1、食品理化检验 黎源倩 主编第七章第七章食品中兽药残留量的分析食品中兽药残留量的分析第一节第一节 概概 述述使用兽药的目的兽药的主要用途有：兽药的主要用途有：防病治病、防病治病、促进生长、促进生长、提高饲料利用率、提高饲料利用率、改善动物性食品的品质等。改善动物性食品的品质等。兽药和兽药残留兽药和兽药残留 兽药：兽药：预防和治疗畜禽疾病的药物；促进生预防和治疗畜禽疾病的药物；促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质；长、提高生产性能、改善动物性食品的品质；也包括一些化学的、生物的动物保健品或饲也包括一些化学的、生物的动物保健品或饲料添加剂。料添加剂。兽药残留：兽药残留：“兽药在动物性食品中的
2、残留兽药在动物性食品中的残留”的简称，是指动物产品的任何可食部分所含的简称，是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药有关的杂质。与兽药有关的杂质。u 抗生素类：四环素、氯霉素、磺胺类、呋喃类等；抗生素类：四环素、氯霉素、磺胺类、呋喃类等；u-兴奋剂：盐酸克伦特罗、己烯雌酚、孕酮等；兴奋剂：盐酸克伦特罗、己烯雌酚、孕酮等；u激素：己烯雌酚、孕酮等；激素：己烯雌酚、孕酮等；u 抗寄生虫类：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚抗寄生虫类：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。、吡喹酮等。兽药残留的类型p 非法使用违禁或
3、淘汰药物；非法使用违禁或淘汰药物；p 不遵守休药期规定；不遵守休药期规定；p 滥用药物；滥用药物；p 违背有关标签的规定；违背有关标签的规定；p 屠宰前用药。屠宰前用药。兽药残留产生的原因兽药残留的来源兽药残留的来源 在食品动物体内或动物性食品中发现的违章在食品动物体内或动物性食品中发现的违章残留残留,大都是由用药错误造成的大都是由用药错误造成的,其原因主要有其原因主要有:不正确地应用药物不正确地应用药物,如用药剂量、给药途径、如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示示,这些因素有可能延长药物残留在体内的时这些因素有可能延长药物残留在
4、体内的时间间,从而需要增加休药的天数从而需要增加休药的天数;在休药期结束前屠宰动物在休药期结束前屠宰动物;屠宰前用药掩饰临床症状屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检查以逃避屠宰前检查;以未经批准药物作为添加剂饲喂动物以未经批准药物作为添加剂饲喂动物;药物标签上的用法指示不当药物标签上的用法指示不当,造成违章残留物造成违章残留物;饲料粉碎设备受污染饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药物的容或将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料器用于贮藏饲料;接触接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的废水废水和排放的污水和排放的污水(如猪经常摄入这种污水如猪经常摄入这种污水);任意以抗生素药渣
5、喂猪或其他食品动物等滥任意以抗生素药渣喂猪或其他食品动物等滥用抗生素用抗生素,是出现抗生素残留的主要原因。是出现抗生素残留的主要原因。美国食品药物管理局美国食品药物管理局(FDA)和美国兽医中心和美国兽医中心(CVM)的调查结果表明的调查结果表明,引起违章药物残留的常见原因为引起违章药物残留的常见原因为:不遵守休药期不遵守休药期;使用未经批准的药物使用未经批准的药物;未做用药记录未做用药记录;饲料加工或运送错误饲料加工或运送错误;盛放它种药物的贮存容器未充分清洗干盛放它种药物的贮存容器未充分清洗干净等。净等。兽药残留兽药残留:残留在动物性食品中兽药原形残留在动物性食品中兽药原形式、代谢物和杂质
6、。式、代谢物和杂质。兽药分类：兽药分类：抗生素类抗生素类：包括青霉素、链霉素、金霉素、土：包括青霉素、链霉素、金霉素、土霉素、四环素、泰乐菌素等。霉素、四环素、泰乐菌素等。呋喃药类呋喃药类：包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃呾：包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃呾啶等。啶等。磺胺药类：磺胺药类：抗球虫药：抗球虫药：激素药类：激素药类：驱虫药类：驱虫药类：兽药残留的危害兽药残留的危害v 毒性作用：毒性作用：急性、慢性、三致急性、慢性、三致v 耐药性：耐药性：耐药菌株传递给人耐药菌株传递给人v 过敏反应：过敏反应：青霉素、磺胺类等青霉素、磺胺类等v 激素（样）作用：激素（样）作用：潜在致癌性、发育潜在致癌性、
