1、胃癌胰岛素样生长因胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的子基因的印迹状态的检测检测 是一种在基因组是一种在基因组DNA水平对双水平对双亲等位基因特异性的修饰作用。结亲等位基因特异性的修饰作用。结果导致来自果导致来自不同性别亲本不同性别亲本（父母）（父母）的同源染色体上等位基因存在功能的同源染色体上等位基因存在功能上的差异。上的差异。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测2驴马正反杂交实验结果驴马正反杂交实验结果公驴公驴 母马母马 公马公马 母驴母驴 骡骡 駃騠駃騠 胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测3 基因组印迹现象最早由基因组印迹现象最早由Helen Crouse于于1960年在昆虫研
2、究中首次提出。年在昆虫研究中首次提出。Sciara昆虫的两条昆虫的两条X染色体染色体胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测4 1980年，年，Cattanach等人发现，具等人发现，具有两条有两条母源母源11号染色体号染色体的小鼠在胚胎的小鼠在胚胎期比正常小鼠小，而具有两条期比正常小鼠小，而具有两条父源父源11号染色体号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠的小鼠在胚胎期比正常小鼠大。但是，这两种小鼠胚胎都无法正大。但是，这两种小鼠胚胎都无法正常发育而死于发育阶段。常发育而死于发育阶段。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测5 1984年，年，McCrath等人用等人用的方法产生了两种特殊类型的小
3、鼠的方法产生了两种特殊类型的小鼠胚胎：一种小鼠胚胎的全套染色体全部胚胎：一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自来自雄性亲本雄性亲本，另一种小鼠胚胎的全套，另一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自染色体全部来自雌性亲本雌性亲本。但两类小鼠。但两类小鼠均在发育期死亡。均在发育期死亡。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测6 1991年，年，Dechiara等人做了小鼠等人做了小鼠IGF-2剔除基因的实验，首次证明了生物体本身剔除基因的实验，首次证明了生物体本身带有基因组印迹基因。带有基因组印迹基因。实验发现，敲除实验发现，敲除父源父源IGF-2等位基因小等位基因小鼠发育成成体个体小，但若剔除的等位基鼠发育成
4、成体个体小，但若剔除的等位基因来自母源，动物的个体没有变化。因来自母源，动物的个体没有变化。直至直至1993年，年，Feinberg实验室首次发现实验室首次发现了基因组印迹也存在于人类。了基因组印迹也存在于人类。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测7 IGF-2作为印迹基因，在正常人群作为印迹基因，在正常人群里，只有里，只有父系的等位基因父系的等位基因表达，母系表达，母系的等位基因则处于静止状态。的等位基因则处于静止状态。约有约有40%的患者肿瘤组织中发的患者肿瘤组织中发现有现有。这种静止的基因被重新活化表达的现这种静止的基因被重新活化表达的现象，称作象，称作LOI（Loss of imp
5、rinting）。）。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测8 胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测9胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测10 结肠癌患者也可检测到结肠癌患者也可检测到IGF-2的的LOI现象，而且这种现象不仅存在于癌组织，现象，而且这种现象不仅存在于癌组织，也存在于癌旁组织和病人的血细胞中。也存在于癌旁组织和病人的血细胞中。由此被认为这种现象很可能成为该病早由此被认为这种现象很可能成为该病早期诊断的指标。期诊断的指标。此外，已经发现与基因组印迹异常此外，已经发现与基因组印迹异常有关的肿瘤还有肝癌、卵巢癌、有关的肿瘤还有肝癌、卵巢癌、肺癌、神经胶质瘤、前列腺癌等等。肺
6、癌、神经胶质瘤、前列腺癌等等。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测11 目前已经被证实与人类肿瘤发目前已经被证实与人类肿瘤发生相关的印迹基因除生相关的印迹基因除IGF-2外，还外，还有有WT1、P57KIP2、P73、NOEY2以以及及M6P/IGF-2R等等。等等。http:/http:/ 胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测121、DNA水平筛选杂合子水平筛选杂合子2、RNA水平观察杂合性是否完整水平观察杂合性是否完整胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测13：GGGCC|C G GCCC C|CCGGG C CGGG胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测14即该序列在人群中存
