1、第一节 盐析法一、基本原理一、基本原理 盐析法是利用各种生物分子在盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液浓盐溶液中中溶溶解度的差异解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的，通过向溶液中引入一定数量的中性中性盐盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。到纯化目的的方法。蛋白质溶液蛋白质溶液加入中性盐加入中性盐低盐，低盐，盐溶盐溶高盐，高盐，盐析盐析 两性电解质，静电力作用，相互排斥；形成水化膜，避免相互碰撞。（1）生物大分子在水溶液中的特性（2）作用原理 破坏水化膜破坏水化膜 中和电荷中和电荷（3）盐析过程蛋白质在水中的溶解度与离子强度的关系
2、Cohn经验公式：lgS=-Ks S 蛋白质溶解度，g/L；盐离子强度，=ci Zi 2，ci 盐离子强度，mol/L；Z i i 离子化合价；常数；Ks 盐析常数。Ks盐析法（溶解度剧烈下降）v在一定的pH和温度下，改变盐离子强度（浓度）进行盐析v分辨率不高v用于提取液的前期分离 盐析法（溶解度变化缓慢）v一定的盐离子强度下，改变pH和温度进行盐析v分辨率比Ks盐析法高v用于后期分离a、盐析作用规律 半径小的高价离子作用较强，半径大的低价离子作用较弱（感胶离子序）。阴离子阴离子：柠檬酸根酒石酸根：柠檬酸根酒石酸根SO42-F-IO3-H2PO4-CH3COO-Cl-ClO3-Br-NO3-C
3、lO4-I-CNS-阳离子阳离子：Th4+Al 3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+1）无机盐的种类一般高价阴离子盐析作用较好b、用盐的参考要求v盐析作用要强v较大的溶解度，受温度影响小v必须是惰性的v来源丰富、经济c、硫酸铵特点优点：价廉，溶解度大，随温度变化小缺点：水解变酸；高pH释氨，腐蚀；残留量对产品有影响。v硫酸铵使用注意事项硫酸铵使用注意事项:1、硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理.2、高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水调节至所需PH。3、硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意。v蛋
4、白质种类不同（和 Ks不同），盐析沉淀所需的无机盐量也不同。v先后加入不同量的无机盐可分级沉淀不同蛋白质。2）溶质（蛋白质等）种类3）蛋白质浓度的影响一般常将蛋白质浓度控制在一般常将蛋白质浓度控制在23为宜。为宜。v适当稀释，可使盐析分布曲线互相重叠的两个蛋白质分级沉淀。4）温度的影响n 一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降。n 必须考虑到蛋白质对热稳定性。-淀粉酶、蛋白酶磷酸盐沉淀碳氧血红蛋白磷酸盐沉淀碳氧血红蛋白5）pH的影响v影响蛋白质表面净电荷的数量。v通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好。v在高盐溶液中蛋白质等电点的偏移现象。2120P1PPVaV 盐析时，将盐加
5、入到溶液中有两种方式：盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。1.盐析用盐的浓度表示（1）加硫酸铵的饱和溶液）加硫酸铵的饱和溶液三、盐析操作Va：加入的饱和（NH4)2S04 体积V0：蛋白质溶液原始体积P1、P2：分别表示初始和最终溶液的饱和度，（2）直接加固体硫酸铵212AP1)PG(PX在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。为达到所需硫酸铵饱和度时，可采用这种方
6、式。为达到所需的饱和度，应加入固体硫酸胺的量，可查表或由的饱和度，应加入固体硫酸胺的量，可查表或由下式计算而得：下式计算而得：X：1L溶液需加人固体（NH4)2SO4 的质量（g)；G：饱和溶液中的盐含量，0时为515，20为513；A：常数，0时为0.27，20为0.29。2.盐析方法和注意事项1）分级盐析法注意：试验用提取物的浓度应与生产时一致；注意：试验用提取物的浓度应与生产时一致；在高盐浓度下，有的生物活性物质的活力会受到抑制。在高盐浓度下，有的生物活性物质的活力会受到抑制。2）重复盐析法：用较低的盐饱和度多次重复盐析。3）反抽提法：先共沉淀，再用稀盐溶去杂蛋白。大肠杆菌大肠杆菌提提
7、取取 液液上清上清50%饱和硫酸铵饱和硫酸铵33%饱和饱和硫酸铵硫酸铵悬于悬于12%饱和饱和硫酸铵中硫酸铵中沉淀沉淀上清上清上清上清弃去弃去沉淀沉淀弃去弃去沉淀沉淀酶酶大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶的制备聚合酶的制备3）盐析注意事项v沉淀反应在缓冲溶液中进行；沉淀反应在缓冲溶液中进行；v盐析完全需要一定时间；盐析完全需要一定时间；v能否多次盐析靠试验确定；能否多次盐析靠试验确定；v盐析后应及时脱盐（常用透析）盐析后应及时脱盐（常用透析）。v防止非均态出现；防止非均态出现；v防止低温增溶（少数在防止低温增溶（少数在0-10）；）；v注意分离方法与介质的密度和黏度的关系。注意分离方法与介质的密度和黏