7、发育毒性（儿童性早熟）等毒性（儿童性早熟）等v 污染环境，影响生态：污染环境，影响生态：进入环境仍有进入环境仍有活性活性兽药残留限量标兽药残留限量标 90年代开始监控工作，年代开始监控工作，2002最新最新动物性食品中最高残留限量动物性食品中最高残留限量：可用，不限量：可用，不限量：88可用，需限量：可用，需限量：94可用，不得检出可用，不得检出9禁用，不得检出：禁用，不得检出：31我国食品中部分兽药的最高残留限量我国食品中部分兽药的最高残留限量药物药物食品食品最高残留限量最高残留限量(mg/kg)四环素四环素畜禽：肌肉畜禽：肌肉 0.1 肝肝 0.3 肾肾 0.6氯霉素氯霉素畜禽肉、水产品畜
8、禽肉、水产品不得检出(检出限检出限0.01)磺胺类磺胺类畜禽（可食性组织）畜禽（可食性组织）0.1水产品水产品 0.1(单种）单种）猪肉、鸡肉、鸡蛋、牛肉猪肉、鸡肉、鸡蛋、牛肉0.1(以总量计以总量计)呋喃唑酮呋喃唑酮水产品水产品不得检出鸡肉、鸡蛋鸡肉、鸡蛋 0.1盐酸克伦特罗盐酸克伦特罗(瘦肉精）瘦肉精）畜禽肉畜禽肉不得检出(检出限检出限0.01)己烯雌酚己烯雌酚畜禽肉、水产品畜禽肉、水产品不得检出(检出限检出限0.05)兽药残留限量标准兽药残留限量标准兽药残留分析技术的特点兽药残留分析技术的特点待测物质浓度低待测物质浓度低样品基质复杂，干扰物质多样品基质复杂，干扰物质多兽药残留代谢产物多样
9、或不明兽药残留代谢产物多样或不明动物种类多样，对药物代谢存在差异动物种类多样，对药物代谢存在差异 兽药残留的检验方法兽药残留的检验方法 对检测方法的要求对检测方法的要求快速快速高通量高通量定量定量准确度和精确度准确度和精确度确证确证 兽药残留的检验方法兽药残留的检验方法 理想的仪器装备理想的仪器装备样品经简单处理即可上机测定样品经简单处理即可上机测定不需萃取和净化不需萃取和净化快速、准确的定量分析快速、准确的定量分析自动的资料处理自动的资料处理分析方法的总体思路分析方法的总体思路高水平高水平(Level)方法方法确证和定量被确证和定量被分析物质分析物质 中等水平中等水平(Level)方法方法定
10、量但不需定量但不需要确证被分析物质要确证被分析物质低水平低水平(Level)方法方法筛选筛选uELISA：简单、快速、灵敏度，但容易产生假阳性，一般只简单、快速、灵敏度，但容易产生假阳性，一般只适用进行样品适用进行样品粗筛粗筛，阳性结果需进行确证。，阳性结果需进行确证。u GC：灵敏度较高，但大多数兽药极性或沸点偏高，需繁琐灵敏度较高，但大多数兽药极性或沸点偏高，需繁琐的衍生化步骤，限制了应用。的衍生化步骤，限制了应用。uHPLC：操作简单，但灵敏度不高；某些残留，检出限达不操作简单，但灵敏度不高；某些残留，检出限达不到要求。到要求。u仪器联用：仪器联用：分离、定性、定量一体，灵敏、准确、选择
11、性都分离、定性、定量一体，灵敏、准确、选择性都高，是国际公认的确认方法高，是国际公认的确认方法。GC/MS、LC/MS等等兽药残留的分析方法兽药残留的分析方法u 筛选方法筛选方法u 检测和确认方法：理化检验技术（检测和确认方法：理化检验技术（GC、HPLC、TLC、GC-MS、HPLC-MS等）。等）。微生物检验（微生物抑制试验）微生物检验（微生物抑制试验）免疫法（免疫检测试剂盒）免疫法（免疫检测试剂盒）阳性阳性兽药残留的分析方法兽药残留的分析方法兽药残留的检验分析方法包括兽药残留的检验分析方法包括筛选、检测和确认筛选、检测和确认。GC和和GC-MS的区别的区别 GC是指气相色谱仪。是指气相色
12、谱仪。一般来说一般来说 气象色谱仪气象色谱仪使用的检测器使用的检测器 有有npd fid fpd ecd等等等等 如果气象色谱器没加上述常用检测器如果气象色谱器没加上述常用检测器 而是用而是用质谱当做检测器质谱当做检测器 那么就是那么就是GC-MS了，了，GC-MS一般指的是单级质谱一般指的是单级质谱 如果是二级质谱如果是二级质谱就是就是 GC-MS-MS了。了。GC就是一个分离装置就是一个分离装置 严格说严格说 GC是没法单独是没法单独用的用的 必须加检测器必须加检测器 只不过人们习惯吧只不过人们习惯吧 GC-FID、GC-ECD、GC-FPD等等等等 简称为简称为GC而而已。已。气相色谱检
13、测器热导检测器热导检测器氢火焰离子检测器氢火焰离子检测器 电子捕获检测器电子捕获检测器火焰光度检测器火焰光度检测器质谱检测器质谱检测器TCD thermal conductivity detectorFPD flame photometric detectorFID hydrogen flame ionization detectorMSD mass spectrum detectorECD electron capture detector质谱分析质谱分析Mass Spectrometry，MS 质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一
