1、免疫电泳技术免疫电泳技术 1953年和将凝胶扩散置于直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合，从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、及免疫固定电泳等新方法。一、免疫电泳技术的发展一、免疫电泳技术的发展琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术。(K)1电泳优点 （1）将蛋白电泳分开 （2）加快反应速度 2沉淀反应 （一）免疫电泳技术的定义（一）免疫电泳技术的定义二、免疫电泳技术的相关概念二、免疫电泳技术的相关概念免疫电泳免疫电泳分析分析 蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团，在一定值条件下，使蛋白质分子带正电荷或负
2、电荷。在电场中，带正电荷的粒子向负极移动，而带负电荷的粒子向正极移动，由于各种蛋白质迁移率不同而分为不同的区带。（二）电泳的基本原理及其影响因素（二）电泳的基本原理及其影响因素I I基本原理基本原理 电泳（）:带电颗粒在电场中通过液体介质的移动，称为电泳。1.1.颗粒（蛋白）本身特性：两性、大小、形状颗粒（蛋白）本身特性：两性、大小、形状2.2.载体性质载体性质：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶 3.3.电场强度电场强度 4.4.溶液值及离子强度溶液值及离子强度缓冲液的作用缓冲液的作用 最适电泳缓冲液最适电泳缓冲液0.05M0.05M，8.6 8.6 巴比妥缓冲液
3、巴比妥缓冲液.电泳的影响因素电泳的影响因素5.5.电渗（主要与载体特性有关）电渗（主要与载体特性有关）电渗定义电渗定义 电渗方向与电泳方向的关系电渗方向与电泳方向的关系J J 电泳迁移率：指在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。电泳迁移率：指在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。6.6.电源电源定定 义：区带电泳义：区带电泳 +免疫双扩散免疫双扩散(K)(K)基本原理：在电场作用下，将标本于琼脂凝胶中进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂板旁挖一长形槽，加入相应基本原理：在电场作用下，将标本于琼脂凝胶中进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂板旁挖一长形槽，加入相应抗血清，抗
4、体呈直线扩散，电泳分离后的各种抗原呈放射状扩散，反应生成弧状沉淀抗血清，抗体呈直线扩散，电泳分离后的各种抗原呈放射状扩散，反应生成弧状沉淀线。线。1.1.免疫电泳免疫电泳三、介绍几种经典的免疫电泳技术三、介绍几种经典的免疫电泳技术免疫电泳将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原彼此分离。撤去电压，在与电泳方向平行的琼脂打槽并加入相应抗体进行双向免疫分散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成弧形沉淀线。据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较，据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。
5、即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。(K)免疫电泳操作步骤：免疫电泳操作步骤：技术评价：技术评价：（1）量及单克隆性与沉淀线致密度关系（2）量与抗体槽距离之间的关系：抗原抗体最适比关系结查分析（结查分析（K）血清蛋白的分析，如多发性骨髓瘤、r 球蛋白缺乏症应用：应用：2.2.对流免疫电泳对流免疫电泳定义：定向加速度的免疫双扩散技术（定义：定向加速度的免疫双扩散技术（K K）对流免疫电泳示意图对流免疫电泳示意图在8.0的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色
6、沉淀线。电渗：指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。电渗：指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。出现沉淀线洗涤、染色、分析结果对流免疫电泳操作步骤：对流免疫电泳操作步骤：制琼脂板打孔加样电泳AbAg技术评价：技术评价：可用于乙肝病人血清鉴定；甲胎蛋白的测定，但近年多以替代。应用：应用：定义：加速度的单向扩散（定义：加速度的单向扩散（J J）3.3.火箭免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳示意图火箭免疫电泳示意图标准曲线标准曲线测定样本测定样本含有抗体的琼指含有抗体的琼指基本原理：琼脂凝胶中的抗体不发生移动基本原理：琼脂凝胶中的抗体不发生移动(K)(K)，样品孔中的抗原向正，样品孔中的抗原向
