1、植物基因工程中的植物基因工程中的噬菌体载体噬菌体载体20132013年年6 6月月2929日日载体（载体（vectorvector）是把一个有用的目的）是把一个有用的目的DNADNA片段通过片段通过重组重组DNADNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。工具。植物基因工程技术中尤为重要的植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的是载体，不同目的基因需要采用不同的载体。基因需要采用不同的载体。组成植物组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：基因工程载体系统常见的几种载体有：质粒质粒噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)(cosmid)m13
2、m13单链噬菌体。单链噬菌体。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒，结构简单、基因体等微生物的细菌病毒，结构简单、基因数少，是分子生物学与基因工程的良好实数少，是分子生物学与基因工程的良好实验系统。验系统。噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内。感宿主菌体内。噬菌体具有高效率的感染性和自主复制繁噬菌体具有高效率的感染性和自主复制繁殖性能，使它能高效导入受体细胞，并能殖性能，使它能高效导入受体细胞，并能使携带的外源基因在受体细胞中高效扩增，使携带的外源基因在受体细胞中高效扩增，所以噬菌体被开发成
3、基因工程的有用载体。所以噬菌体被开发成基因工程的有用载体。噬菌体噬菌体(bacteriophage(bacteriophage，phage)phage)简介简介噬菌体分类噬菌体分类毒性噬菌体（毒性噬菌体（virulent phagevirulent phage）：吸附、穿入、生物合成、成熟、：吸附、穿入、生物合成、成熟、释放释放温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phagetemperate phage）：转导、溶：转导、溶源源性转换性转换噬菌体噬菌体温和噬菌体可有三种存在状态：溶菌周期的具有感染温和噬菌体可有三种存在状态：溶菌周期的具有感染性的游离噬菌体颗粒；溶源周期的前噬菌体；宿主
4、菌性的游离噬菌体颗粒；溶源周期的前噬菌体；宿主菌细胞质内的游离噬菌体核酸。细胞质内的游离噬菌体核酸。DNADNA重组技术一般需要重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体有：目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体有：单链单链M13M13噬菌体载体；噬菌体载体；噬菌体载体；噬菌体载体；P1P1噬菌体载体；噬菌体载体；噬菌粒载体；噬菌粒载体；等等。等等。其中使用最多的是入噬菌体。其中使用最多的是入噬菌体。噬菌体噬菌体噬菌体是温和噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约噬菌体是温和噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm50nm的二的二十面体，
5、其内包裹一长线状双链十面体，其内包裹一长线状双链DNADNA分子（分子（46500bp46500bp）。）。左臂：从左臂：从A到到J长约长约20kb，其中的基因编，其中的基因编码构成头部、尾部、码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。体所需要的蛋白质。中段：从中段：从J到到N长约长约20kb，是，是DNA整合整合和切出，溶原生长所和切出，溶原生长所需的序列需的序列，但非溶菌但非溶菌生长所必需生长所必需右臂：长约右臂：长约10kb，控，控制溶菌和溶原生长最重制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、要的调控基因和序列、以及以及DNA复制起始均复制起始均在这区域内。在
6、这区域内。基因组长约基因组长约50kb 50kb，至少包括至少包括6161个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。性成簇排列。左右臂包含左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。在在DNA双链分子的两个双链分子的两个5 端各有端各有12个核苷酸单链的互个核苷酸单链的互补粘性末端，补粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当且两者的核苷酸序列互补，当噬菌体噬菌体感染感
