1、1会计学切片技术切片技术第1页/共71页Resolving power第2页/共71页显微长度单位显微长度单位millimeter(mm)=10-3 metermicrometer(m)=10-6 meternanometer(nm)=10-9 meter第3页/共71页第4页/共71页光学显微镜技术光学显微镜技术 显微镜显微镜1717thth 18th 18th 第5页/共71页光学显微镜技术光学显微镜技术 显微镜显微镜18/1918/19thth 19th 19th 第6页/共71页Eye PiecesObjectives StageLight sourceVol.controlOn-of
2、f ButtonControlsFine focus controlCoarse focus control第7页/共71页10X4 10X4 低倍观察低倍观察10X10 10X10 中倍观察中倍观察10X40 10X40 高倍观察高倍观察10X100 10X100 油镜油镜 普通生物显微镜的放大倍数普通生物显微镜的放大倍数 第8页/共71页光学显微镜原理光学显微镜原理第9页/共71页 荧光显微镜荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。布。第10页/共71页 相差倒置显微镜相差倒置显微镜是用以观察培养细胞。一般光镜不是用以观察培养细胞。一般光镜不易分辨
3、无色透明的活细胞，需用相差显微镜（易分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（phase contrst microscope）才能观察。相差显微镜可将厚细）才能观察。相差显微镜可将厚细胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显，影像清晰。，影像清晰。第11页/共71页第12页/共71页光镜标本制备光镜标本制备？第13页/共71页光学显微镜技术光学显微镜技术常见标本制备：常见标本制备：HEHE染色，石蜡切片染色，石蜡切片第14页/共71页第15页/共
4、71页第16页/共71页第17页/共71页 第18页/共71页Dehydration脱水透明脱水透明第19页/共71页第20页/共71页第21页/共71页Embedding 包埋包埋第22页/共71页切片机切片机石蜡切片机石蜡切片机冰冻切片机冰冻切片机第23页/共71页How does a microtome work?第24页/共71页切片切片on Microtome(wax)on Cryostat(frozen)第25页/共71页裱片裱片第26页/共71页第27页/共71页冰冻切片冰冻切片第28页/共71页第29页/共71页第30页/共71页第31页/共71页第32页/共71页1 1、取材
5、、取材2 2、固定、固定3 3、漂洗、漂洗4 4、脱水、脱水5 5、透明、透明6 6、透蜡、透蜡7 7、包埋、包埋8 8、修块、修块9 9、切片、切片1010、染色、染色石蜡切片HE染色操作步骤第33页/共71页(三三)脱水、透明和封固脱水、透明和封固第34页/共71页染色染色manuallyautomated第35页/共71页第36页/共71页第37页/共71页组织化学术组织化学术(histochemistry)(histochemistry)为应用化为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术学的原理和技术,与组织学技术相结合而与组织学技术
6、相结合而产生的技术产生的技术,能在组织切片定性、定位地能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否、以及分布状态显示某种物质的存在与否、以及分布状态.还可进一步用显微分光光度计或图象分还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度析仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获得定量的信息获得定量的信息.应用这种技术于游离细应用这种技术于游离细胞的样品胞的样品(如细胞涂片如细胞涂片),),则称细胞化学术则称细胞化学术(cytochemistry).(cytochemistry).第38页/共71页第39页/共71页糖类糖类:常用过碘酸希夫反应常用过碘酸希夫反应(periodic(
7、periodic acid Schiff reaction,PAS acid Schiff reaction,PAS 反应反应)显显示多糖和糖蛋白的糖链示多糖和糖蛋白的糖链.糖被强氧化剂糖被强氧化剂.过碘酸氧化后过碘酸氧化后,形成多醛形成多醛;后者再与无色后者再与无色的品红硫酸复合物的品红硫酸复合物(即希夫试剂即希夫试剂)结合结合,形形成紫红色反应产物成紫红色反应产物.第40页/共71页过碘酸过碘酸SchiffSchiff反应反应(periodic acid Schiff reaction)，是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法，是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。氧化氧化 Schi
8、ff试剂试剂 多糖多糖 醛醛 紫红色沉淀紫红色沉淀第41页/共71页脂类脂类:标本用甲醛固定,冷冻切片,用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色,使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色.亦可用锇酸固定兼染色,脂质呈黑色.第42页/共71页第43页/共71页如果同时显示如果同时显示DNADNA和和RNA,RNA,则用甲基绿则用甲基绿-派派若宁反应若宁反应.甲基绿与甲基绿与细胞核细胞核DNADNA结合呈蓝结合呈蓝绿色绿色,派若宁与核仁派若宁与核仁及胞质内的及胞质内的RNARNA结合结合呈红色呈红色.第44页/共71页第45页/共71页第46页/共71页第47页/共71页第48页/共71页免疫细胞（组织）化学