14、种分析方法。的测定来进行分析的一种分析方法。化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，电荷分子离子及碎片离子，按照其质量按照其质量m和和电荷电荷z的比值的比值m/z（质荷比）大小依次排列而（质荷比）大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱被记录下来的图谱，称为质谱。质谱分析的过程与原理质谱分析的过程与原理241、进样、进样化合物通过汽化引入离子化室；化合物通过汽化引入离子化室；2、离子化、离子化在离子化室，组分分子被一束加速电子碰在离子化室，组分分子被一束加速电子碰撞（能量约撞（能量约70eV），撞击使分子电离形），撞击使分子电离形成正
15、离子；成正离子；M M+e或与电子结合，形成负离子或与电子结合，形成负离子M+e M253、离子也可因撞击强烈而形成碎片离子：、离子也可因撞击强烈而形成碎片离子：4、荷电离子被加速电压加速，产生一定、荷电离子被加速电压加速，产生一定的速度的速度v，与质量、电荷及加速电压有关：，与质量、电荷及加速电压有关：)1(212mvzH 265、加速离子进入一个强度为、加速离子进入一个强度为H的磁场，发的磁场，发生偏转，半径为：生偏转，半径为：)2(zHmvr 将（将（1）（）（2）合并：）合并：)3(222VrHZm当当 r 为仪器设置不变时，改变加速电压或为仪器设置不变时，改变加速电压或磁场强度，则不
16、同磁场强度，则不同m/z的离子依次通过狭缝的离子依次通过狭缝到达检测器，形成质量谱，简称质谱。到达检测器，形成质量谱，简称质谱。不同的物质有不同的质量谱不同的物质有不同的质量谱质谱，利用质谱，利用这一性质，可以进行定性分析（包括分子质这一性质，可以进行定性分析（包括分子质量和相关结构信息）；谱峰强度也与它代表量和相关结构信息）；谱峰强度也与它代表的化合物含量有关，可以用于定量分析。的化合物含量有关，可以用于定量分析。化合物化合物C5H12O的质谱图的质谱图GC-MS的基本流程的基本流程GC-MS联用的优缺点联用的优缺点 色谱仪有很强的色谱仪有很强的分离混合物的能力分离混合物的能力，但是对，但是
17、对化合物定性的能力差。化合物定性的能力差。质谱分析试样必须是高度纯净物，而质谱本质谱分析试样必须是高度纯净物，而质谱本身无分离混合物的能力，但是能身无分离混合物的能力，但是能用来测定化用来测定化合物的相对分子质量和化学结构合物的相对分子质量和化学结构，是一个优，是一个优良的定性工具。良的定性工具。GC-MS联用的优缺点联用的优缺点 气相色谱气相色谱-质谱联用的时候，气相色谱法分离效能质谱联用的时候，气相色谱法分离效能高，定量准确，故气相色谱仪是质谱法的理想高，定量准确，故气相色谱仪是质谱法的理想分分离器离器；同样，质谱法灵敏度高，定性能力强，几；同样，质谱法灵敏度高，定性能力强，几乎能检查出所
18、有的有机化合物，故质谱仪是气相乎能检查出所有的有机化合物，故质谱仪是气相色谱法的理想色谱法的理想检测器检测器。气相色谱首先对挥发性的物质进行分离、定量；气相色谱首先对挥发性的物质进行分离、定量；质谱法再通过测定离子质量和强度来进行成分分质谱法再通过测定离子质量和强度来进行成分分析和结构分析。析和结构分析。因此，采用两者的联用，综合其因此，采用两者的联用，综合其优点，克服其不足。优点，克服其不足。动物性食品中卡巴氧标示残留物检测方法动物性食品中卡巴氧标示残留物检测方法HPLC动物性食品中硝基咪唑类药物残留检测方法动物性食品中硝基咪唑类药物残留检测方法HPLC动物性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测方法动
19、物性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测方法HPLC动物性食品中拉沙洛西钠残留检测方法动物性食品中拉沙洛西钠残留检测方法HPLC动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测方法动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测方法HPLC动物性食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法（鸡）动物性食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法（鸡）HPLC动物性食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法（鱼）动物性食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法（鱼）HPLC动物性食品中氯霉素残留检测方法（牛奶）动物性食品中氯霉素残留检测方法（牛奶）HPLC动物性食品中苯唑西林残留检测方法动物性食品中苯唑西林残留检测方法微生物法微生物法动物性食品中青霉素类抗生素残留检测