7、正极泳动，随抗原含量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原极泳动，随抗原含量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个状如火箭的不溶性抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰。免疫复合物沉淀峰。火箭免疫电泳操作步骤：火箭免疫电泳操作步骤：l电渗小2电泳终点时间较难掌握3开启小电流后再加样，否则形成宽底峰4电泳应先将其甲酰化，使只带负电荷火箭电泳操作时应注意以下几点：火箭电泳操作时应注意以下几点：技术评价：技术评价：大多数蛋白质均可用这一方法进行测定，但目前已被敏感度高，特异性好的等方法代替。应用：应用：基本原理
8、：基本原理：将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，抗原与对应抗将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，未结合的游离抗原或抗体洗去，则体直接发生沉淀反应，未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合而固定的某种蛋白。出现被结合而固定的某种蛋白。5.免疫固定电泳免疫固定电泳(K)（。）。）（型）型）海伦娜免疫固定仪应用：应用：1 1电泳载体的选择电泳载体的选择 与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电泳物质分子量大小等决定。与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电泳物质分子量大小等决定。2 2凝胶打孔及处理凝胶打孔及处理 用打孔器在凝胶板上打孔后，要用琼脂溶液封底，以免样
9、品渗漏。用打孔器在凝胶板上打孔后，要用琼脂溶液封底，以免样品渗漏。四、凝胶免疫电泳的技术要点四、凝胶免疫电泳的技术要点 3 3加样加样 加样时琼脂板应先通上微弱电流，以免样品过多自由扩散。加样时琼脂板应先通上微弱电流，以免样品过多自由扩散。4 4选择抗原与抗体比例选择抗原与抗体比例 适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物，选择抗原和抗体的比例尽量减少前后带现象的发生。适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物，选择抗原和抗体的比例尽量减少前后带现象的发生。5 5检测方法检测方法 如果沉淀线理想，通过肉眼观察即可定性。如果沉淀线理想，通过肉眼观察即可定性。在一些定量测定中，往往辅助以下方法来提高检测
10、的敏感度。在一些定量测定中，往往辅助以下方法来提高检测的敏感度。(1)(1)染色染色 (2)(2)光密度测定法光密度测定法 (3)(3)放射性自显影放射性自显影 6 6干燥与保存干燥与保存 （1 1）除盐及游离蛋白质后，干燥）除盐及游离蛋白质后，干燥 （2 2）保存）保存 将染色片浸泡在将染色片浸泡在 5 5l0l0甘油中甘油中3030，保存效果更好。，保存效果更好。五、免疫增殖性疾病及免疫检测五、免疫增殖性疾病及免疫检测(重点：临床和检验特点重点：临床和检验特点)免疫增殖病免疫增殖病淋巴细胞异常增殖淋巴细胞异常增殖 免疫球蛋白异常增生性疾病免疫球蛋白异常增生性疾病（浆细胞异常增殖（浆细胞异常
11、增殖）良性增殖：常多克隆增殖良性增殖：常多克隆增殖 恶性增殖：常单克隆增殖恶性增殖：常单克隆增殖 免疫球蛋白恶性增生性疾病的免疫损伤免疫球蛋白恶性增生性疾病的免疫损伤 1.免疫球蛋白合成异常,血液粘稠增加2.正常体液免疫抑制 3.免疫球蛋白或其片段可以沉积于组织，激活细胞免 疫或补体系统,造成器官损伤4.浆细胞瘤的浸润性生长,溶骨性病变 多发性骨髓瘤（）多发性骨髓瘤（）特点I.介绍几种免疫球蛋白异常增生性疾病介绍几种免疫球蛋白异常增生性疾病贫血肾功损害免疫功能障碍 骨痛 高粘血症临床特点检查特点正常的免疫球蛋白含量明显降低 血M蛋白或尿本周蛋白 骨髓发现大量浆细胞 溶骨性损害 检测方法：火箭和
12、对流用于检测有无抗体，检测效果不好（检测方法：火箭和对流用于检测有无抗体，检测效果不好（K）1.1.血清蛋白电泳血清蛋白电泳MM蛋白蛋白2.2.尿本周氏蛋白检测尿本周氏蛋白检测3.3.免疫检测方法免疫检测方法免疫电泳 免疫固定电泳 免疫球蛋白及轻、重链定量免疫固定电泳免疫固定电泳 免疫电泳免疫电泳 免疫球蛋白定量免疫球蛋白定量 巨球蛋白血症特点好发于老年男性 血粘滞过高综合征 临床特点临床特点检查特点检查特点其它免疫球蛋白常在正常范围 血蛋白淋巴结、肝和脾肿大 重链病：重链的不同可分为型、型、型 特点贫血细菌感染 淋巴结肿大 临床特点临床特点检查特点检查特点正常的免疫球蛋白含量可降低 重链 轻链病：型、型（此型预后差）特点发热肾功能损害临床特点临床特点检查特点检查特点免疫球蛋白水平可降低或正常 轻链 贫血溶骨性损害良性单克隆免疫球蛋白增殖病特点无明显临床症状 临床特点：检查特点检查特点其它免疫球蛋白常在正常范围 有M蛋白，但其并不呈进行性增加 小结小结免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳和免疫固定电泳的定义、原理及技术要点NoImage几种免疫增殖性疾病的临床特点和检验特点谢谢！