7、在即该序列在人群中存在SNP：等位基因等位基因a 5-GGGCCC-3等位基因等位基因b 5-GTGCCC-3 人群中将形成三种基因型：人群中将形成三种基因型：GG TT GT 胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测15可以通过PCR产物酶切后电泳的方法完成GG TT GT236 bp173 bp63 bp胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测16可以通过杂合子RT-PCR产物酶切后电泳的方法完成236 bp173 bp63 bp正常正常(印记印记)正常正常 LOI胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测17一、实验安排一、实验安排内容内容contentclass period1基因组DN
8、A提取genomic DNA extraction42RNA提取RNA extraction43聚合酶链式反应技术 RT-PCR44电泳检测及基因型分析electrophoresis and genotype analysis4胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测18实验一实验一 基因组基因组DNA的提取的提取【基本原理】【基本原理】常规酚常规酚/氯仿抽提法提取基因组氯仿抽提法提取基因组DNADNA的原理的原理在于用蛋白裂解液和蛋白酶将组织充分消化后，在于用蛋白裂解液和蛋白酶将组织充分消化后，再应用酚再应用酚/氯仿将蛋白质变性，而核酸则溶于氯仿将蛋白质变性，而核酸则溶于水相，再在一定浓度的
9、盐和无水乙醇的作用下水相，再在一定浓度的盐和无水乙醇的作用下将核酸从水相中析出。将核酸从水相中析出。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测19【器材】【器材】1 1电子天平；电子天平；2 2匀浆器；匀浆器；3 3EP EP 管管 ；4 4冰盒；冰盒；5 5手套；手套；6 6高速离心机高速离心机【试剂】【试剂】1 1酚；酚；2 2氯仿；氯仿；3 3无水乙醇；无水乙醇；4 475%75%乙醇；乙醇；5 5纯水纯水胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测20【操作步骤】【操作步骤】胃癌组织胃癌组织洗涤洗涤200ul PBS离心离心8000rpm 5min消化消化180ul TE,20 ul 10%
10、SDS3 ul 蛋白酶蛋白酶K,50 2h弃上清弃上清留留100 ul酚提取酚提取300 ul 酚酚离心离心10000rpm 10min移水相移水相至新管至新管酚、氯仿抽取酚、氯仿抽取150 ul 酚酚150ul 氯仿氯仿离心离心10000rpm 10min移水相移水相至新管至新管沉淀沉淀DNA1/10 V NaAC(30 ul)2V 乙醇乙醇(600ul)离心离心10000rpm 5min洗洗DNA75%乙醇乙醇 300 l弃上清弃上清离心离心8000 rpm 5min弃上清弃上清干燥干燥溶解溶解DNA适量适量TE胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测21实验二实验二 组织总组织总RNA的
11、提取的提取【基本原理】【基本原理】组织中的组织中的RNARNA主要分布在胞浆中，包括主要分布在胞浆中，包括mRNAmRNA、tRNA tRNA 和和 rRNA rRNA 三种。三种。mRNA mRNA 含量最低，半衰期短，含量最低，半衰期短，易于降解。在易于降解。在 RNA RNA 的提取过程中，主要采用强变的提取过程中，主要采用强变性剂，如异硫氰酸胍等破坏细胞结构，失活性剂，如异硫氰酸胍等破坏细胞结构，失活RNARNA酶。酶。细胞碎片、蛋白质等经酚、氯仿等有机溶剂抽提细胞碎片、蛋白质等经酚、氯仿等有机溶剂抽提被去除。真核生物中被去除。真核生物中18S rRNA18S rRNA、28S rRN
12、A 28S rRNA 经琼脂经琼脂糖电泳后，在紫外灯下可观察到两条清晰的条带。糖电泳后，在紫外灯下可观察到两条清晰的条带。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测22 RNARNA提取关键提取关键:防止内源性和广泛存在的外源性防止内源性和广泛存在的外源性RNARNA酶，如器皿、试剂和手上等存在的酶，如器皿、试剂和手上等存在的RNARNA酶对核酸的降解作用，所用材料、酶对核酸的降解作用，所用材料、器皿均需经器皿均需经DEPCDEPC处理（包括处理（包括0.1%0.1%溶溶液浸泡过夜，蒸馏水冲洗及高压灭液浸泡过夜，蒸馏水冲洗及高压灭菌菌15 min15 min去除残存的去除残存的DEPCDEPC）
