1、抑制性抑制性消减消减杂交杂交主要内容主要内容2 3 4 1 抑制性差减抑制性差减杂交技术概杂交技术概述述November 10,20222 抑制性差减杂交原理抑制性差减杂交原理抑制性差减杂交流程抑制性差减杂交流程定义定义：抑制差减杂交（SSH）SSH是一种基于抑制PCR和差减杂交技术建立的,在转录水平上研究基因表达的技术。抑制差减杂交抑制差减杂交技术技术SSHNovember 10,20223 不同丰度的单链不同丰度的单链DNA得到均衡得到均衡杂交动力学杂交动力学 目的基因得到富集目的基因得到富集抑制性抑制性PCR抑制性消减杂交抑制性消减杂交原理原理November 10,20224 l 采用
2、两次消减杂交和两次采用两次消减杂交和两次PCR，保证了高特异性；保证了高特异性；l 通过通过杂交操作，可以获得低丰度差异表达基因；杂交操作，可以获得低丰度差异表达基因；l 操作简便，实用有效，全过程仅需操作简便，实用有效，全过程仅需3-4天。天。假阳性率低、特异性高、灵敏度高、操作简便、周期短假阳性率低、特异性高、灵敏度高、操作简便、周期短抑制性消减杂交抑制性消减杂交特点特点November 10,20225 构建消减构建消减cDNA文库文库 研究细菌毒力的相关基因研究细菌毒力的相关基因 研究病原体感染后的应答基因研究病原体感染后的应答基因 鉴定抗病毒相关基因鉴定抗病毒相关基因.抑制性消减杂交
3、抑制性消减杂交应用应用November 10,20226 处理组处理组非处理组非处理组TesterDriver正向消减正向消减DriverTester反向消减反向消减抑制性消减杂交抑制性消减杂交实验方法实验方法November 10,20227 0.5 2 g poly A+RNA0.01 1 g 总总 RNA传统方法合成传统方法合成 cDNASMARTerTM PCR方法合成方法合成 cDNA Rsa I 限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接两次消减杂交两次消减杂交两次两次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因SMARTer PCR cDNA Synth
4、esis Kit(634925/26):从从2 ng总总RNA中合成中合成cDNASMARTer Pico PCR cDNA Synthesis Kit(634928):从低至从低至1 ng的总的总RNA中合成中合成cDNA实验流程实验流程November 10,20228 杂交动力学杂交动力学抑制性抑制性PCR由由RNA合成合成 cDNARsa I限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐实验流程实验流程Teste
5、r cDNA+Adaptor1Tester cDNA+Adaptor 2RNovember 10,20229 由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐实验流程实验流程Tester cDNA with Adaptor1Tester cDNAwith Adaptor 2RDriver cDNA（过量）（过量）ABCDABCDNovember 10,202210 由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶
6、切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐实验流程实验流程ABCDTester杂交液杂交液（Adaptor 1）ABCDTester杂交液杂交液（Adaptor 2R）Driver cDNA（加热变性）（加热变性）A,B,C,DENovember 10,202211 由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次P
7、CR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐实验流程实验流程A,B,C,DABCDE末端补齐末端补齐EENovember 10,202212 由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐实验流程实验流程ABCDE加入共用加入共用PCR引物引物A,D:不能被扩增不能被扩增C:线性扩增线性扩增B:扩增受到抑制扩增受到抑制E5335EENovember 10,202213 非特异性表达基因得到
8、极大的扣除，非特异性表达基因得到极大的扣除，高效地富集了差异表达基因。高效地富集了差异表达基因。由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐实验流程实验流程E5335加入巢式加入巢式PCR引物引物ENovember 10,202214 由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次
9、第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳检测，检测，RNA有两有两条明显的带条明显的带28 S和和18 S，亮度在，亮度在2 :1左右。左右。OD260/OD280 为为1.82.2。哺乳动物哺乳动物poly A RNA 0.512kb，非哺乳动物，非哺乳动物 0.53 kb。M 小鼠肝脏总小鼠肝脏总RNA28S18S5S实验过程要点分析实验过程要点分析November 10,202215 M:Marker1:未酶切的未酶切的ds cDNA 2:酶切后的酶切后的ds cDNA 人类骨骼肌人类骨骼肌ds cDNA如果酶切效果不好，需要重新
10、抽如果酶切效果不好，需要重新抽提纯化提纯化cDNA，重新进行酶切。，重新进行酶切。由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐November 10,202216 实验过程要点分析实验过程要点分析如果如果1和和3的亮度低于的亮度低于2和和4的的1/4，那么接头连接效率小于那么接头连接效率小于25。提供了提供了人类、鼠类人类、鼠类的的G3PDH基因的基因的PCR扩增引物。扩增引物。人类人类G3PDH 基因
11、检测结果基因检测结果750bp450bpcDNA在沉淀过程中被盐在沉淀过程中被盐污染了，或者是第二链的污染了，或者是第二链的合成效率低。合成效率低。由由RNA合成合成 cDNARsa I 酶切酶切cDNA 末端接头连接末端接头连接第一次消减杂交第一次消减杂交第二次消减杂交第二次消减杂交第一次第一次PCR扩增扩增第二次第二次PCR扩增扩增富集差异表达基因富集差异表达基因末端补齐末端补齐November 10,202217 实验过程要点分析实验过程要点分析M:X174-Hea 消化。消化。1:杂交骨骼肌肉杂交骨骼肌肉tester二次二次PCR产物产物2:未杂交的骨骼肌肉未杂交的骨骼肌肉tester
12、G3PDH基因得到了极大的扣除基因得到了极大的扣除消减杂交效率分析消减杂交效率分析抑制性消减杂交结果分析抑制性消减杂交结果分析November 10,202218-以以2ug/ml PHA和和2ng/ml PMA处理处理72小时后的人类小时后的人类Jurkat T细胞的细胞的cDNA作作为为Tester，未处理的，未处理的cDNA作为作为Driver。Tester cDNA、Driver cDNA及消减及消减后的后的cDNA扩增产物在扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（每个孔上样量为的琼脂糖凝胶中进行电泳（每个孔上样量为0.3ug）并转移到尼龙膜上，分别与已知活性的）并转移到尼龙膜上，分
13、别与已知活性的IL-2R 基因基因和看家基因和看家基因G3PDH核酸探针进行杂交。核酸探针进行杂交。差异表达基因的富集与看家基因的扣除差异表达基因的富集与看家基因的扣除November 10,202219 纯化二轮纯化二轮PCR产物（产物（cDNA消减库）消减库）T/A克隆，特异位点或平末端克隆到克隆，特异位点或平末端克隆到相关载体中，转化大肠杆菌相关载体中，转化大肠杆菌蓝白斑筛选和琼脂糖凝胶电泳检测蓝白斑筛选和琼脂糖凝胶电泳检测初步筛选出阳性重组克隆初步筛选出阳性重组克隆BlAST 同源性分析同源性分析确认差异表达基因的确认差异表达基因的EST序列序列根据根据EST序列设计引物，利用序列设计引物，利用Clontech产品产品RACE试剂盒获得试剂盒获得全长全长cDNA将获得全长将获得全长cDNA克隆到相关表达克隆到相关表达载体上，进行基因功能分析。载体上，进行基因功能分析。测序后获得测序后获得EST序列序列利用利用Clontech差异筛选试剂盒差异筛选试剂盒（637403）进行点杂交分析）进行点杂交分析（32P同位素标记）同位素标记）筛选出差异表达基因筛选出差异表达基因后续实验流程后续实验流程November 10,202220
