1、免免 疫疫 组组 织织 化化 学学Immunohistochemistry(IHC)MD Ph.DDepartment of PathologyKey Lab.Of Antibody Technique,Ministry of HealthTel:86862739(L)86863100(O)e-mail:免疫组织化学免疫组织化学 刘彦仿刘彦仿 主编主编 人民卫生出版社人民卫生出版社免疫细胞化学与核酸杂交技术免疫细胞化学与核酸杂交技术 蔡文琴蔡文琴 王伯云王伯云 主编主编 四川科技出版社四川科技出版社免疫组织化学新编免疫组织化学新编纪小龙主编纪小龙主编人民军医出版社人民军医出版社第一章第一章 免
2、疫组织化学基本原理免疫组织化学基本原理及相关知识及相关知识 用标记的抗体（或抗原）对细胞或用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反定位或定量检测，经过组织化学的显色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。察。蛋白质蛋白质 磷脂磷脂多肽多肽 多糖多糖核酸核酸 受体受体酶酶 病原体病原体激素激素免疫组织化学技术的突出优点：免疫组织化学技术的突出优点：高度的特异性高度的特异性 敏感性高敏感性高 方法步骤统一方法步骤统一 机能和代谢密切结合，机能和代谢密切结合，定性、
3、定位、定量的统定性、定位、定量的统一一 免疫组织化学技术在细胞、染免疫组织化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替是其它任何生物技术难以达到和代替的。它能在细胞、基因和分子水平同的。它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。拓了广阔的前景。基因探针基因探针 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 原位原位PCRPCR技术技术 核酸杂
4、交和免疫组织化学双标记核酸杂交和免疫组织化学双标记 电镜杂交技术电镜杂交技术核酸分子探针核酸分子探针-杂交杂交-免疫组织化学免疫组织化学放大和显示杂交信号放大和显示杂交信号杂交免疫组织化学杂交免疫组织化学基因重组技术基因重组技术 免疫组织化学免疫组织化学 图像分析图像分析单抗技术单抗技术 技技 术术 流式细胞术流式细胞术 激光共聚焦显微术激光共聚焦显微术免疫组织化学的全过程：免疫组织化学的全过程：1.1.抗原的提取和纯化抗原的提取和纯化2.2.免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）3.3.抗体效价检测和提取、纯化抗体效价检测和提取、纯化4.4.标记抗体标记抗体5.5.
5、细胞、组织切片标本的制备细胞、组织切片标本的制备6.6.免疫组织化学反应和显色免疫组织化学反应和显色7.7.观察和记录结果观察和记录结果第二章第二章 免疫组织化学中的技术问题免疫组织化学中的技术问题技术问题的重要性技术问题的重要性第一节第一节 有关的细胞和组织学技术有关的细胞和组织学技术一、取材一、取材（一）细胞标本的取材（一）细胞标本的取材 印片法印片法 穿刺吸取涂片法穿刺吸取涂片法 体液沉淀涂片法体液沉淀涂片法 细胞数量多：直接涂细胞数量多：直接涂片片 细胞数量少：离心沉细胞数量少：离心沉淀涂片淀涂片 培养细胞培养细胞 直接收集直接收集 培养液离心涂片培养液离心涂片（二）组织标本的取材（二
6、）组织标本的取材 活检钳的刀口必须锋利，以免组活检钳的刀口必须锋利，以免组织受挤压织受挤压 取材部位必须是主要病变区取材部位必须是主要病变区 必须取病灶与正常组织交界处必须取病灶与正常组织交界处 必要时取远离病灶区的正常组织必要时取远离病灶区的正常组织作对照作对照新鲜组织新鲜组织 冰冻切片冰冻切片 液氮保存液氮保存 -70 -70冰箱冰箱 二、固定二、固定固定剂：常用醛类固定剂固定剂：常用醛类固定剂 10%10%福尔马林（甲醛福尔马林（甲醛10ml+10ml+蒸馏水蒸馏水90ml90ml）10%10%中性缓冲福尔马林（甲醛中性缓冲福尔马林（甲醛10ml+10ml+0.01mol/L pH7.4
7、 PBS 90ml 0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）2.5%2.5%戊二醛戊二醛 用于电镜用于电镜 丙酮丙酮 用于冰冻切片、细胞涂片用于冰冻切片、细胞涂片 44THANK YOUSUCCESS2022-11-1021可编辑固定方法：固定方法：浸入法浸入法 灌注法灌注法三、切片三、切片 1.1.石蜡切片石蜡切片 2.2.冰冻切片冰冻切片 3.3.塑料切片塑料切片 4.4.超薄切片超薄切片 四四.玻片处理和涂胶玻片处理和涂胶 载玻片和盖玻片处理载玻片和盖玻片处理 盖玻片、载玻片盖玻片、载玻片 清洁液中浸泡清洁液中浸泡24h24h（硫酸（硫酸+重铬酸钾）重铬酸钾）清水冲洗清水冲洗蒸
