1、免疫酶组织化学技术专免疫酶组织化学技术专业知识讲座业知识讲座非标记抗体免疫酶法非标记抗体免疫酶法(1969 Sternberger Sternberger)一、酶桥法（抗酶抗体法）二、PAP法 (1970Sternkerger 1970Sternkerger 等）等）三、双PAP法（1975Vaeca 1975Vaeca 等）等）四、APAAP多聚螯合物酶法多聚螯合物酶法2免疫酶组织化学技术专业知识讲座非标记抗体免疫酶法非标记抗体免疫酶法 Sternberger Sternberger（19691969）在酶标抗体法的基）在酶标抗体法的基础上，创建了础上，创建了非标记抗体免疫酶技术非标记抗体免
2、疫酶技术。酶标抗体，酶与抗体的结合可损害部分酶标抗体，酶与抗体的结合可损害部分抗体和酶的活性，从而降低了抗体的效价。抗体和酶的活性，从而降低了抗体的效价。另外，血清中的非特异性抗体也可以被另外，血清中的非特异性抗体也可以被酶标记，这些非特异酶标记抗体与组织中酶标记，这些非特异酶标记抗体与组织中相应抗原结合，放大了非特异背景染色。相应抗原结合，放大了非特异背景染色。3免疫酶组织化学技术专业知识讲座非标记抗体免疫酶法非标记抗体免疫酶法 先用酶（先用酶（HRP HRP 或或AKPAKP）去免疫动物（羊、兔）去免疫动物（羊、兔和鼠等），使其产生高效价、特异性的和鼠等），使其产生高效价、特异性的抗抗酶抗
3、体酶抗体，再将该，再将该抗酶抗体与酶结合抗酶抗体与酶结合，形成，形成五环的复合物，五环的复合物，没有一个抗体受到共价键没有一个抗体受到共价键的标记的标记，保留了免疫活性，相对分子质量，保留了免疫活性，相对分子质量较小，对细胞的穿透性好。较小，对细胞的穿透性好。4免疫酶组织化学技术专业知识讲座一、酶桥法一、酶桥法 原理：原理：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。反应层次（四步法）：反应层次（四步法）：抗原第一抗体 第二抗体（桥抗体）抗酶抗体 HRP DAB+H2O2 有色沉淀物 5免疫酶组织化学技
4、术专业知识讲座酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP底物酶桥法酶桥法6免疫酶组织化学技术专业知识讲座酶桥法酶桥法 注意点 第一步 桥抗体必须对特异性抗体（一抗）、抗酶抗体，均具特异性，才能连接两者 抗原特异性抗体、抗酶抗体由同一种属动物产生 第二步 桥抗体应过量，当与特异性一抗结合后，仍有剩余的抗原结合位点，使结合抗酶抗体，最后使酶通过免疫学原理与抗酶抗体结合7免疫酶组织化学技术专业知识讲座酶桥法酶桥法 特点 用抗酶抗体 采用免疫反应原理（避免化学交联对酶抗体活性的影响）一抗与抗酶抗体为同一种动物 二抗作为桥抗体连接二种IgG（同种动物）优点 对酶活性及抗体效价影响小 非特异
5、性染色比间接法轻 提高了灵敏度 缺点 手续较多，时间长 8免疫酶组织化学技术专业知识讲座染色步骤染色步骤 1 1）4 4）同酶标抗体直接法。）同酶标抗体直接法。5 5）适当稀释的特异性一抗（例如来自种属）适当稀释的特异性一抗（例如来自种属A)A)37 37 孵育孵育60min 60min 或或44过夜，过夜，PBS PBS 洗洗3 3 3min3min。6 6）第二抗体（也称桥抗体，抗种属）第二抗体（也称桥抗体，抗种属A A 的的IgG IgG 抗体）抗体）37 37 孵育孵育40min40min，PBSPBS洗洗3 3 3min3min。7 7）抗酶抗体（来自种属）抗酶抗体（来自种属A)37
6、 A)37 孵育孵育40min40min，PBS PBS 洗洗3x3min3x3min。8 8）酶（）酶（HRP 70HRP 70 100100 g/mlg/ml，PBS PBS 溶解）溶解）37 37 孵育孵育40min40min，PBS PBS 洗洗3x3min3x3min。9 9）显色复染同酶标抗体直接法。）显色复染同酶标抗体直接法。因该方法比因该方法比PAP PAP 法麻烦，现已被法麻烦，现已被PAP PAP 法所取法所取代，故很少应用。代，故很少应用。9免疫酶组织化学技术专业知识讲座二、PAP法 酶桥法虽克服了酶标记抗体法的某些缺点，酶桥法虽克服了酶标记抗体法的某些缺点，有效地保护了
7、抗体及酶的活性，但抗酶抗体有效地保护了抗体及酶的活性，但抗酶抗体必须高度纯化，否则将降低其敏感性。必须高度纯化，否则将降低其敏感性。一是由于抗酶抗体血清中含有高亲和力和低一是由于抗酶抗体血清中含有高亲和力和低亲和力两种抗酶抗体亲和力两种抗酶抗体 抗酶抗体血清中的非特异性抗体虽不能与酶抗酶抗体血清中的非特异性抗体虽不能与酶结合，但能与第二抗体（桥抗体）结合，从结合，但能与第二抗体（桥抗体）结合，从而减少了抗酶抗体的结合，也影响到方法的而减少了抗酶抗体的结合，也影响到方法的敏感性。敏感性。10免疫酶组织化学技术专业知识讲座PAP法 Sternkerger Sternkerger 等（等（1970