20、方法（鸡）动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法（鸡）微生物法微生物法动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法（牛奶）动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法（牛奶）微生物法微生物法动物性食品中苯唑西林残留检测方法（牛奶）动物性食品中苯唑西林残留检测方法（牛奶）纸色谱筛选法纸色谱筛选法 兽药残留的检验方法兽药残留的检验方法第二节第二节 食品中抗生素类食品中抗生素类兽药残留检验兽药残留检验l 四环素类抗生素的残留检验四环素类抗生素的残留检验l 氯霉素类抗生素的残留检验氯霉素类抗生素的残留检验l 磺胺类兽药残留检验磺胺类兽药残留检验l 硝基呋喃类兽药残留检验硝基呋喃类兽药残留检验四环素类抗生素的残留检
21、验四环素类抗生素的残留检验v 常用的四环素类常用的四环素类四环素、土霉素、金霉素等四环素、土霉素、金霉素等允许使用，最高残留有限量允许使用，最高残留有限量v 常用的测定方法常用的测定方法HPLC、TLC、ELISA等等v HPLC法测定四环素类兽药残留法测定四环素类兽药残留原理：原理：样品提取，微孔滤膜过滤，反相色谱柱样品提取，微孔滤膜过滤，反相色谱柱（ODS柱）分离，紫外检测器检测。柱）分离，紫外检测器检测。样品处理：样品处理：5%高氯酸提取、离心、过滤。高氯酸提取、离心、过滤。测定时流动相中加入测定时流动相中加入NaH2PO4，调节，调节pH=2.5，可，可改善分离度及峰形。改善分离度及峰
22、形。当当pHpI时，蛋白质以阳离子形式存在，高氯酸时，蛋白质以阳离子形式存在，高氯酸与之沉淀，离心除去。与之沉淀，离心除去。四环素类抗生素的残留检验四环素类抗生素的残留检验10-Mar-2008 18:14:01VAB 951370-2Time0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.50%0100080310-11MRM of 12 Channels ES+TIC1.00e51.931.2907-Apr-2008 11:11:49VAB 951std5Time0.501.001.502.002.503.003.504.
23、004.505.005.506.006.507.007.50%0100080407-5MRM of 12 Channels ES+TIC5.72e43.002.406.275.293.474.22（A）空白养殖虾样品）空白养殖虾样品（B）四种四环素类药物的养殖虾样品）四种四环素类药物的养殖虾样品定量方法定量方法：用系列标准品的浓度峰面积（峰高）绘制标准工作曲线，应该是一条通过原点的直线。0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M inutes0.000.050
24、.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M inutes0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M inutes05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()氯霉素类抗生素的残留检验氯霉素类抗生素的残留检验v 常用的氯霉素类（常用的氯霉素类（CAPs）氯霉素、无味氯霉素、乙酰氯霉素、氯
25、霉素、无味氯霉素、乙酰氯霉素、甲砜霉素、弗甲砜霉素甲砜霉素、弗甲砜霉素骨髓细胞、肝细胞毒性骨髓细胞、肝细胞毒性禁用，不得检出禁用，不得检出v 常用的测定方法常用的测定方法GC、HPLC、LC-MS、ELISA等等v 气相色谱法气相色谱法原理：原理：样品提取、净化、样品提取、净化、衍生化衍生化，毛，毛细管气相色谱柱分离，细管气相色谱柱分离，电子捕获电子捕获检测检测器检测。器检测。样品处理：样品处理：乙氰提取、离心乙氰提取、离心SPEC18柱净化柱净化-衍生化衍生化氯霉素类抗生素的残留检验氯霉素类抗生素的残留检验氯霉素类抗生素的残留检验氯霉素类抗生素的残留检验 LC-MS法检测（确认检验）法检测（
