1、 第二章第二章 生物工业下游加工工生物工业下游加工工程的基本原理程的基本原理 生物物质的分离方法与一般化学方法虽然有许多生物物质的分离方法与一般化学方法虽然有许多不同特点，但在原理上有许多是相同的，不同特点，但在原理上有许多是相同的，这充分说明近代生物化学的发展与化学和物理学的密切关系。用于生物化学分离的制备技术大都是根据用于生物化学分离的制备技术大都是根据混合物种不同组分分配率的差异混合物种不同组分分配率的差异，将其分配于可用机械方法分离的两个或将其分配于可用机械方法分离的两个或几几个物相中个物相中（如溶剂提取、盐析、结晶等），（如溶剂提取、盐析、结晶等），或将混合物置于某一物相中（主要是液
2、或将混合物置于某一物相中（主要是液相），外加一定的作用力，使各组分相），外加一定的作用力，使各组分分配分配于不同区域于不同区域，而达到分离纯化的目的（如，而达到分离纯化的目的（如电泳、超离心、超滤等）。电泳、超离心、超滤等）。生化分离 除了小分子物质如氨基酸、脂肪酸、除了小分子物质如氨基酸、脂肪酸、固醇类及某些维生素外，几乎所有有固醇类及某些维生素外，几乎所有有机体中的大分子物质都不能融化和蒸机体中的大分子物质都不能融化和蒸发，发，只限于分配在固相和液相中只限于分配在固相和液相中。因此可以人为地创造一定的条件，让因此可以人为地创造一定的条件，让这些大分子物质在这两相中交替转移，这些大分子物质在
3、这两相中交替转移，而达到纯化目的。而达到纯化目的。2.1下游技术实质上是一个生物分离的过程下游技术中的物理学过程一、基础物性 各种物质都有其固有的性质，利用物质性质上的差异，可以区分不同的物质，并可对包含多种成分的混合物进行分离和精制。物性的差异越大，分离操作越容易实现，作为分离基础的实际利用价值也就越大。二、分类n以物理学过程为基础的分离操作，大致分为两类（但并不局限于这种简单的分类）：1、平衡分离过程和拟平衡分离2、差速分离过程 1、平衡分离过程分离操作建立在相平衡关系上分离操作建立在相平衡关系上。平衡分离是根据溶质在两相根据溶质在两相（如气液、气固、液液、液固、气固）间分配平衡的差异实现
4、分间分配平衡的差异实现分离。离。溶质达到分配平衡的推动力仅取决于系统的热推动力仅取决于系统的热力学性质力学性质，即溶质偏离平衡态的浓度差。而溶质达到相间分配平衡的过程为扩散传质过程，因此，平衡分离又称为扩散分离平衡分离又称为扩散分离。蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶（沉淀）、吸附、离子交换色谱等均为典型的平衡分离过程。物性物性 对对象象分离分离场所场所分离操作分离操作状态状态蒸汽压分子相间蒸发，蒸馏，干燥升华，真空镀敷气-液气-固溶解度分子相间气体吸收吸附，吸收萃取结晶气-液气-固液-液液-固界面余量 分子相间吸附，离子交换，浮选异相界面平衡分离（扩散分离）操作平衡分离（扩散分离）操作2、差速分离
5、过程 在混合物体系中外加一个能引起物质分离的势能场，在其作用下，形成分离场。差速分离是利用外力（如压力、重力、离心力、电场力、磁力）驱动溶质迁移产生的速度差进行分离的方法。差速分离过程 传统的过滤、重力沉降和离心沉降等非均相物系的机械分离方法根据溶质大小、形状和密度差进行分离，也属差速分离的范畴。其他典型的差速分离法还包括超滤、反渗透、电渗析、电泳和磁泳等。其结果是：欲分离物在分离场的端面上浓缩或在分离场内形成一个稳定的浓度分布。差速分离操作物性物性对象对象外加势能外加势能场场分离场分离场所所分离操作分离操作密度分子离心力场端面超速离心分离密度粒子离心力场端面离心分离电荷分子电场，磁场端面电泳
6、电荷粒子电场，磁场端面电破乳差速分离操作物性物性对象对象 分离分离原理原理外加推外加推动力动力分离场分离场所所分离操作分离操作分子大小 分子 屏蔽 总压差膜面不对称膜反渗透膜分子大小 分子 屏蔽 总压差膜面超滤分子大小 分子 屏蔽 浓度差界面分子筛分子大小 分子 屏蔽 电场膜面电透析膜分子大小 分子 屏蔽 浓度差膜面透析膜分离原理可以组合而共同发挥作用 有些情况下，两种分离原理共同发挥作用，促进分离效果的提高。如色谱电泳（chromatographic electrophoresis）和电色谱（electrochromatography）过程既利用色谱的平衡分离原理，又利用电泳或电渗的电场驱动