8、1970）在此基础上进行了改良）在此基础上进行了改良，建立了，建立了辣根过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法辣根过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法 原理：抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP复合物 步骤：三步法 将酶桥法的第，步合并为，用复合物代替 现将抗酶抗体和酶可溶性酶复合物 常用事先制备好的PAP进行免疫酶染色 故称PAP法（现有试剂：鼠、兔、羊PAP）11免疫酶组织化学技术专业知识讲座组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP底物PAP法12免疫酶组织化学技术专业知识讲座PAP法 酶与抗体的比例 个酶分子与个抗酶抗体结合形成亚单位构成环形体 优点 抗原稍过量，所有的抗HRP 抗体均参与形
9、成可溶性PAP 复合物 敏感性高 背景着色低（PAP 为复合物，不存在游离免疫球蛋白）步骤简化（染色）缺点 PAP 制备复杂，步骤多，时间长 13免疫酶组织化学技术专业知识讲座 染色步骤染色步骤1）4m 石蜡切片58 烤片4h，切片常规脱蜡至水。2）蛋白酶消化或AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。3）0.3%H2O2 处理切片20min（室温），PBS 洗3min2次4）3正常动物血清处理切片30min（室温），吸去多余血清，不洗。5）适当稀释的特异性一抗孵育（4 过夜或37 60min)，PBS洗3min3 次6）滴加桥抗体（二抗），37 孵育40min，PBS 洗3min3
10、。7）适当稀释的PAP 复合物（要求与特异性一抗同一种属）37 孵育40min。8）PBS 洗3min 3。9）0.04%DAB-0.03%H2O2显色812min。10）水洗、复染、脱水、树胶封片，结果观察 注：根据具体情况可省略2）、3）步骤。14免疫酶组织化学技术专业知识讲座三、双PAP法 原理：Vaeca Vaeca 等（等（19751975）建立了双）建立了双PAP PAP 法法（double bridge PAP methoddouble bridge PAP method），其基本，其基本原理是在原理是在PAP PAP 法的基础上法的基础上重复第二抗体和重复第二抗体和PAP PA
11、P 复合物复合物，重复的连接抗体重复的连接抗体和和PAP PAP 复合复合物可能有两种连接方式物可能有两种连接方式 抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP-第二抗体-PAP复合物15免疫酶组织化学技术专业知识讲座组织抗原第一抗体第二抗体PAP复合物HRP双PAP法第一种第一种重复连接抗体与重复连接抗体与特异性一抗分子上未特异性一抗分子上未饱和的饱和的Fc Fc 段相结合段相结合，第一抗体上结合了更多的，第一抗体上结合了更多的桥抗体和桥抗体和PAP PAP 复合物。复合物。16免疫酶组织化学技术专业知识讲座双PAP法双PAP法组织抗原第一抗体第二抗体PAP复合物HRP第二种第二种重复连接抗
12、体可重复连接抗体可与与一个一个PAPPAP 中的中的抗抗HRP HRP 抗体抗体上未饱和的上未饱和的FcFc段结合段结合，再与，再与后加的后加的PAP PAP 复合物相结合复合物相结合17免疫酶组织化学技术专业知识讲座双PAP法 步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特异背景重 其染色步骤是在单PAP 法步骤18）的基础上重复68）步，然后继续以下操作。9）常规DAB-H2O2显色。10）水洗、复染、脱水、封片。注：根据具体情况可省略2）、3）步骤。18免疫酶组织化学技术专业知识讲座四、APAAP法 免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷酸酶
13、（酸酶（AKP AKP 或或APAP）取代）取代HRP HRP 来显示结果的来显示结果的免疫酶组织化学技术。免疫酶组织化学技术。1983 1983 年年MosonMoson及及MoirMoir等建立了等建立了碱性磷酸酶碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP(APAAP）复合物法）复合物法。19免疫酶组织化学技术专业知识讲座APAAP法21免疫酶组织化学技术专业知识讲座APAAP法 注意点（同PAP 法）一抗与第三抗必须来源于同一种属动物 二抗必须过量 优点 ALP 免疫组化染色，不受内源性过氧化物酶干扰，处理内源性ALP 较易 红色易与色素颗粒区别（用坚牢红时）应用 含丰富内源性过氧化
