1、人类体细胞染色体标本制备与核型分析人类体细胞染色体标本制备与核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype.一、实验目的一、实验目的1.熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。色体标本的制备方法。2.熟悉人类染色体熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。显带标本制备与分析。.二、实验原理二、实验原理 染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，
2、通常情况下，都是利用外周能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。细胞，使其恢复增殖能力。.二、实验原理二、实验原理 因此，可采取少量外周静脉血，做短期培因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入加入秋水仙素秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在
3、中期以获得足够量的分裂期细胞，经在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗低渗、固定固定、制片制片、染色染色后镜下观察进行核型分析。后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化、Giemsa染色染色后，可在染色体纵轴上显示出着后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹色深、浅相间的横纹带，表明每条染色体带，表明每条染色体的特征。的特征。.在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而解胞间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经
4、又能清楚地显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获的细胞作一系列预处理。有时，在对细胞进行收获的细胞作一系列预处理。有时，在对细胞进行固定的时候，为了使固定剂迅速渗透到组织中，以固定的时候，为了使固定剂迅速渗透到组织中，以便于研究染色体的特殊结构，也需要作预处理；其便于研究染色体的特殊结构，也需要作预处理；其目的是使细胞的核外条件及染色体本身的状态更适目的是使细胞的核外条件及染色体本身的状态更适于分析和研究的需要。在细胞培养（培养基中加有于分析和研究的需要。在细胞培养（培养基中加有PHA）后）后72小时，合成小时，合成DNA的细胞占总数的的细胞占总数的45，有丝分裂的速率相当于每小时有丝分裂的速
5、率相当于每小时1%，被激活的淋巴，被激活的淋巴细胞占总数的细胞占总数的90%，是收获分裂期细胞、制备染色，是收获分裂期细胞、制备染色体标本的最佳时期。体标本的最佳时期。.从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处理、固定、滴片等几个主要环节，现低渗处理、固定、滴片等几个主要环节，现将各步骤的原理、所用试剂及相关注意事项将各步骤的原理、所用试剂及相关注意事项详述如下。详述如下。.1.1.纺锤体抑制剂纺锤体抑制剂 1.1基本原理和机制基本原理和机制 使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是改变细胞质的粘度改变细胞质的粘
6、度。因为在细胞分裂时，随着纺锤。因为在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。纺体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。纺锤体的形成取决于细胞质和纺锤体成分的粘度之间锤体的形成取决于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡。因此，改变细胞质的粘度就能破坏纺锤体，的平衡。因此，改变细胞质的粘度就能破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者更确切地说，染色使染色体依然呈游离状态，或者更确切地说，染色体不再粘附至细胞内的任何结合力上。所以在随后体不再粘附至细胞内的任何结合力上。所以在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展开来。制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展开来。同时，
7、由于染色体的不同区段上水合作用的能力不同时，由于染色体的不同区段上水合作用的能力不一，当细胞质的粘度发生变化时，就会使缢痕区显一，当细胞质的粘度发生变化时，就会使缢痕区显示得更为清楚。示得更为清楚。.1.纺锤体抑制剂纺锤体抑制剂 细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁由由13条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白，而微管蛋白分白，而微管蛋白分微管蛋白和微管蛋白和微管蛋白两种。微管蛋白两种。微微管蛋白和管蛋白和微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位，微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位，若干个异二聚体相接连成原丝