13、。）。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测23【器材】【器材】1 1电子天平；电子天平；2 2匀浆器；匀浆器；3 3EP EP 管管 ；4 4冰盒；冰盒；5 5手套；手套；6 6低温冷冻高速离低温冷冻高速离心机心机【试剂】【试剂】1 1TRIzolTRIzol试剂（试剂（Invitrogen/GIBCO Invitrogen/GIBCO BRLBRL）；）；2 2氯仿；氯仿；3 3异丙醇；异丙醇；4 475%75%乙醇；乙醇；5 50.1%DEPC0.1%DEPC处理水处理水胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测24实验三实验三 反转录聚合酶链反应反转录聚合酶链反应(RT-PCR)【基本
14、原理】【基本原理】PCRPCR是体外扩增是体外扩增DNADNA的方法，但不能直接以的方法，但不能直接以RNA RNA 为模板扩增。利用反转录酶（为模板扩增。利用反转录酶（RTaseRTase），可由），可由 mRNA mRNA 生成生成cDNAcDNA（第一链）。以此（第一链）。以此 cDNA cDNA 为模板即可进行为模板即可进行 RNA RNA 的的 PCR PCR扩增。如果在扩增。如果在 PCR PCR 反应中，除加入待反应中，除加入待扩增的特异基因的引物外，再加入常用的扩增的特异基因的引物外，再加入常用的 -actin actin 或或GAPDH GAPDH 引物作为内参基因扩增，则可
15、对特引物作为内参基因扩增，则可对特异基因的转录水平进行半定量分析。异基因的转录水平进行半定量分析。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测26RT-PCR的原理的原理胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测27【器材】【器材】1 1PCRPCR扩增仪；扩增仪；2 2恒温水浴箱；恒温水浴箱；3 3紫外灯检测紫外灯检测仪；仪；4 4EP EP 管；管；5 5手套手套【试剂】【试剂】1 1特异基因引物特异基因引物 上游引物：上游引物：5CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG 3 下游引物：下游引物：5CCTCCTTTGGTCTTACTGGG 32 2RT-PCRRT-PCR试剂盒试剂盒(Tak
16、ara (Takara 公司公司)胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测28【操作步骤】【操作步骤】一、反转录反应一、反转录反应1.在在EP 管中加入以下反应液管中加入以下反应液5 RNA PCR Buffer4.0 lMgCl24.0 lRNase Free dH2O5.5 ldNTP Mixture(10 mM each)2.0 lRNase Inhibitor0.5 lAMV Reverse Transcriptase1.0 lOligo dT-Adaptor Primer 1.0 lRNA 样品样品(1ug total RNA)2.0 l总反应体系总反应体系20 l胃癌胰岛素样生长因
17、子基因的印迹状态的检测292.按以下条件进行反转录反应按以下条件进行反转录反应30 C10 min50 C20 min99 C5 min5 C5 min胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测30二、二、PCR反应反应1.取上液取上液10 l 加入加入P 管中，再加入下列试剂，混匀后，放入管中，再加入下列试剂，混匀后，放入PCR 扩增仪中进行扩增，然后用电泳鉴定扩增仪中进行扩增，然后用电泳鉴定PCR产物产物(10 l)。5 RNA PCR Buffer(含含MgCl2)灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水TaKaRa TaqTM 上游引物上游引物下游引物下游引物总反应体系总反应体系10.00 l28.75 l
18、0.25 l0.50 l0.50 l50.00 l胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测312.按以下条件进行按以下条件进行PCR反应反应94 C5 min1个循环个循环94 C45 sec30个循环个循环55 C45 sec72 C45 sec72 C7 min延伸延伸胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测32实验四实验四 限制性酶切限制性酶切及电泳检测及电泳检测一、限制性酶切一、限制性酶切【基本原理】【基本原理】SNPSNP的存在导致限制性酶切位点发生改变。的存在导致限制性酶切位点发生改变。根据根据IGF2IGF2基因第基因第9 9外显子具有限制性核酸内切酶外显子具有限制性核酸内切酶A
19、paIApaI位点多肽性的特点，位点多肽性的特点，RT-PCRRT-PCR产物行产物行ApaIApaI消化，消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行印迹丢失检测。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行印迹丢失检测。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测33【器材】【器材】1 1恒温水浴箱；恒温水浴箱；2 2EP EP 管；管；3 3手套手套【试剂】【试剂】1 1ApaIApaI限制性内切酶；限制性内切酶；2 21010L bufferL buffer；3.3.纯水纯水胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测34【操作步骤】【操作步骤】ApaI2 ul10L buffer4 ul水水 24ulPCR产物产物1