7、作用强化分离。不同分离原理的组合可派生新型高效的分不同分离原理的组合可派生新型高效的分离方法离方法。多级分离与方法组合 大多数分离物系中溶质间性质差别较小，即分离因子较小，单级分离效率很低，故一般需要采用多级分离采用多级分离操作以提高效率。对于特定的目标产物，要根据起自身性质及其与共存杂质的特性，选择合适的分离方法和不同分离方法的组合不同分离方法的组合，以获得最佳分离效果，实现高纯度、高收率和低成本的分离目标。三、传递现象 平衡操作中，分离体系在达到平衡之前，要经历一个非平衡过程。趋向平衡态的速度取决于体系内各组分的质量传递的阻力。严格说，达到平衡态的时间要无限长。但从生产角度，达到适当平衡即
8、可。达到这个适当平衡度的速度越快，生产效达到这个适当平衡度的速度越快，生产效率越高率越高。对于利用差速平衡进行分离精制的操作，有必要存在一个能够产生速度差的组分传组分传递阻力差递阻力差。只要适当的分离场的状态参数（全压、组成、温度、外部势能场等）保持不变，各组分间的物质相对传递速度差物质相对传递速度差就保持不变。因此，分离度是固定值分离度是固定值。虽然实际上物质绝对传递速度在很多时候对分离度有影响，但其效果始终处于第二位。传递现象1、传递通量 流体在分离场内传递现象可用经典流体力学中动量通量动量通量、热量通量热量通量和质量通量质量通量传递规律和作用于分离场的外加势能场外加势能场来描述。传递速度
9、传递通量 传递速度方程系数动量t=du/dy牛顿定律分子黏度(Pas)u速度(m/s)y距离(m)热（能）量q/A=k dT/dy 傅立叶方程k导热系数W/(mK)q/A热通量J/(m2/s)T 温度(K)质量jA=-DAB dA/dy费克Fick定律DABA在双组分混合物中的扩散系数(m2/s)jA物质A的质量通量kg/(m2/s)AA的密度(kg/m3)传递规律 动量传递中，t相当于单位面积单位时间内通过的动量。l动量总是朝着动量浓度降低的方向传递的；动量总是朝着动量浓度降低的方向传递的；l热能量总是从高能量（温度）区向低能量热能量总是从高能量（温度）区向低能量区传递的；区传递的；l而组分
10、而组分A总是向浓度梯度下降的方向运动。总是向浓度梯度下降的方向运动。2、固相内的分子扩散l遵从Fick定律的固体内的扩散类型与固体结构是无关的。l当扩散的流体或溶质在固体中形成均匀的溶液时，即发生这种典型的扩散。如浸取操作，由于固体中存在大量的水分，溶质通过这些水溶液进行的扩散即符合Fick定律。固相内的分子扩散 对于溶质A的扩散通量：NA=-DAB dcA/dH (2-15)DABA通过B的扩散系数（m2/s），通常为常数 H距离3、多孔体内的扩散运动 在具有连续空隙的多孔体（包括粒子充填层）内，这种空隙构造可用含有大大小小的细孔群的三维网格的模型来描述。分子在这种细孔中的移动，可分为“微孔
11、扩散”和“表面扩散”两种机理。（1）细孔扩散有效扩散系数：De=D/d：多孔内的空隙；D细孔空间的流体相中运动分子的扩散系数d与扩散有关的微孔曲折系数假设细孔的物质中运动方向呈直管状，则d=1，而实际上是三维方向的曲折孔道，因此d 1。对于球型粒子层，d=1/。大致范围：粒子层：d=1.21.6 多孔质固体：d=210（2）表面扩散 细孔内物质运动的第二种形式是细孔内壁表面物理吸附的分子在保持被吸附状态下进行的运动，称为表面扩散。四、生物分离及其效率 生物分离的目标是实现生物产品的高效率分离纯化。分离效率可从不同的角度来评价，一是分离方法和设备，二是分离过程和产品。1、分离方法和设备 对于特定
12、的分离方法或分离设备（如离心、膜分离、萃取、色谱等），其评价指标包括分离容量（capacity）、分离速度（speed）和分辨率（resolution）。分离方法和设备 分离容量分离容量指单位体积的分离设备（或分离介质）处理料液或目标产物的体积或质量；分离速度分离速度指单批次分离所需的时间，或连续分离过程的进料速度，批次时间越短，分离速度越快；分辨率分辨率指目标产品的纯化效果或杂质的去除能力。具体的分离方法和设备应满足高容量、高高容量、高速度和高分辨率速度和高分辨率的要求。2、分离过程和产品 对于具体目标产品的分离纯化，在利用已有的分离技术或新开发建立的分离技术时，需评价评价具体分离过程对目标