8、。若干个异二聚体相接连成原丝。微管蛋白与微管蛋白与微管微管蛋白在化学结构上极为相似，两者蛋白在化学结构上极为相似，两者42%序列相同。序列相同。其中其中微管蛋白肽链中第微管蛋白肽链中第201位为半胱氨酸，为秋水位为半胱氨酸，为秋水仙素结合部位。如果结合的部位被其结合，微管不仙素结合部位。如果结合的部位被其结合，微管不仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。.故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺成和终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺锤体抑制剂能引起有丝分裂过程中纺
9、锤丝断裂或抑锤体抑制剂能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体的形成，但不影响染色体的复制和着丝粒制纺锤体的形成，但不影响染色体的复制和着丝粒的分裂使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量的分裂使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期的作用，分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期的作用，几乎对所有植物器官和许多动物的器官都是十分有几乎对所有植物器官和许多动物的器官都是十分有效的。效的。1.纺锤体抑制剂纺锤体抑制剂.1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点主要的纺锤体抑制剂及其作用特点 秋水仙素秋水仙素 秋水仙素（秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最
10、初从）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中提）中提取出来，故名。分子式取出来，故名。分子式C22H25O6N。纯秋水仙素。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点呈黄色针状结晶，熔点157。易溶于水、乙醇和。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis
11、）。在这样的有丝）。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。成两个子细胞，因而使染色体加倍。1.纺锤体抑制剂纺锤体抑制剂.秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高浓度时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺浓度时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺锤体的形成。锤体的形成。在秋水仙素作用下，染色单体缩短，在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着色变深以致外形清晰。但不同染色体缩短的程度不着色变深以致外形清晰。但不同染色体缩短的程度不一，长的染色体比短的染色体浓缩
12、得更明显些。一，长的染色体比短的染色体浓缩得更明显些。从能收集到足够的中期细胞考虑，秋水仙素处理从能收集到足够的中期细胞考虑，秋水仙素处理的时间宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为的时间宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所用的浓度宜细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所用的浓度宜低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二个方面。低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二个方面。如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少；与此如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少；与此相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色体相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色
13、体缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标本。本。.与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优点是，在广泛的温度范围内都是有活性的。在热点是，在广泛的温度范围内都是有活性的。在热带地区的夏季，那怕气温高达带地区的夏季，那怕气温高达43.3，对秋水仙素，对秋水仙素的活性也无显著影响，有人将秋水仙素加入保存的活性也无显著影响，有人将秋水仙素加入保存在在8-9的组织中，发现中期细胞的数目比保存在的组织中，发现中期细胞的数目比保存在室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而且染色室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而