8、度的关系。脱盐的方法四、盐析方法的应用 盐析法由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的初级分离。胸腺提取液加热去杂蛋白上 清 液丙 酮 粉丙酮沉析(-10)上 清 液磷酸盐缓冲液中溶解、加硫酸铵饱和度为0.25盐 析 物加硫酸铵饱和度为0.50超 滤胸腺素硫酸铵分级盐析法粗提胸腺素工艺流程硫酸铵分级盐析法粗提胸腺素工艺流程沉淀+PBS继续纯化上清液含-球蛋白沉淀含-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达45%饱和度饱和度加饱和硫酸铵加饱和硫酸铵加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达20%饱和度饱和度血浆+PBS上清液含清蛋白沉淀+PBS上清液
9、沉淀含纤维蛋白上清液沉淀含-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达30%饱和度饱和度上清液为-球蛋白沉淀为-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达30%饱和度饱和度硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程第二节 有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量向水溶液中加入一定量亲水性亲水性的有机溶剂，降的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。优点：优点：产品更纯净；易分离；分辨能力比盐析法高；产品更纯净；易分离；分辨能力比盐析法高；沉淀不用脱盐。沉淀不用脱盐。缺点：缺点：易使蛋白质变性；需在低温下进行；易燃
10、易爆；易使蛋白质变性；需在低温下进行；易燃易爆；成本高，有一定毒性。成本高，有一定毒性。*A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（介电常数D有机有机 D水）水），减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。淀。*B 破坏水化膜：破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化
11、层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。质沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。结合形成疏水层。一、有机溶剂沉淀法基本原理（p174）有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理降低介电常数破坏水化膜1、有机溶剂种类及用量2100120SSSVV选择原则：选择原则：v水溶性要好（与水无限混溶）v介电常数要小v致变性作用要小v毒性要小、挥发性适中用量计算：2、溶液pH值：目标蛋白与杂质带有相同的电荷，
12、一般pI附近3、温度：（预冷）低温防止变性，有利于提高收率（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热）4、无机盐含量:离子强度低有利于沉淀，0.010.05mol/L5、金属离子助沉淀作用：Ca2+、Zn2+等多价阳离子。6、样品浓度:0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 举例：固体发酵生产举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体淀粉酶（米曲霉）菌体+水水 过滤过滤 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀粉酶淀粉酶*pH影响影响 收率收率%酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6.5 p
13、H *适宜的适宜的pH 5.6 6.0 *温度影响温度影响 收率收率%酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T *适宜的温度适宜的温度10 20 有机溶剂沉淀实例有机溶剂沉淀实例第三节 其他沉淀方法等电点沉淀法只适用在等电点时溶解度很低的两性生化物质，如酪蛋白。2、成盐沉淀法 金属离子沉淀、有机酸类复合盐沉淀3、亲和沉淀 加入载体-配基复合物4、高分子聚合物沉淀法 PEG、Dextron、PVPP等。5、表面活性剂沉淀法几种主要沉淀方法比较几种主要沉淀方法比较各种沉淀方法应用范围盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋
14、白质沉淀。等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。结晶的概念：第四节 结 晶v只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。v通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。v结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。结晶操作的特点结晶包括三个过程：结晶
15、包括三个过程：过饱和溶液的形成；过饱和溶液的形成；晶核的形成；晶核的形成；晶体的生长。晶体的生长。溶液达到过饱和是结晶的前提，过溶液达到过饱和是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。饱和度是结晶的推动力。一、结晶过程一、结晶过程饱和溶液过饱和溶液饱和曲线和过饱和曲线饱和曲线和过饱和曲线二、过饱和溶液的形成方法二、过饱和溶液的形成方法(1)溶剂蒸发法(2)温度诱导法(3)盐析结晶法(4)透析结晶法(5)有机溶剂结晶法(6)等电点法(7)微量扩散法(8)化学反应结晶法(9)共沸蒸馏结晶三、提高晶体质量的途径晶核的形成(1)(1)初级成核初级成核:过饱和溶液中的过饱和溶液中的自发成核自发成核现象（现象
16、（不稳定区不稳定区）。）。(2)(2)二次成核：向稍微过饱和溶液中加入晶种，二次成核：向稍微过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生会有新晶核产生机理机理:附着在晶体表面的微小晶体受到附着在晶体表面的微小晶体受到剪切剪切作作用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。v在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，这种现象称为晶体生长。晶体生长速度也是影响晶体产品粒度大小的一个重要因素。如果晶核形成速度大大超过晶体生长速度，则过饱和度主要用来生成新的晶核，因而得到细小的晶体，甚至无定形；如果晶体生长速度超过晶核形成速度，则得到粗大而均匀的
17、晶体。晶体的生长晶体的生长过饱和度、改变溶剂体系、杂质如：普鲁卡因青霉素在水中结晶得方形晶体；在乙酸丁酯中得到棒状晶体母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布 “晶簇”重结晶：是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。重结晶溶剂选择：1）对溶质的溶解度大，外界条件（T、pH）改变，溶解度明显减小；2）对杂质溶解性好；3）毒性低、沸点较低。重结晶生物物质重结晶：蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等LOGOv蛋白质种类不同（和 Ks不同），盐析沉淀所需的无机盐量也不同。v先后加入不同量的无机盐可分级沉淀不同蛋白质。2）溶质（
18、蛋白质等）种类v适当稀释，可使盐析分布曲线互相重叠的两个蛋白质分级沉淀。5）pH的影响v影响蛋白质表面净电荷的数量。v通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好。v在高盐溶液中蛋白质等电点的偏移现象。四、盐析方法的应用 盐析法由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的初级分离。沉淀+PBS继续纯化上清液含-球蛋白沉淀含-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达45%饱和度饱和度加饱和硫酸铵加饱和硫酸铵加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达20%饱和度饱和度血浆+PBS上清液含清蛋白沉淀+PBS上清液沉淀含纤维蛋白上清液沉淀含-球蛋白加饱和硫
19、酸铵达加饱和硫酸铵达30%饱和度饱和度上清液为-球蛋白沉淀为-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达30%饱和度饱和度硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程 举例：固体发酵生产举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体淀粉酶（米曲霉）菌体+水水 过滤过滤 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀粉酶淀粉酶*pH影响影响 收率收率%酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6.5 pH *适宜的适宜的pH 5.6 6.0 *温度影响温度影响 收率收率%酶酶活活 酶活酶活 收率收率 10 20 T *适宜的温度适宜的温度10 20 有机溶剂沉淀实例有机溶剂沉淀实例各种沉淀方法应用范围盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