13、产品的：l浓缩程度浓缩程度l分离纯化程度分离纯化程度l回收率回收率 以F表示流速，c 表示浓度；下标T和X分别表示目标产物和杂质，C、P和W分别表示原料、产品和废料。分离器分离器产品产品FPcTP,cXP原料原料废料废料FWcTW,cXWFCcTC,cXC分离过程示意图分离过程示意图浓缩率（concentration factor）产品的浓缩程度用浓缩率表达产品的浓缩程度用浓缩率表达，是一个以是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标浓缩为目的的分离过程的最重要指标。浓缩率m为：lmT=cTP/cTC (2.1a);l mX=cXP/cXC (2.1b)以F表示流速，c 表示浓度；下标T和X分别
14、表示目标产物和杂质，C、P和W分别表示原料、产品和废料。分离系数（separation factor）目标产物的分离纯化程度用分离因子目标产物的分离纯化程度用分离因子 表达。表达。分离因子又称分离系数分离因子又称分离系数：l =(cTP/cTC)/(cXP/cXC)=mT/mX （2.2）l 式2.2表明，产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效果越高。如果mT=mX，则=1,表明目标产物未得到任何程度的分离纯化。l 因此，以分离为目的时，以分离为目的时，值值 应足够大应足够大，以达到高效分离的目的。这时，浓缩率的大小往往成为次要评价指标。分离系数 对于平衡分离过程（如蒸馏
15、、萃取等）的分离因子常用平衡后两相中的溶质浓度之比表示平衡后两相中的溶质浓度之比表示。如产品和废料处于相平衡状态，则l =(cTP/cTW)/(cXP/cXW)（2.3）l 此处定义的 在单级平衡蒸馏中相当于在单级平衡蒸馏中相当于相对挥发相对挥发度度；在萃取分离中又称在萃取分离中又称萃取选择性萃取选择性（selectivity），），是目标产物和杂质在两相间分配系数的比值。式(2.1)和式(2.2)或式(2.3)也适用于间歇过也适用于间歇过程浓缩率和分离因子的计算程浓缩率和分离因子的计算。另外，对于具有生物活性的生物产品（酶、蛋白质药物、抗体等），可用分离前后目分离前后目标产物的比活（标产物的
16、比活（specific activity）A之比之比表示目标产物的分离纯化程度表示目标产物的分离纯化程度 =AP/AC （2.4）此时的 通常称作通常称作纯化因子纯化因子（purification factor），），比活A的单位常用U/mg（U为生物活性单位）。回收率（recovery）无论是以浓缩还是以分离为目的，目标产无论是以浓缩还是以分离为目的，目标产物均应以较大的比例回收，即有较高的回物均应以较大的比例回收，即有较高的回收率收率。目标产物的回收率为lREC=FPcTP/FCcTC 100%(2.5)生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料和产品溶液的体积分别为VC和VP，则回收率
17、为lREC=VPcTP/VCcTC 100%(2.6)若以产品活性（activity）计算收率，则lREC=FPTP/FCTC 100%（2.7a）REC=VPTP/VCTC 100%(2.8a)为单位体积溶液中目标产品的活性，U/mL 或U/L。下游技术中，生物分离工程研究的根本任务是设计和优化分离过程，提高分离效率，减少分离过程步骤，缩短分离操作时间，达到提高产品收率与活性、降低生产成本的目的。2.3下游技术中的化学过程2.3下游技术的化学过程下游技术的化学过程分子间的相互作用：“相似相溶”的原则。分子识别：手性分离介质化学反应化学性分子识别化学性分子识别 某些化学物质对被分离混合物中的目