14、且染色体的结构也很清楚。体的结构也很清楚。乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生物。它的功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作物。它的功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作用只有秋水仙素的用只有秋水仙素的1/30一一1/40。4-610-6的浓度即的浓度即可得到所希望的效应。可得到所希望的效应。除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长体抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。春花碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。.1.3处理过
15、程处理过程 培养终止前在培养基中加入浓度为培养终止前在培养基中加入浓度为20g/ml的秋水仙素的秋水仙素0.050.1ml（1ml注射器注射器滴垂直滴垂直3-5滴）使其最终浓度为滴）使其最终浓度为0.40.8g/ml，置置5%CO2、37C0.5C培养箱中处理培养箱中处理24h。.1.4注意事项注意事项 应当注意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用应当注意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液各种不同的固定液(金属固定液或非金属固定液金属固定液或非金属固定液)予予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织或细胞上冲洗掉，否则沉积在细胞表面的秋水仙
16、或细胞上冲洗掉，否则沉积在细胞表面的秋水仙素不仅会影响染色体的形态，而且还会阻碍固定素不仅会影响染色体的形态，而且还会阻碍固定液的穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加液的穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加快速穿透液，如甲醇快速穿透液，如甲醇-冰醋酸固定液。要不然在固冰醋酸固定液。要不然在固定的时候，细胞核仍可能进入代谢期。定的时候，细胞核仍可能进入代谢期。.2.低渗溶液低渗溶液 经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适合于观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞合于观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约的染色
17、体数目多，形状小，最大的染色体约7-8微米，微米，加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平面上。这些均有赖于低渗处理。面上。这些均有赖于低渗处理。.2.1基本原理和机制基本原理和机制 1965年，徐道觉发现未作低渗处理时，伴随染年，徐道觉发现未作低渗处理时，伴随染色体的一些零乱的物质类似于核糖核蛋白体的颗粒，色体的一些零乱的物质类似于核糖核蛋白体的颗粒，显然是有丝分裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处显然是有丝分裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处理后，这些物质就消失
18、了。可见，低渗处理不只是理后，这些物质就消失了。可见，低渗处理不只是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，而且还可凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，而且还可使粘附于染色体的核仁物质散开，这样就能看清楚使粘附于染色体的核仁物质散开，这样就能看清楚每一个扭曲的染色体。现在知道，覆盖在染色体上每一个扭曲的染色体。现在知道，覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散。的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散。.2.2主要的低渗液主要的低渗液 低渗溶液低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾可以是水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油
19、磷酸钾(0.65mol/L)、氯化钾氯化钾(0.075mol/L)、稀释的平衡盐溶、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理时间一般为液或培养基。处理时间一般为8-40分钟，处理时的温分钟，处理时的温度为度为23-37。在早期的一些研究中，大多用柠檬酸钠或柠檬酸钾在早期的一些研究中，大多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液。也有些学者主张用稀释的人血清，认作为低渗液。也有些学者主张用稀释的人血清，认为这样可使染色体的形态特征更为清晰。自为这样可使染色体的形态特征更为清晰。自1965年年后，人们改用后，人们改用KCl为低渗掖。其优点是染色体的轮廓为低渗掖。其优点是染色体的轮廓清楚，可染色性增强，染色时间短。在相
