞的适应表征，反过来也间接影 响了3 株病毒在Vero 细胞中的适应程度。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析23 Benmansour 等11通过对中和单克隆抗体逃逸株点突变的研究，对糖蛋白的
13、中和抗原位点进行了初步定位，证明了糖蛋白含有3 个中和抗原位点，且均为空间依赖型抗原位点，但目前仍缺乏病毒糖蛋白线性表位的研究资料，因此本研究对4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白二级结构进行了深入分析，结果显示，3株病毒糖蛋白均易发生扭曲、折叠，在多个区域存在 螺旋、折叠及卷曲结构，形成丰富的二级结构，并在多个位点存在潜在B 细胞抗原位点。尽管目前尚无准确率较高的抗原位点预测方法，但本研究的分析结果仍可作为确定糖蛋白潜在优势表位的参考。此外，本研究应用特异性引物扩增不同株病毒糖蛋白全基因，并结合相应糖蛋白编码区序列的同源性分析，可初步实现病毒株的快速鉴定。我国人用狂犬病疫苗株
14、病毒糖蛋白生物信息学分析24研究结果 4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒均属基因型狂犬病病毒；其糖蛋白G 区基因同源性为76.0 88.4，G 区ORF 基因同源性为84.4 91.5，氨基酸序列同源性为90.5 92.2；3 株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潜在信号肽结构，其中第19 位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点，第17 位氨基酸为4aGV 株病毒糖蛋白潜在信号肽断裂位点；3 株病毒糖蛋白分别在第463 476、464 475 及463 475 位氨基酸存在潜在可折叠螺旋的疏水性区域，为明显跨膜区域；4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白氨基酸残基均富含潜在
15、螺旋、折叠及卷曲结构，其比例分别为30、31、39，28、30、41和29、30、41，易发生扭曲、折叠，形成丰富的二级结构；3 株病毒糖蛋白潜在B 细胞抗原表位位置与数量相似我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析25 糖蛋白具有决定病毒毒力的关键位点，是狂犬病病毒中唯一能诱生宿主产生中和抗体的抗原成分，也能有效刺激T 淋巴细胞增生，并参与识别宿主细胞和膜融合，是狂犬病疫苗的重要组成蛋白，也是衡量狂犬病疫苗免疫保护性的重要指标。本研究对我国人用狂犬病疫苗生产株4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒原始种子糖蛋白全基因序列进行了测定，并对3 株病毒糖蛋白的生物信息学进行了深入分析，为完善我国人用狂犬病疫苗生产用毒种的质控标准提供了支持。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析26我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析27