18、标物质具有特某些化学物质对被分离混合物中的目标物质具有特异性结合的能力，当该化学物质被加入到被分离混合异性结合的能力，当该化学物质被加入到被分离混合物中时，便于目标物质进行特异性结合，从而达到分物中时，便于目标物质进行特异性结合，从而达到分离目的。这些具有化学性分子识别能力的物质暂称为离目的。这些具有化学性分子识别能力的物质暂称为“识别分子识别分子”其作用机理在于目标物与识别分子之间存在一定其作用机理在于目标物与识别分子之间存在一定的相互作用力（如范德华力、氢键、疏水作用力、静的相互作用力（如范德华力、氢键、疏水作用力、静电引力及化学结合力等）。电引力及化学结合力等）。识别分子识别分子下游技术
19、中的化学反应下游技术中的化学反应 柠檬酸+CaCO3 柠檬酸钙 草酸+Ca2+草酸钙 谷氨酸+ZnSO4 谷氨酸锌（存在环境污染问题，工业上被禁用存在环境污染问题，工业上被禁用）生物学过程的机理生物学过程的机理 特异性相互作用特异性相互作用 生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用 疏水相互作用色谱亲合色谱金属螯合色谱生物学过程的机理生物学过程的机理 生物学分离过程的主要特征是生物高分子的特异性相互作用。主要生物学分离过程的主要特征是生物高分子的特异性相互作用。主要以蛋白质为代表的生物高分子（另外含有肝素、明胶、核苷酸等）以蛋白质为代表的生物高分子（另外含有肝素、明胶、核苷酸等
20、）（亲（亲和介质）和介质），能分辨，能分辨特定特定的物质的物质（目标物）（目标物），再与其可逆性结合。这种现，再与其可逆性结合。这种现象是非常象是非常排他性的排他性的、特异性特异性的结合，故称为的结合，故称为特异性相互作用（或生物亲特异性相互作用（或生物亲和力）和力）。特异性相互作用的含义特异性相互作用的含义生物学过程的机理生物学过程的机理离子间的相互作用（离子间的相互作用（亲和介质和目标物均为蛋白亲和介质和目标物均为蛋白/多肽多肽）氢键结合（目标物含有氢键结合（目标物含有O/N原子）原子）疏水性相互作用（目标物疏水性相互作用（目标物和结合部位均含有和结合部位均含有烃链烃链/芳香环类芳香环类疏
21、水基团疏水基团）金属原子配位结合金属原子配位结合（结合部位和目标物均可以与同一金属离子结合部位和目标物均可以与同一金属离子(Cu2+/Ni2+/Zn2+)配位，二者可间接结合配位，二者可间接结合）接合部位接合部位目标物目标物弱共价键结合（弱共价键结合（醛基和羟基间形成半缩醛形式的弱共价键的结合）醛基和羟基间形成半缩醛形式的弱共价键的结合）可逆性（主要受可逆性（主要受PH影响）影响）特异性相互作用的类型特异性相互作用的类型生物学过程的机理生物学过程的机理 影响蛋白质立体构象的环境因素会制约上述的特异性影响蛋白质立体构象的环境因素会制约上述的特异性相互作用相互作用 热：热：温度：温度：PH：静电性
22、的环境变化：静电性的环境变化：试剂：试剂：特异性相互作用的影响因素特异性相互作用的影响因素生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用 亲和色谱是利用了生物物质间的持异性相互作用亲和色谱是利用了生物物质间的持异性相互作用，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的一种色谱分离技术。行选择性分离的一种色谱分离技术。其基本组成如下其基本组成如下：亲和色谱亲和色谱目标物目标物生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用 具有亲水性具有亲水性 便于载体固定化便于载体固定化 非特异吸附很少非特异吸附很少 有一定的机械强
23、度有一定的机械强度 常用的载体：常用的载体：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶等。Sephadex葡聚糖通过-1,6结合与交联制备的葡聚糖凝胶 Sepharose含有半乳糖的琼脂糖凝胶 (Pharmacia 公司)TSK gel硅胶基质（Tayo 公司）载体（担体）的选择载体（担体）的选择亲和色谱亲和色谱生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用酶的抑制剂：酶的抑制剂：可与被抑制的酶被抑制的酶特异性结合抗体：抗体：免疫亲和层析，抗体和抗原抗原之间具有高度特异性结合能力A蛋白：蛋白：A抗原，与动物免疫球蛋白G(IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位为Y字型IgG分子的主干部分（Fc片段