20、差显微镜清楚，可染色性增强，染色时间短。在相差显微镜下观察下观察KCl低渗处理标本的效果比其它低渗液更好低渗处理标本的效果比其它低渗液更好些，也适合于显微分光光度分析，当用显带染色时些，也适合于显微分光光度分析，当用显带染色时能充分显示带型的特点。能充分显示带型的特点。KCl的浓度以的浓度以0.075molL为宜，但不同组织所需的处理时间未必相同。为宜，但不同组织所需的处理时间未必相同。.2.3低渗处理过程低渗处理过程 秋水仙素处理秋水仙素处理2-4小时后，小心地从温箱取出培小时后，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管将培养液转移到养瓶，用滴管将培养液转移到10ml离心管并置离心离心管并置离心机内离
21、心，转速为机内离心，转速为1500rpm，离心，离心10min。离心后。离心后用滴管吸弃上清液，培养物沉积在管底。然后加入用滴管吸弃上清液，培养物沉积在管底。然后加入37温育的低渗液温育的低渗液8毫升，用滴管吹打成单个细胞悬毫升，用滴管吹打成单个细胞悬液，置液，置37C水浴处理水浴处理20-30min，使红细胞破碎，白，使红细胞破碎，白细胞膨胀。细胞膨胀。.2.4影响低渗效果的因素影响低渗效果的因素 影响低渗处理的效果是以下三个因素：低渗影响低渗处理的效果是以下三个因素：低渗溶液的化学组成、低渗的强度和处理的时间。处溶液的化学组成、低渗的强度和处理的时间。处理时间太短则染色体铺展不好，处理时间
22、过长会理时间太短则染色体铺展不好，处理时间过长会引起细胞破裂甚至由于染色体胀得太大而致形态引起细胞破裂甚至由于染色体胀得太大而致形态结构模糊。因此，在实际操作中，对某一种组织结构模糊。因此，在实际操作中，对某一种组织究竟应选用哪一种低渗溶液，需事先进行预试验。究竟应选用哪一种低渗溶液，需事先进行预试验。.3.固定固定 固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要某一特定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要避免所研究的成分受到破坏。避免所研究的成分受到破坏。不同物种对固定剂的反应是不一的，哺乳类不同物种对固定剂的反应是不一的
23、，哺乳类动物染色体的固定尤其需要特定的方法，这是因动物染色体的固定尤其需要特定的方法，这是因为每种生物的细胞质成分彼此各异的缘故。生物为每种生物的细胞质成分彼此各异的缘故。生物类型本身的复杂性及多细胞生物中细胞内的变化类型本身的复杂性及多细胞生物中细胞内的变化较大，以致很难在细胞水平上分析固定的效应。较大，以致很难在细胞水平上分析固定的效应。.3.1基本原理与机制基本原理与机制 用于固定的化学物对细胞都具有杀死作用，这类化用于固定的化学物对细胞都具有杀死作用，这类化学物可分成二大类：一类能使染色体固缩，或使核学物可分成二大类：一类能使染色体固缩，或使核酸和蛋白质纤丝相脱离，另一类则可维持染色体
24、结酸和蛋白质纤丝相脱离，另一类则可维持染色体结构的完整性。构的完整性。为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及嗜碱性，就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下，嗜碱性，就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不同成分之间的相差并不足以使它们成为一细胞内不同成分之间的相差并不足以使它们成为一种明显的单位。可是随着蛋白质的凝结和沉淀，染种明显的单位。可是随着蛋白质的凝结和沉淀，染色体的折射系数将发生很大的变化从而使它们在细色体的折射系数将发生很大的变化从而使它们在细胞内成为明显的小体。正因为如此，迄今所用的固胞内成为明显的小体。正因为如此，迄今所用的
25、固定剂都具有交链蛋白质的特性，都能使染色质沉淀。定剂都具有交链蛋白质的特性，都能使染色质沉淀。尽管常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合尽管常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物，但其中至少有一种化学物必须具备这一特性。物，但其中至少有一种化学物必须具备这一特性。.固定剂的另一重要特性是能迅速地穿透组织或固定剂的另一重要特性是能迅速地穿透组织或细胞，并在一瞬间内杀死它们，这样方能使正在分细胞，并在一瞬间内杀死它们，这样方能使正在分裂的细胞立即阻留在各自的时相上。瞬间杀死是很裂的细胞立即阻留在各自的时相上。瞬间杀死是很重要的，否则核分裂仍可继续下去并到达所谓的重要的，否则核分裂仍可继续下去
26、并到达所谓的“休止相休止相”或或“代谢相代谢相”，那就无从研究染色体了。，那就无从研究染色体了。.可是，随着细胞的死亡而出现的另一些变化可是，随着细胞的死亡而出现的另一些变化(特特别是蛋白质的自溶作用别是蛋白质的自溶作用)，往往会破坏染色体的原来，往往会破坏染色体的原来结构。在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合结构。在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使复合蛋白质裂解为简单便在相反方向起作用，即使复合蛋白质裂解为简单的氨基酸。因为多肽是染色体的主要成分之一，所的氨基酸。因为多肽是染
27、色体的主要成分之一，所以这种变性效应最终将引起染色体结构的破坏。因以这种变性效应最终将引起染色体结构的破坏。因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。此外，在细胞致死的同时，细菌的活动致使细胞内此外，在细胞致死的同时，细菌的活动致使细胞内成分的分解。因此一种好的固定剂应当既能起到防成分的分解。因此一种好的固定剂应当既能起到防腐作用，又能阻止细菌的分解作用。腐作用，又能阻止细菌的分解作用。.最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即能增强染色体的嗜碱性。例如，甲醛虽具效果，即能增强染色体的嗜