26、确认检验）原理：乙酸乙酯提取，浓缩后水解，原理：乙酸乙酯提取，浓缩后水解，固相萃取柱净化，固相萃取柱净化，LC-MS联用检测联用检测 GB-T 22338-2008 动物源性食品中氯霉动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定素类药物残留量测定磺胺类（磺胺类（SAs）兽药残留检验）兽药残留检验v 常用的磺胺类兽药常用的磺胺类兽药磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶啶、磺胺二甲基嘧啶对过敏反应者有致敏作用；积蓄有肝对过敏反应者有致敏作用；积蓄有肝肾毒性；还可影响造血系统肾毒性；还可影响造血系统我国规定残留限量我国规定残留限量0.1mg/kg磺胺类药物结构磺
27、胺类药物结构 基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺，基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺，具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物H2NSOONHRsulfonamide backboneRRR14 Hsulfanilamide(SAN)NSsulfathiazole(STZ)NOsulfisozole(SIZ)NOH3CCH3sulfisoxazole(SIX)sulfamethoxazole(SMX)NOCH3NOCH3CH3Sulfatroxazole(STX)NNsulfadiazine(SDZ)NNsulfamerazine(SMR)CH3NNCH3CH3su
28、lfamethazine(SMZ)or sulfadimidine(SDD)NNOCH3sulfamethoxypyridazine(SPMX)NNOCH3sulfameter(SME)NNOCH3sulfamonomethoxine(SMMX)NNH3COOCH3sulfadoxine(SD)Nsulfapyridine(SP)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine(SDMX)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine(SDMX)磺胺类药物的分子结构磺胺类药物的分子结构 磺胺类兽药残留检验磺胺类兽药残留检验v HPLC法测定磺胺类兽药残留法测定磺胺类兽药残留（最常用）
29、（最常用）原理：乙腈提取，正己烷萃取除脂，原理：乙腈提取，正己烷萃取除脂，加入正丙醇减压干燥，残留物用乙腈加入正丙醇减压干燥，残留物用乙腈溶解，氧化铝柱净化，加入正丙醇，溶解，氧化铝柱净化，加入正丙醇，减压干燥，流动相溶解，减压干燥，流动相溶解，HPLC紫外紫外检测器检测。检测器检测。磺胺类药物的磺胺类药物的HPLC法色谱条件法色谱条件常用反相柱分离，有常用反相柱分离，有C18、C8或者或者C4柱，柱，也用离子对色谱柱。也用离子对色谱柱。磺胺类药物在色谱柱上的保留值不仅受流磺胺类药物在色谱柱上的保留值不仅受流动相的极性影响，还会受磺胺类药物的解动相的极性影响，还会受磺胺类药物的解离形式的影响，
30、因此，流动相的离形式的影响，因此，流动相的pH值对色值对色谱分离的效果起重要作用。谱分离的效果起重要作用。磺胺类药物的磺胺类药物的HPLC法色谱条件法色谱条件流动相主要由乙睛流动相主要由乙睛-水，甲醇水，甲醇-水或者乙水或者乙睛睛-甲醇甲醇-水按不同比例组成，文献采用水按不同比例组成，文献采用乙醇乙醇-水系统。在以上流动相系统中加水系统。在以上流动相系统中加入适量乙酸或十二烷基磺酸钠（入适量乙酸或十二烷基磺酸钠（SDS）用于提高分离效率。用于提高分离效率。方法说明方法说明磺胺类最大吸收磺胺类最大吸收为为260nm280nm，检测，检测时选用时选用=270nm。样品极性较强，样品极性较强，70%
31、乙腈的极性要大于乙腈的极性要大于95%乙腈，洗脱效果更好。乙腈，洗脱效果更好。净化时用碱性氧化铝。净化时用碱性氧化铝。硝基呋喃类（硝基呋喃类（NFs）兽药残留检验）兽药残留检验v 概述概述硝基呋喃类及其代谢物可使动物癌变硝基呋喃类及其代谢物可使动物癌变和基因突变和基因突变禁用禁用，在动物性食品和饲料中，在动物性食品和饲料中不得检不得检出出常用常用ELISA、HPLC、LC-MS检测检测v HPLC法测定禽肉中法测定禽肉中呋喃唑酮呋喃唑酮原理：原理：样品与样品与C18柱柱填料研磨，混合装填料研磨，混合装柱，正己烷淋洗，乙酸乙酯洗脱，浓柱，正己烷淋洗，乙酸乙酯洗脱，浓缩，溶解，氧化铝柱净化，检测缩
