1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n（1）目的基因的获取目的基因的获取n（2）n（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞n（4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定基因基因表达载体表达载体的构建的构建一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.什么叫基因文库？什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到片断，导入到中，中，各个受体菌分别含有这种生物的不同各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因，称为基因文库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）基因组基因组DNAD
2、NA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，分子移动，并以并以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。转录完毕后，转录完毕
3、后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合酶也从聚合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能能 编码蛋白质编码蛋白质 编编码码区区非非编编码码区区原原核核细细胞胞的的 基基因因结结构构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区
4、上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：真真核核细细胞胞的的 基基因因结结构构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码
5、蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码序列：编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_ _ _ 和具和具有调控作用的有调控作用的_ 区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的
6、蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法（1 1）鸟枪法鸟枪法（2 2）反转录法反转录法（3 3）（1 1）鸟枪法：）鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接受体细胞受体细胞产生
7、特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离(直接分离法直接分离法)以目的基因转录成的以目的基因转录成的信使信使RNA为模板，为模板，再再反转录酶反转录酶的催化下反转录成互补的单链的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链聚合酶的作用下合成双链DNA，即，即cDNA，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。（2 2）反转录法反转录法（cDNAcDNA文库的构建方法文库的构建方法）上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸
8、合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置；基因的转录产物基因的转录产物mRNA；基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特
9、性。u基因文库基因文库中不是直接保管相应基因，中不是直接保管相应基因，而是而是保存受体菌保存受体菌，菌中含基因。，菌中含基因。1、构建基因组、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的文库时，首先应分离细胞的A、染色体、染色体DNA B、线粒体、线粒体DNAC、总、总mRNA D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个片段，导入某个生物生物 体内，则这个生物就是
10、一个基因文库体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文文库库AC（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR多聚酶链式反应多聚酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技术技术。通过此技术，可。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取大量的目的基因。模板DNA95PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的
11、基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束n 过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至90909595双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至55556060部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定
12、互补部位相配对和互补部位相配对和结合结合延伸：延伸：加热至加热至70707575以目的基因为以目的基因为模板，合成互补的模板，合成互补的新新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_。在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。（1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。（2）在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA
13、片段。15/1615/16三三 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。前提条件：前提条件：_；其它条件：其它条件：_ _、_、_。原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物引物 DNADNA模板模板热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百
14、万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增体外体外过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链思考？思考？1 1
15、个个DNADNA分子进行分子进行PCRPCR扩增扩增,循环循环4 4次，次，理论上至少需要几个引物？理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循环次数为循环次数)（24-1）2=301、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可，要使其数量增多，可用用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链双链DNA分子为模板分子为模板 ATGTG或或TACAC模板链模板链 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 四种核苷酸四种核苷酸 DNA聚合酶聚合酶 热热稳定稳定DNA
16、聚合酶引物聚合酶引物 温度变化温度变化 恒温恒温A BC DD2、在基因工程中，把选出的目的基因（共、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入个）放入DNA扩增仪中扩增扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是氧核苷酸的个数是A.540个个 B.8100个个 C.17280个个D.7560个个B1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是方便方法是A、化学合成法、化学合成法 B、基因组文库法、基因
17、组文库法C、cDNA文库法文库法 D、聚合酶链反应、聚合酶链反应2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用利用PCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因 反转录法反转录法 通过通过DNA合成仪利合成仪利用化学方法人工合成用化学方法人工合成A B C DAD3、目的基因主要是指、目的基因主要是指_的结构基因。的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中）从基因文库中获取目的基因，根据基因的获取目的基因，根据基因的_序列，基因在序列，基因在_上的位置，基因的上的
18、位置，基因的_产物产物mRNA，基，基因的因的_产物蛋白质等获取目的基因。（产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在技术扩增目的基因，该技术是一项在_完完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成序列，以便于合成_。（。（3）如果基）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方方法。法。编码蛋白质编码蛋白质核苷酸核苷酸染色体染色体转录转录表达表达体外体外核苷酸核苷酸引物引物人工合成人工合成PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCRPCR技
19、术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高温下在高温下变性解旋变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶 细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。将切下的
20、目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶1.1.过程过程:二二 基因基因表达表达载体构载体构建建 核心核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种过程过程:2.2.基因表达载体的目的基因表达
21、载体的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；并可以遗传给下一代；（2 2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。作为基因工程表达载体，作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（吗？为什么？（P P1515）不可以。不可以。因为目的基因在表达载体中得到表因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，达并发挥作用，还需要有其他控制元件还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的必须构建上述元件的是：是：（1 1