28、碱性。例如，甲醛虽具有优良固定剂的其它所有特性，但却会降低染色体有优良固定剂的其它所有特性，但却会降低染色体的嗜碱性，所以不能单独用作染色体的固定剂。的嗜碱性，所以不能单独用作染色体的固定剂。显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此，那怕是最佳固定剂仍难免有不足之处。首先，此，那怕是最佳固定剂仍难免有不足之处。首先，细胞被杀死后发生的基本变化很难予以避免；其次，细胞被
29、杀死后发生的基本变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分；最后即使操作十分谨可能会抽提出一些弥散成分；最后即使操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变；此外，某些化学物还慎，仍难以保持酶活性不变；此外，某些化学物还会导致细胞的皱缩。会导致细胞的皱缩。.细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量的两个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内的两个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内结构膨胀或破坏的决定性因索，为此选用等渗液作结构膨胀或破坏的决定性因索，为此选用等渗液作为固定剂，其实这种看法是不正确的。事实证明，为固定剂，其实这种看法是不正确的。事实证明，稀
30、释的醋酸具有稀释的醋酸具有20个大气压，照常可使细胞和组织个大气压，照常可使细胞和组织膨胀，而只有膨胀，而只有2.5个大气压的苦味酸却可使组织大大个大气压的苦味酸却可使组织大大地收缩。这提示一种固定剂的效果如何与渗透压的地收缩。这提示一种固定剂的效果如何与渗透压的关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀的作用关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀的作用很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。因此，在选用哪些化学物作为固定剂时，需要权衡因此，在选用哪些化学物作为固
31、定剂时，需要权衡以上这些因素。以上这些因素。.用作固定剂的化学物有非金属和金属两类。前者如用作固定剂的化学物有非金属和金属两类。前者如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀等。后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀等。其中有几种化学物还可作为蒸气固定剂，也即在接其中有几种化学物还可作为蒸气固定剂，也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质，这样就可在原位制作标本。物质，这样就可在原位制作标本。在细胞化学研究上，大多数非金属固定剂在细胞化学研究
32、上，大多数非金属固定剂(除甲醛除甲醛外外)比之于金属固定剂有一优点是，在固定之后无比之于金属固定剂有一优点是，在固定之后无需在水中冲洗标本。需在水中冲洗标本。.3.2固定液的种类固定液的种类 醋酸醋酸 作为混合固定液的一种成分，醋酸的优点在于：作为混合固定液的一种成分，醋酸的优点在于：（1）可以与已知的任何一种固定剂同时使用，并）可以与已知的任何一种固定剂同时使用，并且可以和任意比例的水、乙醇或甲醇混合；（且可以和任意比例的水、乙醇或甲醇混合；（2）浓度可以很低（浓度可以很低（1%）也可以很高（）也可以很高（99%）；（）；（3）具有很强的穿透性能，比乙醇的穿透性还高。具有很强的穿透性能，比乙
33、醇的穿透性还高。醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用胞质蛋白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于被破坏。途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于被破坏。经醋酸固定的物质还能抵销乙醇的硬化作用。经醋酸固定的物质还能抵销乙醇的硬化作用。.醋酸是染色体的一种理想的固定剂，它可使染色体醋酸是染色体的一种理想的固定剂，它可使染色体结构保持完整，且多半不致破坏核蛋白。这种固定结构保持完整，且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂的一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀，因剂的一个缺点是
34、会导致染色体片段的过分膨胀，因此如果要研究染色体的详细结构，必须把它与乙醇此如果要研究染色体的详细结构，必须把它与乙醇或类似的化学物一道使用，后者能使组织收缩和硬或类似的化学物一道使用，后者能使组织收缩和硬化。在研究减数分裂的染色体时，如果目的是了解化。在研究减数分裂的染色体时，如果目的是了解染色体的行为，而不是其结构细节，用醋酸作为固染色体的行为，而不是其结构细节，用醋酸作为固定剂当然是十分恰当的。在分析粗线期的染色体时定剂当然是十分恰当的。在分析粗线期的染色体时要求染色体的细节清晰，醋酸也不愧是一种理想的要求染色体的细节清晰，醋酸也不愧是一种理想的固定剂。固定剂。此外，醋酸还是苯胺类染料的
35、一种优良溶剂。正因此外，醋酸还是苯胺类染料的一种优良溶剂。正因为具有这一特性，它是染料和固定液混合物中必需为具有这一特性，它是染料和固定液混合物中必需的一种成分，例如醋酸的一种成分，例如醋酸洋红、醋酸洋红、醋酸奥辛和醋奥辛和醋酸酸间苯二酚蓝等。间苯二酚蓝等。.甲醇甲醇 在植物染色体研究中极少应用，可是却广泛地用于动物染在植物染色体研究中极少应用，可是却广泛地用于动物染色体的固定。甲醇是从木材分解蒸馏制得的，是焦木酸的色体的固定。甲醇是从木材分解蒸馏制得的，是焦木酸的一种成分。虽然乙醇会使染色体收缩得很厉害，而甲醇却一种成分。虽然乙醇会使染色体收缩得很厉害，而甲醇却可使染色体膨胀。在制备固定液时