14、物酶的冷冻切片的首选方法（淋巴组织、肿瘤组织）皮肤病理学中应用，可与黑色素相区别 22免疫酶组织化学技术专业知识讲座多聚螯合物酶法 许多年来，很多研究者都在努力使许多年来，很多研究者都在努力使IHC IHC 方方法更敏感、更稳定、更简单，要求多步检法更敏感、更稳定、更简单，要求多步检测系统简化，但敏感性要进一步提高，使测系统简化，但敏感性要进一步提高，使这一技术面临巨大的挑战。这一技术面临巨大的挑战。一种新的一种新的多聚赘合物酶二步法多聚赘合物酶二步法在在1995 1995 年被年被隆重推出，该方法与简单的二步法相比较隆重推出，该方法与简单的二步法相比较，具有很高的敏感性、稳定性和特异性。，具
15、有很高的敏感性、稳定性和特异性。23免疫酶组织化学技术专业知识讲座多聚螯合物酶法 HRP-多聚螯合物-抗体 以碳为骨架 以多聚糖 以氨基酸类为骨架主要用于主要用于PowerVision PowerVision 法，法，它可以折叠，其它可以折叠，其复合物颗粒小于复合物颗粒小于EnVision EnVision 试剂，试剂，其敏感性好于其敏感性好于EnVision EnVision 法。法。主要用于主要用于UIP UIP（universal universal immunoperoxidase immunoperoxidase polymer polymer）法，其敏）法，其敏感性基本与感性基本与
16、PowerVision PowerVision 法相同。法相同。24免疫酶组织化学技术专业知识讲座多聚螯合物酶法25免疫酶组织化学技术专业知识讲座多聚螯合物酶法 一、一、EPOS法法 Enhanced polymer one-step staining 原理：以具有惰性的多聚螯合物（葡聚糖原理：以具有惰性的多聚螯合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体和）为骨架，将特异性抗体和HRP结合在一结合在一起，形成特异性起，形成特异性EPOS试剂，一步法完成试剂，一步法完成26免疫酶组织化学技术专业知识讲座EPOS法法 原理：形成形成HRP-HRP-多聚化合物多聚化合物-特异性抗体特异性抗体巨大复合物巨大复
17、合物，该复合物内不含第二抗体及，该复合物内不含第二抗体及亲和素，染色时，只需在组织切片上加入亲和素，染色时，只需在组织切片上加入相应的相应的酶标记特异性抗体酶标记特异性抗体EPOS EPOS 试剂试剂，孵育，孵育3030 6060min min 即可完成。勿需再加酶标记第二即可完成。勿需再加酶标记第二抗体抗体27免疫酶组织化学技术专业知识讲座EPOS法法组织抗原一抗HRP多聚骨架28免疫酶组织化学技术专业知识讲座 EPOS EPOS 法操作流程如下。法操作流程如下。1 1）石蜡切片常规脱蜡至水，）石蜡切片常规脱蜡至水，PBS PBS 洗洗3min3min 3 3 次。次。2 2）蛋白酶消化或抗
18、原修复（）蛋白酶消化或抗原修复（AR)AR)，PBS PBS 洗洗3minx3 3minx3 次。次。3 3）0.3 0.3 过氧过氢（过氧过氢（H H2 2O O2 2）处理）处理5min5min。4 4）蒸馏水洗，置于）蒸馏水洗，置于PBS PBS 中洗中洗5min5min。5 5）加入相应的）加入相应的Dako EPOS/HRP Dako EPOS/HRP 试剂，室温试剂，室温孵育孵育3030 60min60min。6 6）PBS PBS 洗洗3min 3min 3 3 次。次。7 7）0.04%DAB-0.03%H0.04%DAB-0.03%H2 2O O2 2 显色显色8 8 12m
19、in12min。8 8）水洗，复染，常规树胶封片。）水洗，复染，常规树胶封片。29免疫酶组织化学技术专业知识讲座EPOS法法 步骤：一步法 特点：目前最简便的方法，快速，特异性强，基本无背景染色，敏感性高 但商品化种类不全，价格昂贵30免疫酶组织化学技术专业知识讲座二、EnVision法（ELPS法）Enhanced Labelled Polymer System 原理：抗原抗体反应结合后，抗原抗体反应结合后，第二抗体上第二抗体上标记有多聚化合物（葡聚糖）酶复合物（标记有多聚化合物（葡聚糖）酶复合物（EnVision EnVision 复合物）复合物），与第一抗体结合，进与第一抗体结合，进而由酶作用底物进行显色定位。而由酶作用底物进行显色定位。31免疫酶组织化学技术专业知识讲座组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步32免疫酶组织化学技术专业知识讲座ELPS法 特点：敏感性高：（1 mol复合物中含70mol HRP和10 mol第二抗体）特异性强：复合物内无内源性多聚化合的 干扰 缺点：最大的缺点是葡聚糖骨架不能折叠，聚合物颗粒大，易形成空间位阻，细胞膜或核膜穿透较困难，影响方法的敏感性，有时会出现染色不均一。干扰。33免疫酶组织化学技术专业知识讲座谢谢34免疫酶组织化学技术专业知识讲座