9、免疫细胞（组织）化学抗原抗原（antigen,Ag）与）与抗体抗体（antibody）特特异结合异结合，用已知抗体检测未知抗原的一种方法用已知抗体检测未知抗原的一种方法。第49页/共71页 对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.1.蛋白酶消化法蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。
10、常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.2.非特异吸附法非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物，然后再进行同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%2%左右的牛或人白蛋白左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。封片，减少非特异性染色。第50页/共71页目前常用标识物质有目前常用标识物质有
11、荧光色素、放射性荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶同位素、重金属、微粒子、酶等等第51页/共71页 为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1 1）阳性对照）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。第52页/共71页染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强
12、显色定位特定，具有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同程度显色无分布规律，某一片均匀着色 免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可
13、由显非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。著区别。第53页/共71页第54页/共71页免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：1 1、组织材料的处理：、组织材料的处理：常用的固定液为：常用的固定液为：10%10%中性福尔马林液；中性福尔马林液；4%4%多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4PH7.4）；）；固定时间：固定时间：8-24hr8-24hr组织大小：组织大小：2 2*1.51.5*0.3cm 0.3cm 第55页/共71页2 2、防脱片处理：、防脱片处理：多聚多聚-L-L-赖氨酸；赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。硫酸铬钾明胶液。3 3、增强特异
14、性染色的措施和方法：、增强特异性染色的措施和方法：1 1）、蛋白酶消化：）、蛋白酶消化：a a、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%0.05-0.1%）；）；b b、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（0.4%0.4%）。）。第56页/共71页2 2）、热诱导的抗原修复：）、热诱导的抗原修复：方法：微波方法：微波96960 0C,10minC,10min；直接加温方法直接加温方法 1001000 0C,10minC,10min；高压锅高压锅 1201200 0C,10minC,10min；热处理液：热处理液：0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬
15、酸缓冲液 第57页/共71页3 3）、合适的抗体稀释度：）、合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；即用型抗体；浓缩型。浓缩型。第58页/共71页4 4、减少、减少or or 消除非特异性染色的方法：消除非特异性染色的方法：非特异性染色：非特异性染色：原因：原因：方法：方法：第59页/共71页酶标记酶标记免疫细胞（组织）化学免疫细胞（组织）化学荧光标记荧光标记第60页/共71页电子显微镜技术：透射电镜电子显微镜技术：透射电镜第61页/共71页扫描电镜扫描电镜电子显微镜技术电子显微镜技术第62页/共71页透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜第63页/共7
16、1页第64页/共71页10X4 10X4 低倍观察低倍观察10X10 10X10 中倍观察中倍观察10X40 10X40 高倍观察高倍观察10X100 10X100 油镜油镜 普通生物显微镜的放大倍数普通生物显微镜的放大倍数 第65页/共71页第66页/共71页如果同时显示如果同时显示DNADNA和和RNA,RNA,则用甲基绿则用甲基绿-派派若宁反应若宁反应.甲基绿与甲基绿与细胞核细胞核DNADNA结合呈蓝结合呈蓝绿色绿色,派若宁与核仁派若宁与核仁及胞质内的及胞质内的RNARNA结合结合呈红色呈红色.第67页/共71页第68页/共71页 为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一
17、抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1 1）阳性对照）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。第69页/共71页2 2）、热诱导的抗原修复：）、热诱导的抗原修复：方法：微波方法：微波96960 0C,10minC,10min；直接加温方法直接加温方法 1001000 0C,10minC,10min；高压锅高压锅 1201200 0C,10minC,10min；热处理液：热处理液：0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 第70页/共71页电子显微镜技术：透射电镜电子显微镜技术：透射电镜第71页/共71页