36、往往需要一种膨胀剂以可使染色体膨胀。在制备固定液时往往需要一种膨胀剂以补偿另一些化学品的收缩效应，所以甲醇这一特性是非常补偿另一些化学品的收缩效应，所以甲醇这一特性是非常有用的。它的有效浓度为有用的。它的有效浓度为7070至至100100。它是一种无色有。它是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。但不能与氧化剂一道，毒的液体且可以任何比例与水混合。但不能与氧化剂一道，否则很快会氧化成甲酸。否则很快会氧化成甲酸。.乙醇乙醇 广泛地用作染色体固定剂的一种成分。它的有效浓广泛地用作染色体固定剂的一种成分。它的有效浓度与甲醇一样。乙醇有一个最重要的优点是能迅速度与甲醇一样。乙醇有一个最重要的优点是
37、能迅速地穿透人组织。它可以沉淀蛋白质，还具有脱水地穿透人组织。它可以沉淀蛋白质，还具有脱水性可使蛋白质出现不可逆转的变性，还能使组织性可使蛋白质出现不可逆转的变性，还能使组织硬化。硬化。作为一种还原剂，在有氧化剂存在时乙醇会很快被作为一种还原剂，在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙酸。所以它不能与许多金属固定剂氧化为乙酸。所以它不能与许多金属固定剂(铬酸或铬酸或四氯化锇四氯化锇)相混用。乙醇不能有效地固定染色质，原相混用。乙醇不能有效地固定染色质，原则上不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。可是冷的则上不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。可是冷的乙醇固定法往往能保存某些酶，因为酶的反应基乙醇固定法往往能
38、保存某些酶，因为酶的反应基团团般是不受它破坏的。在对染色体的酶进行研究般是不受它破坏的。在对染色体的酶进行研究时，宜用时，宜用8080冷乙醇固定冷乙醇固定1 1小时或更多时间；如用于小时或更多时间；如用于单层培养物，往往以纯乙醇或单层培养物，往往以纯乙醇或9595的乙醇固定的乙醇固定1-151-15分钟为宜。分钟为宜。.卡诺固定液。卡诺固定液。卡诺固定液由卡诺固定液由1 1份冰醋酸和份冰醋酸和3 3份甲醇或乙醇混合而成。份甲醇或乙醇混合而成。这种固定液适用于所有的动植物和人类染色体的固这种固定液适用于所有的动植物和人类染色体的固定。固定的时间为定。固定的时间为1515分钟到分钟到2424小时，
39、温度为室温或小时，温度为室温或稍冷。必要时可以改变酸和醇的比例，例如改成稍冷。必要时可以改变酸和醇的比例，例如改成1:21:2或或1:41:4等。随着醋酸比例的增高，固定液膨胀的等。随着醋酸比例的增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展；但是如果控制不效能加大，有利于染色体的铺展；但是如果控制不当则会导致细胞破碎，反而不利于分析。当则会导致细胞破碎，反而不利于分析。卡诺固定液的一个缺点是经这种方式固定的组织不卡诺固定液的一个缺点是经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色，除非用一些特能被许多碱性染料的水溶液染上色，除非用一些特殊的媒染剂。这是因为固定液中缺乏有助于染色体殊的媒
40、染剂。这是因为固定液中缺乏有助于染色体嗜碱性的金属成分。嗜碱性的金属成分。.3.3 固定的过程固定的过程 预固定：低渗预固定：低渗30分钟后，在离心管中加入分钟后，在离心管中加入1滴管滴管约约2ml的卡诺固定液，并将其混和均匀，使之与的卡诺固定液，并将其混和均匀，使之与细胞充分接触。继续水浴细胞充分接触。继续水浴5分钟左右。离心，分钟左右。离心，1500rpm，10min，弃上清液。，弃上清液。再固定：在离心管中加入加入固定液再固定：在离心管中加入加入固定液6-8毫升，用毫升，用吸管轻轻打散管底细胞，使之与细胞充分接触，吸管轻轻打散管底细胞，使之与细胞充分接触，再次离心，再次离心，1500rp
41、m，10min，弃上清液。并重，弃上清液。并重复上述操作一次。复上述操作一次。.气干法气干法 固定完成后就进入制片阶段。早期人们多采用挤压固定完成后就进入制片阶段。早期人们多采用挤压法，后来则很快被气干法取代。现今这一技术在哺法，后来则很快被气干法取代。现今这一技术在哺乳类和人类细胞遗传学中得到了广泛的应用，以致乳类和人类细胞遗传学中得到了广泛的应用，以致挤压法已几乎为人们所忘却。挤压法已几乎为人们所忘却。气干法主要用于那些容易做成细胞悬液的组织例如气干法主要用于那些容易做成细胞悬液的组织例如骨髓、外周血淋巴细胞，腹水和生殖上皮细胞。通骨髓、外周血淋巴细胞，腹水和生殖上皮细胞。通过体外培养技术
42、可使组织块生长成单层细胞，或者过体外培养技术可使组织块生长成单层细胞，或者经酶解而变成细胞悬液。一旦制成细胞悬液就可进经酶解而变成细胞悬液。一旦制成细胞悬液就可进行预处理和固定，然后作气干法制片。行预处理和固定，然后作气干法制片。4.4.制片制片.4.4.制片制片 制片过程制片过程 已固定的细胞悬液离心，倒去大部分上清液，使管底已固定的细胞悬液离心，倒去大部分上清液，使管底的小量固定液中悬浮着大量细胞。清洁载玻片事先应的小量固定液中悬浮着大量细胞。清洁载玻片事先应置于冷的二蒸水或纯酒精中。用时以清洁镊子夹取载置于冷的二蒸水或纯酒精中。用时以清洁镊子夹取载玻片置于垫板之上，载玻片与垫板应成一定的