24、），可纯化各种抗体各种抗体凝集素：凝集素：是与糖糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称辅酶和磷酸腺苷：辅酶和磷酸腺苷：脱氢酶和激酶脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用，磷酸腺苷（AMP,ADP,ATP）与辅酶的结构类似三嗪类色素：三嗪类色素：三嗪类色素与各种需要在NAD(辅酶II)的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合能力，另外还可纯化血清白蛋白、干扰素、核糖酶和糖血清白蛋白、干扰素、核糖酶和糖解酶解酶等。过渡金属离子：过渡金属离子：可与N,S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发
25、生亲和结合作用组氨酸：组氨酸：具有弱疏水性、其咪唑环为弱点性，可与蛋白质发生亲和结合作用（受PH和盐浓度影响），用来分离等电点相差较大的蛋白等电点相差较大的蛋白肝素：肝素：可纯化脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白白等配体和目标物配体和目标物亲和色谱亲和色谱生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用亲和色谱的操作过程亲和色谱的操作过程生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用 保证介质对目标物有较高的吸附作用和吸附容量保证介质对目标物有较高的吸附作用和吸附容量 杂质的非特异吸附要控制在最低
26、水平杂质的非特异吸附要控制在最低水平 影响因素有：影响因素有：目标物和杂质的浓度、缓冲液离子强度和pH值等；提高介质本身的质量；在料液中加入表面活性剂（尤其适用于目标物为疏水性强的蛋白质）料液流速是影响层析柱效和分离速度的重要因素料液流速是影响层析柱效和分离速度的重要因素 料液流速与操作压力成正比，需根据吸附柱的不同载料液流速与操作压力成正比，需根据吸附柱的不同载体来选择体来选择亲和色谱的操作过程亲和色谱的操作过程吸附操作吸附操作生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用 目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一般使用与吸附操作
27、相同的缓冲液，必要时可加入表面般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时可加入表面活性剂，保证目标物的吸附和杂质的除去。活性剂，保证目标物的吸附和杂质的除去。由于亲和吸附是可逆的，洗涤时间要适中：过度洗涤由于亲和吸附是可逆的，洗涤时间要适中：过度洗涤会引起目标物收率降低；洗涤不够会使目标物纯度下会引起目标物收率降低；洗涤不够会使目标物纯度下降。降。亲和色谱的操作过程亲和色谱的操作过程洗涤操作洗涤操作生物学过程在下游技术中的应用生物学过程在下游技术中的应用 特异性洗脱：特异性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标物（例1：t-PA亲和层析亲和层析，赖氨酸和精氨酸均为其抑制剂；例2：带有带有His标签标签的蛋白质的金属鳌和亲和层析的蛋白质的金属鳌和亲和层析，用咪唑溶液为洗脱剂）非特异性洗脱：非特异性洗脱：通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类等物化性质降低目标物与亲和介质的吸附能力（例：利用BSA-Sepharose 4B 亲和层析柱分离抗抗BSA血清中不同抗体血清中不同抗体）亲和色谱的操作过程亲和色谱的操作过程洗脱操作洗脱操作