32、，溶解，氧化铝柱净化，检测方法说明方法说明基质固相分散技术基质固相分散技术硝基呋喃类兽药残留检验硝基呋喃类兽药残留检验第三节第三节盐酸克伦特罗残留的检验盐酸克伦特罗残留的检验l 概述概述l 盐酸克伦特罗兽药残留的检验盐酸克伦特罗兽药残留的检验20世纪世纪70年代末年代末,美国等发达国家进行了盐酸克伦美国等发达国家进行了盐酸克伦特罗实用性开发研究工作特罗实用性开发研究工作,至至80年代年代,盐酸克伦特盐酸克伦特罗作为饲料添加剂被广泛应用到畜禽生产中。罗作为饲料添加剂被广泛应用到畜禽生产中。1996年年,我国一些大专院校、科研单位研究发现我国一些大专院校、科研单位研究发现,盐酸克伦特罗对动物具有盐
33、酸克伦特罗对动物具有加强脂肪分解加强脂肪分解,促进蛋促进蛋白质合成白质合成,实现动物营养再分配实现动物营养再分配,提高胴体瘦肉率提高胴体瘦肉率,加快动物生长加快动物生长等作用。养猪户在不改变管理模式、等作用。养猪户在不改变管理模式、不增加饲料投入、不提高蛋白质的前提下不增加饲料投入、不提高蛋白质的前提下,在育在育肥猪出栏前肥猪出栏前2530d投喂盐酸克伦特罗投喂盐酸克伦特罗,就能将瘦就能将瘦肉率提高肉率提高10%,育肥增重提高育肥增重提高10%12%,因此在因此在畜牧业生产中被大量使用。畜牧业生产中被大量使用。概概 述述概概 述述v 理化性质理化性质Clenbuterol，简称，简称CLB，-
34、兴奋剂兴奋剂溶解性：溶解性：易溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。易溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。化学性质稳定：化学性质稳定：瘦肉精化学性质稳定，不易破坏。瘦肉精化学性质稳定，不易破坏。172开始分解，经开始分解，经260油煎油煎5min才会破坏减半。口服后在胃才会破坏减半。口服后在胃肠吸收迅速，肠吸收迅速，10-20min起效，起效，2-3h血液浓度达到峰值，作血液浓度达到峰值，作用维持用维持5h左右，半衰期左右，半衰期25-39h，消除，消除5个半衰期（约个半衰期（约97%）需需5-8d。易在动物眼睛、毛发、肝、肺、肾等组织中蓄积。易在动物眼睛、毛发、肝、肺、肾等组织中蓄积。我国
35、食品中的限量：我国食品中的限量：马、牛肌肉马、牛肌肉0.1g/kg，肝、肾，肝、肾0.5g/kg，牛奶牛奶0.05g/kg。NH2ClClOHNHCH3CH3CH3概述概述v 药理性质和毒性药理性质和毒性曾用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛曾用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛后用于促进动物生长、提高瘦肉率后用于促进动物生长、提高瘦肉率人食用含人食用含CLB残留畜产品后的表现为残留畜产品后的表现为危害肝脏和肾脏。危害肝脏和肾脏。长期摄入可致染色长期摄入可致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。体畸变，诱发恶性肿瘤。概述概述v CLB检验、检疫现状检验、检疫现状1987年，欧盟、美国宣布禁止使用年，欧盟、美国宣布禁止
36、使用CLB作作兽用饲料添加剂兽用饲料添加剂目前，欧盟成员国已将目前，欧盟成员国已将CLB残留作为肉品残留作为肉品进口必检项目进口必检项目我国政府也于我国政府也于97年发文禁止在饲料中添加年发文禁止在饲料中添加使用使用CLBCLB残留量的检验残留量的检验v 感官检测感官检测 健康肉暗红色，肉质弹性好，无健康肉暗红色，肉质弹性好，无“出汗出汗”现象；现象；“问题肉问题肉”特别鲜红，脂肪非常薄，特别鲜红，脂肪非常薄，瘦肉纤维疏松，有瘦肉纤维疏松，有“出汗出汗”现象。现象。v ELISA法测定法测定 特异性强、灵敏度高、酶标板上一次可特异性强、灵敏度高、酶标板上一次可作多份样品检测；快速筛选方法。作多
37、份样品检测；快速筛选方法。GC-MS测定法测定法v 原理：原理：样品剪碎，高氯酸匀浆，超样品剪碎，高氯酸匀浆，超声波加热提取，异丙醇声波加热提取，异丙醇-乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取，浓缩，弱阳离子交换柱分离，洗脱，浓缩，弱阳离子交换柱分离，洗脱，浓缩后衍生化，测定浓缩后衍生化，测定GC-MS测定法测定法-样品处理样品处理v 提取：提取：肉样肉样-高氯酸匀浆高氯酸匀浆-超声波提取超声波提取-水 浴 加 热水 浴 加 热-冷 却 离 心 取 上 清冷 却 离 心 取 上 清-调调PH9.50.1-氯化钠、异丙醇氯化钠、异丙醇-乙酸乙酯乙酸乙酯提取提取-旋转水浴蒸发至近干旋转水浴蒸发至近干-Na2H