22、）生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自受体生物自身基因身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2 2）通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；将编码序列导入受体生物中无法转录；（3 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率增强基因启动
23、子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置何位置(上游或下游上游或下游)上都发挥作用。上都发挥作用。）等；等；（5 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因等。3.3.基因表达载体的基因表达载体的组成：组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动
24、子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因启动子：启动子：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段特殊结构的段特殊结构的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，聚合酶识别和结合的部位，有了它才能有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得所需要的蛋白，最终获得所需要的蛋白质质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的因，从而将含有目的基因的细
25、胞筛选出来细胞筛选出来思考思考2：终止子的作用是什么？终止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊终止子是位于基因尾端的一段特殊的的DNA片断，能终止片断，能终止mRNA的转录。的转录。是为了鉴别受体细胞中是否含有目是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。出来。思考思考3：标记基因有什么作用？标记基因有什么作用？载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。增
26、加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意注意用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用既用到限制酶切割载体，又用到到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。的化学键都是磷酸二酯键。启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达必需以表达载体的方式携带进去。载体的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。（一）转化：（一）转
27、化：目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）（二）方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞n农杆菌转化法农杆菌转化法最常用最常用n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点：易感染双子叶植物和裸易感染
28、双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力物没有感染能力原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DN
29、ADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基含目的基因），使目的基因借因），使目的基因借助花粉管通道进入受助花粉管通道进入受体细胞。体细胞。2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1
30、）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中）中）（2 2）操作程序）操作程序:提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物常用法常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受
31、态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？处理受体细胞？用用CaCa2 2处理，增加细菌细胞壁的通透性处理，增加细菌细胞壁的通透性受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列
32、导入目的基因的作法正确的是（）的是（）A.A.将毒素蛋白注射到受精卵中将毒素蛋白注射到受精卵中B.B.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.C.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵进入受精卵D.D.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，注射到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定n检测检测:q是否插入目的基因是否插入
33、目的基因q是否转录是否转录q是否翻译是否翻译n鉴定鉴定:q分子水平分子水平鉴定鉴定q个体生物学水平个体生物学水平鉴定鉴定1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程:将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记,以此做以此做探针探针；使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示若显示出杂交带出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染
34、色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检测：采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。（二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:
35、抗原抗原-抗体杂交抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。提取提取苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因没有抗虫基因的棉植株的棉植株有抗虫基因的有抗虫基因的棉植株棉植株棉铃虫棉铃虫虫没
36、有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目的基目的基因表达因表达类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交
37、带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。提示：提示：DNADNA分子杂交技术首先提取受体分子杂交技术首先提取受体细胞中的细胞中的DNADNA，然后高温解成单链，再，然后高温解成单链，再与同位素标记的与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交；抗原抗体杂交所用到的抗体是抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗
38、体，并提取出而来的。产生相应的抗体，并提取出而来的。归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）（动物）4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译 利用大肠杆菌可以生产出
39、人的胰岛素，联系前面利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不
40、可能的。在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：寻根问底：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理理,你能分析出你能分析出农杆菌不能将目的基因农杆菌不能将目的基因导入单子叶导入单子叶植物的原因吗植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中若将一个抗病基因导入小麦中,理理论上讲你应该怎样做论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋
41、化性）和激活农杆菌的诱组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使导的基因，使T-DNAT-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNADNA上。上。酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中成，通常不存在于单子叶植物中 4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白
42、，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNA)。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素
43、基因而死掉；如果大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入珠蛋白基因已进入其中。其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。检测是否插入目的基因，检测是否插入目的基因，利用利用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术，目的，目的基因基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，杂交，看是否有杂交带。看是否有杂交带。检测是否转录出了检测是否转录出了m
44、RNAmRNA，利用利用分子杂交技术，分子杂交技术，目的基因目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNAmRNA杂交，看杂交，看是否有杂交带。是否有杂交带。检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。原抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：提示：DNADNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNADNA，然，然后高温解成单链，再与同位素标记的后高温解成单链，再与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交；抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