7、染宿主细胞后宿主细胞后，其，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环可迅速通过粘性末端配对而成双链环状状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。位点。cos位点位点（cohesive end site）如果将左右臂和中段都去除，仅留下如果将左右臂和中段都去除，仅留下DNADNA而端包装而端包装噬菌体所必需的噬菌体所必需的coscos序列，再加上质粒的复制序列、序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成标志基因、多克隆位点等，就可构成coscos质粒或称为质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入粘粒的载体。粘粒可插入45kb
8、45kb长的外源长的外源DNADNA，然后，然后用用噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的后，粘粒的DNADNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于隆。所以粘粒主要用于DNADNA文库的构建。文库的构建。当噬菌体感染宿主细胞后,双链DNA 分子通过cos 而成环状。在感染早期,环状DNA 分子进行转录。在此期间,噬菌体有两条复制途径可供选择:一是裂解生长。环状DNA 分子在宿主细胞里复制若干次,合成了大量的噬菌体基因产物,形成子代噬菌体颗粒,成熟后使细菌裂解,释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。
9、另一是溶源性生长。噬菌体DNA 整合进宿主菌的基因组,然后像细菌染色体上的基因一样进行复制,并传递给下一代细菌。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组-DNA分子大小只能在3952kb之间。噬菌体的繁殖方式噬菌体的繁殖方式在感染的细胞内在感染的细胞内,噬菌体有两条复制途径噬菌体有两条复制途径:1 1、裂解生长、裂解生长2 2、溶源性生长、溶源性生长DNADNA重组技术一般需要重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建构建方式：构建方式：1 1、插入型。只具有一个限制酶位点，可便于外源、插入型。只具有一个限制酶位点，可便于外源DNADNA插入，这种载体叫
10、插入型载体（插入，这种载体叫插入型载体（insertion insertion vectorsvectors）。）。2 2、置换型。含有二个限制酶切点，在两个位点之间、置换型。含有二个限制酶切点，在两个位点之间的的DNADNA区段可以被外源区段可以被外源DNADNA片段所取代。这种载体片段所取代。这种载体叫置换型载体（叫置换型载体（replacement vectorsreplacement vectors）。）。至今已用噬菌体开发出许多插入型和置换型载体至今已用噬菌体开发出许多插入型和置换型载体插入型载体插入型载体:ZAP,ZAP,gt10,gt11:ZAP,ZAP,gt10,gt11等等置
11、换型载体置换型载体:GEM-11,GEM-12,EMBL3,EMBL4:GEM-11,GEM-12,EMBL3,EMBL4等等构建过程构建过程 野生型野生型噬菌体噬菌体DNA必须经过改造才能成为理想必须经过改造才能成为理想的载体，其构建过程主要有：删除基因组中非的载体，其构建过程主要有：删除基因组中非必需区，建立外源必需区，建立外源DNA片段的替换点，增加承载片段的替换点，增加承载外源外源DNA片段的容量。在非必需区内插入或替片段的容量。在非必需区内插入或替换选择的标记基因和目的基因。建立重组换选择的标记基因和目的基因。建立重组DNA分子的体外包装系统，使之有效地感染受分子的体外包装系统，使之
12、有效地感染受体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性，病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性，将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为“分分子运输车子运输车”的基本机理。的基本机理。噬菌体载体的应用噬菌体载体的应用一、建立一、建立cDNA文库文库噬菌体载体系统是在噬菌体载体系统是在eDNAeDNA文库构建中最早使用的载体文库构建中最早使用的载体系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于全长的全长的eDNAeDNA克隆，不仅质