38、2PO4溶解溶解-过滤过滤-Na2H2PO4定容。定容。GC-MS测定法测定法-样品处理样品处理v净化和浓缩：净化和浓缩：离子交换柱离子交换柱-洗脱液洗脱液（乙醇乙醇-氨洗脱）氨洗脱）-氮气浓缩至干。氮气浓缩至干。v衍生化：衍生化：甲醇溶解残渣甲醇溶解残渣-浓缩至干浓缩至干-衍衍生剂生剂BSTFA-蒸干蒸干-甲苯定容，待用。甲苯定容，待用。标准系列同时衍生化。标准系列同时衍生化。GC-MS测定法测定法-说明说明1.肉要先绞碎成肉糜。肉要先绞碎成肉糜。2.该方法的检出限是该方法的检出限是0.5g/kg。3.0.1mol/L的高氯酸匀浆，超声波萃取，离心，的高氯酸匀浆，超声波萃取，离心，液液-液萃
39、取，效果好。液萃取，效果好。4.加入加入NaCl，液，液-液萃取时可防止乳化。液萃取时可防止乳化。5.衍生化前先净化，可以避免杂质衍生化，干衍生化前先净化，可以避免杂质衍生化，干扰测定。扰测定。美托洛尔HPLC测定法测定法v 原理：原理：样品提取、净化，乙醇样品提取、净化，乙醇-氨洗氨洗脱后浓缩，流动相定容后脱后浓缩，流动相定容后HPLC测定测定v样品处理：样品处理：提取、净化浓缩同提取、净化浓缩同GC-MS，不需要衍生化。，不需要衍生化。HPLC测定法测定法v方法说明：方法说明：1.该方法适用于各种食品以及肝、肾等组织该方法适用于各种食品以及肝、肾等组织及汤汁中瘦肉精的测定。及汤汁中瘦肉精的
40、测定。2.标准品要临用时新鲜配制，避光保存。标准品要临用时新鲜配制，避光保存。3.除除GC-MS和和HPLC法外，还可用法外，还可用ELISA法法进行筛选，再用上述方法确认。进行筛选，再用上述方法确认。酶联免疫法酶联免疫法 基于抗原抗体反应竞争性抑制进行测定基于抗原抗体反应竞争性抑制进行测定的。的。GB/T 5009.192-2003动物性食品中克伦动物性食品中克伦特罗残留量的测定特罗残留量的测定第三法第三法GC/MS法。法。u 基本原理：基本原理：微孔板包被有针对克伦特罗微孔板包被有针对克伦特罗IgG的抗抗体；的抗抗体；加入克伦特罗抗体，经过温育和洗涤后；加入酶标记物、加入克伦特罗抗体，经过
41、温育和洗涤后；加入酶标记物、标准或样品溶液，克伦特罗与酶标记物竞争与抗体结合；标准或样品溶液，克伦特罗与酶标记物竞争与抗体结合；没有连接的克伦特罗酶标记物在被洗涤除去；加入酶没有连接的克伦特罗酶标记物在被洗涤除去；加入酶底物底物和发色剂并且温育，结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝和发色剂并且温育，结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝色的产物，加入反应终止液使颜色有蓝转变为黄色。在色的产物，加入反应终止液使颜色有蓝转变为黄色。在450nm处比色测定处比色测定。酶联免疫法酶联免疫法竞争性酶联免疫吸附试验法测抗原的基本原理示意图竞争性酶联免疫吸附试验法测抗原的基本原理示意图酶联免疫法酶联免疫法 氯霉素检测
42、试剂盒氯霉素检测试剂盒u 组成：组成：微量测试孔；氯霉素标微量测试孔；氯霉素标准溶液；准溶液；10倍浓缩萃取稀释液；倍浓缩萃取稀释液；10倍浓缩洗涤液；氯霉素酶标记倍浓缩洗涤液；氯霉素酶标记物；底物溶液；反应终止液。物；底物溶液；反应终止液。主要试剂：主要试剂：氯霉素酶联免疫检测试剂盒。氯霉素酶联免疫检测试剂盒。酶联免疫法酶联免疫法主要仪器：主要仪器：简易的简易的萃取设备、氮吹仪萃取设备、氮吹仪、离心机、酶标分离心机、酶标分析仪。析仪。酶标仪酶标仪酶联免疫法酶联免疫法酶联免疫实验设计酶联免疫实验设计u 实验的关键操作：实验的关键操作：试剂盒的选择和准备；试剂盒的选择和准备；试样的处理（试样的处
43、理（同同GC-MS）；）；加样；加样；洗涤；洗涤；比色。比色。第四节第四节激素类兽药残留的检验激素类兽药残留的检验l 什么是激素：什么是激素：是生物体内特殊的腺体是生物体内特殊的腺体或组织产生的，直接分泌到体液中，通过或组织产生的，直接分泌到体液中，通过体液运送到特定的部位，从而引起特殊激体液运送到特定的部位，从而引起特殊激动作用的一群微量的有机化合物。动作用的一群微量的有机化合物。l兽药：兽药：同化激素同化激素和其他生长促进剂的简和其他生长促进剂的简称。称。激素作用激素作用 促进促进氨基酸氨基酸中中蛋白质生物合成蛋白质生物合成 促进促进肌肉肌肉变大变壮变大变壮 促进促进食欲食欲 促进促进骨骼
44、骨骼的生长的生长 刺激刺激骨髓骨髓，促进，促进红细胞红细胞的产生。的产生。分类分类l 按照来源：按照来源：动物激素和植物激素动物激素和植物激素l结构：结构：甾体（雄激素类、雌激素类、甾体（雄激素类、雌激素类、孕激素类）和非甾体类同化激素。孕激素类）和非甾体类同化激素。l 激素的危害：激素的危害：扰乱激素平衡，导扰乱激素平衡，导致内分泌相关肿瘤、生长缺陷、生育致内分泌相关肿瘤、生长缺陷、生育缺陷、性早熟、男性女性化、女性乳缺陷、性早熟、男性女性化、女性乳腺癌、卵巢癌等。腺癌、卵巢癌等。禁止禁止同化类激素在食品动物中同化类激素在食品动物中使用。使用。测试方法：测试方法：荧光分光光度计、荧光分光光度