8、馏水冲洗蒸馏水冲洗95%95%酒精浸泡酒精浸泡24h24h烘干烘干 载玻片涂粘附剂载玻片涂粘附剂:APES APES 多聚赖氨酸多聚赖氨酸第二节第二节 免疫组化染色中的技术问题免疫组化染色中的技术问题一、抗体一、抗体 新制备或购进的是原液或冻干品，新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清或抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清或腹水。腹水。1.1.抗体贮存抗体贮存 2.2.抗体稀释抗体稀释 按不同的免疫染色按不同的免疫染色方法和抗原性强弱及抗原的多少，稀释各方法和抗原性强弱及抗原的多少，稀释各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色效果。种抗体原液，以便获得最佳免疫染色效果。抗
9、体最佳稀释度的测定方法抗体最佳稀释度的测定方法 二抗二抗 一一 抗抗 1 1 1:50 1:100 1:200 1:50 1:100 1:200 1:4001:400_ 1:50 +1:50 +1:100 +1:100 +1:200 +1:200 +1:401:400 0 _ 以中等阳性稀释度为佳以中等阳性稀释度为佳 抗体稀释液的配制抗体稀释液的配制 0.01mol/L pH7.4 PBS or 0.01mol/L pH7.4 PBS or TBSTBS 3 3抗体的选择抗体的选择 (1)(1)多抗：虽然存在交叉反应的多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即问题，但由于识别
10、多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。影响实验结果，这是多抗的优点之一。(2)(2)单抗：识别单个抗原表位，单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。的缺点之一。多抗？单抗？多抗？单抗？抗原表位的丰富程度抗原表位的丰富程度也可应用多个单抗也可应用多个单抗（a cocktail of monoclonal a cocktail of monoclonal antibodie
11、santibodies）解决抗原表位少的问题）解决抗原表位少的问题二、免疫染色二、免疫染色 一般程序：一般程序：标记抗体与标本中的抗原反应结标记抗体与标本中的抗原反应结合合 用用PBSPBS洗去未结合的部分洗去未结合的部分 直接观察结果（免疫荧光）或显直接观察结果（免疫荧光）或显色后再用显微镜观察（免疫酶）色后再用显微镜观察（免疫酶）1.1.增强特异性染色的方法增强特异性染色的方法 蛋白酶消化法蛋白酶消化法 胃蛋白酶、胰胃蛋白酶、胰蛋白酶蛋白酶 合适的抗体稀释度合适的抗体稀释度 第一抗体第一抗体 温育时间温育时间 37 30-60 min,4 37 30-60 min,4 过夜过夜 多层染色法
12、（双层、三层）多层染色法（双层、三层）2.2.减少或消除非特异性染色的方法减少或消除非特异性染色的方法 加二抗动物的正常血清加二抗动物的正常血清 2%2%5%5%牛血清白蛋白牛血清白蛋白3.3.显色反应的控制显色反应的控制 显色剂的浓度、温育时显色剂的浓度、温育时间间4.4.复染复染三、对照三、对照 阳性对照阳性对照 阴性对照阴性对照 阻断试验阻断试验 替代对照替代对照 空白对照空白对照 自身对照自身对照 吸收试验吸收试验四、免疫组织化学染色结果的判断四、免疫组织化学染色结果的判断 阳性细胞染色分布有三种类型：胞阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、胞核、细胞膜表面浆、胞核、细胞膜表面 阳性细胞分
13、布可分为灶性或弥漫性阳性细胞分布可分为灶性或弥漫性 由于细胞内抗原含量不同，所以染由于细胞内抗原含量不同，所以染色强度不一色强度不一 阳性细胞染色定位于细胞，与阴阳性细胞染色定位于细胞，与阴性细胞相互交杂分布。性细胞相互交杂分布。切片边缘、刀痕或皱折区域切片边缘、刀痕或皱折区域 、坏、坏死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。断阳性。p 经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量p Study Constantly,And You Will Know Everything.The More You Know,The More Powerful You Will Be写在最后感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings结束语讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
