1、会计学1PCR及其衍生技术及其衍生技术第1页/共87页第2页/共87页第3页/共87页第4页/共87页第5页/共87页第6页/共87页第7页/共87页第8页/共87页第9页/共87页第10页/共87页第11页/共87页第12页/共87页第13页/共87页第14页/共87页第15页/共87页第16页/共87页第17页/共87页第18页/共87页第19页/共87页第20页/共87页第21页/共87页第22页/共87页第23页/共87页第24页/共87页第25页/共87页第26页/共87页第27页/共87页 片段第28页/共87页第29页/共87页第30页/共87页第31页/共87页3第32页/共8
2、7页第33页/共87页第34页/共87页第35页/共87页第36页/共87页第37页/共87页第38页/共87页第39页/共87页第40页/共87页第41页/共87页第42页/共87页第43页/共87页第44页/共87页第45页/共87页第46页/共87页GAPDH。第47页/共87页第48页/共87页第49页/共87页第50页/共87页第51页/共87页第52页/共87页的活性，使反应产物减少第53页/共87页第54页/共87页退火与延伸。第55页/共87页第56页/共87页第57页/共87页使引物与模板之间完全结合第58页/共87页第59页/共87页n扩增10kb需延伸至15minn延伸时
3、间过长会导致非特异性扩增n对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些第60页/共87页第61页/共87页第62页/共87页第63页/共87页第64页/共87页（1）反向）反向PCR技术技术(Inverse PCR,IPCR)：（2）锚定）锚定PCR技术技术(Anchored PCR,APCR)：（3）不对称）不对称PCR技术技术(asymmetric PCR)：（4）反转录）反转录PCR技术技术(reverse transcription PCR,RT-PCR)：（5）巢式）巢式PCR技术技术(NEST-PCR)：（6）多重）多重PCR技术技术(multiplex PCR)：（7）重组）重组PCR技
4、术：技术：（8）原位）原位PCR技术：技术：（9）荧光定量实时）荧光定量实时PCR技术技术 技术技术 第65页/共87页（1）反向）反向PCR技术技术(Inverse PCR,IPCR)：反向反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。一种方法。一种在已知序列中无 切点的限制性内切酶消化基因组DNA。酶切片段自身环化。以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向P
5、CR获得未知片段。第66页/共87页cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）通过通过RT-PCR技术由已知部分技术由已知部分cDNA序列来得到序列来得到完整的完整的cDNA5和和3端，包括单边端，包括单边PCR和锚定和锚定PCR。1.基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及ORF保守区保守区RT-PCR克隆；克隆；2.3-RACE3.5-RACE第67页/共87页1.基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及ORF保守区保守区RT-PCR克隆；克隆；利用ncbi搜索不同物种中同一
6、目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。对所找到的序列进行多序列对。确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50 400个aa为宜，使得pcr产物在1501200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。利用软件设计引物 RAG，YCT，MAC，KGT，SCG，W AT，H ACT，B CGT，ACG，DA/G/T,N=ACG/T密码子的兼并性密码子的兼并性氨基酸密码子数氨基酸密码子数、第68页/共87页第69页/共87页第70页/共87页第71页/共87页第72页/共87页第73页/共87页第74页/共87页第75页/共87页第76页/共87页第77页/共87页第78页/共87页Ct值的确定 第79页/共87页第80页/共87页第81页/共87页第82页/共87页Sample25第83页/共87页第84页/共87页第85页/共87页第86页/共87页