45、计、GC、HPLC、GC-MS等。等。HPLC法测定禽肉中己烯雌酚残留法测定禽肉中己烯雌酚残留v 原理：原理：样品匀浆，甲醇提取，样品匀浆，甲醇提取，HPLC紫紫外检测器（外检测器（230nm）测定。）测定。v 样品提取：样品提取：肉样肉样-甲醇振荡提取、离心甲醇振荡提取、离心（重复（重复2次）次）-合并上层提取液合并上层提取液-过滤、备用过滤、备用v 方法说明：方法说明：甲醇可以使蛋白质的氢键发甲醇可以使蛋白质的氢键发生改变，蛋白质凝集，从而释放出药物。生改变，蛋白质凝集，从而释放出药物。谢谢 谢！谢！色谱法分类色谱法分类 气相色谱（气相色谱（流动相为气体）流动相为气体）液相色谱（液相色谱（
46、流动相为液体）流动相为液体）柱色谱柱色谱 纸色谱纸色谱 薄层色谱薄层色谱 吸附色谱吸附色谱 分配色谱分配色谱 离子交换色谱离子交换色谱 排阻色谱排阻色谱 流动相物态流动相物态流动相物态流动相物态固定相使用形式固定相使用形式分离过程机制分离过程机制色谱法分类（按固定相状态的不同）色谱法分类（按固定相状态的不同）流动相为气体流动相为气体（称为载气）称为载气）固定相为固体吸附剂固定相为固体吸附剂气相色谱气相色谱气固色谱气固色谱气液色谱气液色谱流动相为气体流动相为气体（称为载气）称为载气）固定相为液体固定相为液体流动相为液体流动相为液体（淋洗液）（淋洗液）固定相为固体吸附剂固定相为固体吸附剂。液相色谱
47、液相色谱液固色谱液固色谱液液色谱液液色谱流动相为液体流动相为液体（淋洗液）（淋洗液）固定相为液体固定相为液体按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱色谱法分类色谱法分类 (1)(1)气相色谱气相色谱：流动相为气体（称为载气）。流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱按分离柱不同可分为：填充柱色谱 毛细管柱色谱；毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱(2)(2)液相色谱液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。
48、按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。离子色谱离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同为固定相，不同pHpH值的水溶液为流动相。值的水溶液为流动相。(3)(3)其他色谱方法其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法比较简单的色谱方法凝胶色谱法凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱超临界色谱:CO2流动相。流动相。高效毛细管电泳高效毛细管电泳:九十年代快速发展、特九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。高效分析仪器。色谱法的特点色谱法的特点（1）分离效率高分离效率高 复
49、杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。（2 2）灵敏度高灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4 4）应用范围广应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处不足之处：被分离组分的定性较为困难。色谱分析理论基础色谱分析理论基础 色谱分离过程是在色谱柱内完成的。色谱分离过程是在色谱柱内完成的。气固气固(液固液固)色谱色谱的固定相的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂固
50、体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。对试样中各组分的吸附能力的不同。气固色谱气固色谱的分离机理的分离机理:吸附与脱附吸附与脱附的不断重复过程；的不断重复过程；气液气液(液液液液)色谱色谱的固定相的固定相:由由 担体和固定液所组成。担体和固定液所组成。固定液固定液对试样中各组分的对试样中各组分的溶解能力溶解能力的不同。的不同。气液色谱气液色谱的分离机理：的分离机理：气液气液(液液液液)两相间的反复两相间的反复多次分配多次分配过程。过程。1.1.气相色谱分离过程气相色谱分离过程 当试样由载气携带进入色当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附相溶解或