43、角度玻片置于垫板之上，载玻片与垫板应成一定的角度（约（约10101515度）。用吸管吸取数滴细胞悬液滴在载玻度）。用吸管吸取数滴细胞悬液滴在载玻片上。这样滴上的细胞悬液可顺着湿的表面自上而下片上。这样滴上的细胞悬液可顺着湿的表面自上而下流散开来。滴片完毕后将垫板连同载玻片放入流散开来。滴片完毕后将垫板连同载玻片放入7575烤烤箱，烤片箱，烤片3 3小时，使固定液挥发。气干法制片比挤压法小时，使固定液挥发。气干法制片比挤压法省事，效果也很好。在一个载玻片上，大约省事，效果也很好。在一个载玻片上，大约2/32/3的面积的面积就足以容纳就足以容纳0.20.2毫升全血培养物中的所有细胞。由此制毫升全血
44、培养物中的所有细胞。由此制得的标本细胞密度较高，适于观察与分析。得的标本细胞密度较高，适于观察与分析。.三、实验用品三、实验用品1采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。注射器。2RPMI 1640液体培养基、小牛血
45、清、肝素（液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素）、秋水仙素（10mg/ml）、）、KCl低渗液（低渗液（0.075mol/L）、甲醇、）、甲醇、冰乙酸、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。）。32.5胰酶溶液（胰酶溶液（Hanks液配制）、液配制）、0.4酚红、酚红、Giemsa染色液、染色液、1N盐酸、盐酸、1N氢氧化钠。氢氧化钠。.四、实验步骤四、实验步骤1.采血及接种培养采血及接种培养1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素抽取肝素0
46、.2ml，使肝素湿润至管壁。，使肝素湿润至管壁。1.2 常规消毒后，采集外周静脉血常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使，转动注射器使血液与肝素混匀。血液与肝素混匀。1.3 在超净工作台中，预先将在超净工作台中，预先将RPMI 1640液体培养基液体培养基（5ml，含植物血凝素，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴全血（滴全血（6号针头），号针头），水平摇动混匀。水平摇动混匀。.1.采血及接种培养采血及接种培养1.4 置置37恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养4872小时。培养过程中小时。培养过程中每天水
47、平摇动培养物每天水平摇动培养物12次，使血液均匀悬浮，再继次，使血液均匀悬浮，再继续培养。续培养。1.5 终止培养前终止培养前24小时，加入秋水仙素，使终浓度达小时，加入秋水仙素，使终浓度达到到0.2g/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养至培养至72小时。小时。.2制片制片2.1 收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中。充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中。2.2 1000 rpm离心离心8分钟（注意先配平）。分钟（注意先配平）。2.3 弃
48、上清液，加入弃上清液，加入37预温的预温的 0.075 mol/L KCl溶液溶液8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37恒温水恒温水浴箱低渗处理浴箱低渗处理25分钟。分钟。2.4 加入加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），），用吸管小心吹打、混匀，用吸管小心吹打、混匀，1000rpm离心离心8分钟。分钟。2.5 弃上清液，加入弃上清液，加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定悬液后，室温下固定20分钟。分钟。.2制片制片2.6 1000 rpm离心离心 8分钟。分钟。2.7
49、弃上清液，重复固定一次。弃上清液，重复固定一次。2.8 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。2.9 吸取少量细胞悬液，滴吸取少量细胞悬液，滴23滴于冰水浸泡过的载滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。玻片上，吹散，气干。2.10 将标本置将标本置Giemsa染液中，染色染液中，染色8分钟，水洗去浮分钟，水洗去浮色，气干。色，气干。2.11 显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。情况。.3.G显带染色体标本制备显带染色体标本制备3.1 常
50、规制片后，将标本置常规制片后，将标本置70烤箱中干烤烤箱中干烤2小时，小时，自然冷却。自然冷却。3.2 取取2.5胰酶溶液胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入，加入染色缸中，加入45 ml生理盐水，用生理盐水，用 1N HCl或或1N NaOH及酚红调节胰酶溶及酚红调节胰酶溶液成紫红色（液成紫红色（PH6.87.2），置），置 37 预温。预温。3.3 将玻片标本放入胰酶溶液中处理将玻片标本放入胰酶溶液中处理2545秒钟，不秒钟，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。随着处理标本数断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长。量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用