20、0 ul总反应体系总反应体系40 ulRT-PCR产物酶切产物酶切体系：体系：37水浴水浴摇床摇床过夜过夜 1.限制性内切酶消化限制性内切酶消化 2.电泳检测电泳检测 酶切产物酶切产物10 ul与电泳上样缓冲液充分混合，在与电泳上样缓冲液充分混合，在40mA电流电流 下，下，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察杂合子情况。琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察杂合子情况。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测35一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳【基本原理】【基本原理】琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA DNA 片段的常用方法。片段的常用方法。DNADNA分子在高于
21、其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。移动。DNA DNA 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。对于线性还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。对于线性 DNA DNA 分分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭在凝胶中加入少量溴化乙锭(EB)(EB)，其分子可插入，其分子可插入 DNA DNA的碱基的碱基之间，因此可在紫外灯下直接观察到之间，因此可在紫外灯下直
22、接观察到 DNA DNA 片段在凝胶上的位片段在凝胶上的位置，并可在紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。置，并可在紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测36线状线状DNA片段分离的有效范围与片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分浓度（琼脂糖凝胶的百分浓度（%）线状线状DNA分子的有效范围（分子的有效范围（Kb）0.3 605 0.6 201 0.7 100.8 0.9 70.5 1.2 60.4 1.5 40.2 2.0 30.1胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测37【器材】【器材】1 1水平电泳槽；水平电泳槽；2
23、2电泳仪；电泳仪；3 3紫外透射仪或凝胶成紫外透射仪或凝胶成像系统像系统【试剂】【试剂】1 11%1%琼脂糖；琼脂糖；2 2电泳缓冲液电泳缓冲液(1(1TBE)TBE)；3 310 mg/ml 10 mg/ml 溴化乙锭溴化乙锭(EB)(EB)；4 4电泳样品上样缓冲液电泳样品上样缓冲液(6(6)：0.25%0.25%溴酚蓝，溴酚蓝，0.25%0.25%二二甲苯腈，甲苯腈，40%40%（W/VW/V）蔗糖水溶液，在）蔗糖水溶液，在4 40 0C C 保存。保存。胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测381琼脂糖琼脂糖0.2 g，加电泳缓冲液，加电泳缓冲液(1TBE)20 ml，加，加热熔化。
24、热熔化。2胶液冷至胶液冷至50 C 时，加时，加EB 2 l，小心混匀，缓慢倒，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。入制胶模具中，在胶一端插上梳子。3待胶凝固后，拨出梳子，将胶凝置于电泳槽中，加待胶凝固后，拨出梳子，将胶凝置于电泳槽中，加入入1TBE，让液面高于胶面，让液面高于胶面2 3 mm。4在在 DNA 样品中加入样品中加入 2上样缓冲液并混匀，将上样缓冲液并混匀，将DNA 样品胶凝的样品孔中。样品胶凝的样品孔中。5电泳槽与电源接通后，电泳槽与电源接通后，DNA 样品开始电泳。样品开始电泳。6根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源，取出凝胶，用紫外透射仪或凝胶成像系统对源，取出凝胶，用紫外透射仪或凝胶成像系统对DNA进行观察或拍照。进行观察或拍照。【操作步骤】【操作步骤】胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测39胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测40