13、量高、代表性好，而且重组克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组噬菌体颗粒的感染活性在噬菌体颗粒的感染活性在44环境中极其稳定，非常环境中极其稳定，非常适合于适合于eDNAeDNA文库的长期保存。文库的长期保存。cDNA与载体重组，或经体外包装成噬菌体颗粒后与载体重组，或经体外包装成噬菌体颗粒后转转导导宿主细胞，或不经体外包装直接宿主细胞，或不经体外包装直接转染转染宿主细胞，但宿主细胞，但转导的效率较高。转导的效率较高。DNADNA作为外源基因的克隆载体作为外源基因的克隆载体基因组中间部分占基因组中间部分占30%30%的的DNA(DNA(包括重组和溶源化基因包括重组和溶源化基因)并并不是噬菌体裂解
14、生长所必需的，裂解生长所需的基因都在基不是噬菌体裂解生长所必需的，裂解生长所需的基因都在基因组的左侧和右侧，而典型的因组的左侧和右侧，而典型的克隆载体在部分或全部非必克隆载体在部分或全部非必需基因的两侧含有限制酶位点，这就赋予了需基因的两侧含有限制酶位点，这就赋予了载体克隆大片载体克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位点之间，在体外包装成段的能力，外源基因插入到限制酶位点之间，在体外包装成噬菌体，虽然包装效率仅达噬菌体，虽然包装效率仅达10%10%，但一经包装，在大肠杆菌，但一经包装，在大肠杆菌中形成噬菌斑的效率可达中形成噬菌斑的效率可达100%100%。目前由。目前由衍生的许多载体衍生的许
15、多载体被广泛地应用于基因克隆中，尤其是在构建基因文库中的应被广泛地应用于基因克隆中，尤其是在构建基因文库中的应用产生了非常好的效果。用产生了非常好的效果。二、克隆外源目的序列二、克隆外源目的序列为了使外源基因能有效转录，将其插入为了使外源基因能有效转录，将其插入DNADNA的的PLPL启动子或启动子或PRPR启动子的有效转录区内。启动子的有效转录区内。噬菌体载体的克隆原理和步骤噬菌体载体的克隆原理和步骤（1）通过裂解过程增殖载体）通过裂解过程增殖载体 通过噬菌体的增殖，从中提取噬菌体通过噬菌体的增殖，从中提取噬菌体DNA 噬菌体载体均含有与裂解生长所必须的基噬菌体载体均含有与裂解生长所必须的基
16、因片断，不同的载体采用不同的大肠杆菌因片断，不同的载体采用不同的大肠杆菌宿主菌来增殖。宿主菌来增殖。经过裂解生长获得噬菌体经过裂解生长获得噬菌体颗粒，再经过分级分离分化，可用于提取颗粒，再经过分级分离分化，可用于提取噬菌体噬菌体DNA。（2）载体与外源片断的酶切载体与外源片断的酶切 插入型载体来说，载体被酶切后，很容易插入型载体来说，载体被酶切后，很容易自身连接，一般对载体的进行去磷酸化。自身连接，一般对载体的进行去磷酸化。置换型载体，切割后形成左臂、填充片断、置换型载体，切割后形成左臂、填充片断、右臂，填充片断的存在会影响连接效率，右臂，填充片断的存在会影响连接效率，必须纯化左臂和右臂。必须
17、纯化左臂和右臂。（3）外源片断与载体的连接）外源片断与载体的连接 通过载体的粘性末端，将载体连接成多联通过载体的粘性末端，将载体连接成多联体，以利于将两个体，以利于将两个cos位点之间的片断装入位点之间的片断装入噬菌体颗粒噬菌体颗粒（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力的噬菌体颗粒的噬菌体颗粒 利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白 连接产物与包装蛋白混合时，就可完成包连接产物与包装蛋白混合时，就可完成包装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒 包装蛋白对所包装的包装蛋白对所包装的DNA大小有高度选择大小有
18、高度选择性，性，范围：范围：DNA分子的分子的75105噬菌体的改造噬菌体的改造 设计去除设计去除DNA上的多余序列和一些限制性酶切点：因为上的多余序列和一些限制性酶切点：因为DNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。在中段非必需区，替换或插入某些标志基因，如上述的可在中段非必需区，替换或插入某些标志基因，如上述的可供蓝白筛选供蓝白筛选lacZ序列和多克隆位点等。序列和多克隆位点等。建立重组建立重组DNA分子的体外包装系统。分子的体外包装系统。与一般的质粒载体不同与一般的质粒载体不同,噬菌体转染前需要利用噬菌体外噬菌体转染前需要利用噬菌体外壳蛋白和噬菌体壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物加工酶组成的混合物(包装抽提物包装抽提物)在体外将连接好的在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒线性分子包装成噬菌体颗粒草菇噬菌体基因文库的构建草菇噬菌体基因文库的构建(见文献附件）见文献附件）
