1、第四章第四章 人工染色体载体人工染色体载体第一节第一节 粘粒载体粘粒载体第二节第二节 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体第三节第三节 细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体第四节第四节 P1P1噬菌体载体和噬菌体载体和P1P1人工染色体载体人工染色体载体本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！人工染色体载体课件1 常规载体在工作时都是在不影响质粒或常规载体在工作时都是在不影响质粒或噬菌体复制功能的基础上装载外源噬菌体复制功能的基础上装载外源DNADNA片段的，片段的，同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一同时保持质粒或
2、噬菌体的基本特性。这样一来，这些载体所装载的容量就受到限制。来，这些载体所装载的容量就受到限制。利利用染色体的复制元件来驱动外源用染色体的复制元件来驱动外源DNADNA片段的载片段的载体称为人工染色体载体体称为人工染色体载体，其装载外源，其装载外源DNADNA片段片段的容量可以与染色体的大小媲美。的容量可以与染色体的大小媲美。人工染色体载体课件2第一节第一节 粘粒载体粘粒载体一、粘粒的结构特征和用途一、粘粒的结构特征和用途 粘粒实际是质粒的衍生物，是带有粘粒实际是质粒的衍生物，是带有coscos序列的序列的质粒。质粒。coscos序列是序列是l l噬菌体噬菌体DNADNA中将中将DNADNA包
3、装到噬菌体包装到噬菌体颗粒中所需的颗粒中所需的DNADNA序列。粘粒的组成包括序列。粘粒的组成包括质粒复制质粒复制起点起点、抗性标记抗性标记、coscos位点位点，因而能像质粒一样转，因而能像质粒一样转化和增殖。化和增殖。它的大小一般它的大小一般5-7kb5-7kb左右，用来克隆大片段左右，用来克隆大片段DNADNA，克隆的最大克隆的最大DNADNA片段可达片段可达45kb45kb。有的粘粒载体含有。有的粘粒载体含有两个两个coscos位点，在某种程度上可提高使用效率。位点，在某种程度上可提高使用效率。人工染色体载体课件3二、粘粒载体的工作原理二、粘粒载体的工作原理 粘粒载体的主要工作原理类似
4、粘粒载体的主要工作原理类似l l噬菌体噬菌体载体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于相当于l l噬菌体载体的左右臂，噬菌体载体的左右臂，cos位点通过位点通过粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联体。当多联体与体。当多联体与l l噬菌体包装的蛋白质混合时噬菌体包装的蛋白质混合时l l噬菌体噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两基因蛋白的末端酶功能将切割成两个个cos位点，并将两个同方位点，并将两个同方cos位点之间的片位点之间的片段包装到段包装到l l噬菌体颗粒中去。噬菌体颗粒中去。允许插入片段为允许插入片段为30
5、-45kb。人工染色体载体课件4三、粘粒克隆载体三、粘粒克隆载体粘粒pJB8、含双cos位点的粘粒载体、pcos1 EMBL等。四、粘粒载体文库的扩增和贮存四、粘粒载体文库的扩增和贮存噬菌体颗粒状的粘粒文库在含有几滴氯仿的SM溶液中可以保存几周。可以采用影印到硝酸纤维素膜上保存、挑取所有菌落混合培养后深冷保存，等。五、粘粒载体文库的常见问题五、粘粒载体文库的常见问题载体分子自连，重组率降低多个外源片段串联进入载体中原料DNA片段短于200kb时，制备的目的DNA中相当一部分的末端的一端不带酶切位点总DNA纯度影响目的DNA的制备空载体现象不同重组子的拷贝数不同文库的代表性不足，缺泛一些目标基因
6、。人工染色体载体课件5人工染色体载体课件6第二节第二节 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体（yeast artificial yeast artificial chromosomechromosome，YACYAC）：就是模拟酵母菌染色体）：就是模拟酵母菌染色体的复制而构建的载体。的复制而构建的载体。人工染色体载体课件7一、一、YACYAC载体的复制元件载体的复制元件 YACYAC载体的复制元件是其核心组成成分，载体的复制元件是其核心组成成分，骑在酵母中复制的必须元件包括骑在酵母中复制的必须元件包括复制起点序复制起点序列列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数
7、分即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的裂功能的着丝粒着丝粒和和两个端粒两个端粒。这些元件能够。这些元件能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。及保持染色体稳定的需要。人工染色体载体课件8端粒重复序列：端粒重复序列：是定位于染色体末端的一段序是定位于染色体末端的一段序列，用于保护线状列，用于保护线状DNADNA不被胞内的核酸酶降解，不被胞内的核酸酶降解，已形成稳定的结构。已形成稳定的结构。着丝粒：着丝粒：是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞使染色体在分裂过
8、程中能正确分配到子细胞中。在中。在YACYAC中起到保证一个细胞内只有一个人中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。工染色体的作用。人工染色体载体课件9二、二、YACYAC载体的工作原理载体的工作原理 YACYAC载体主要是用来构建载体主要是用来构建大片段大片段DNADNA文库文库，特别，特别是用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作是用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图示是常规的基因克隆。图示是pYAC4pYAC4载体的遗传结构图，载体的遗传结构图，当用当用BamBamH H切割成现状后，就形成了一个微型酵母切割成现状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体
9、复制的必要染色体，包含染色体复制的必要順式元件順式元件。这些元。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定着个微型染色体可以携带酵母染色体大小的决定着个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNADNA片段。片段。允许插入片段大小：没有限制，一般为允许插入片段大小：没有限制，一般为250-250-400kb400kb。人工染色体载体课件10YACYAC载体的原理性工作流程：载体的原理性工作流程：人工染色体载体课件11 对于对于BamBamHH切割后形成的微型酵母染色体，当用切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoEcoRR或或SmaSma切割抑
10、制基因切割抑制基因sup4sup4内部的位点后形成染色体的两条内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段臂，与外源大片段DNADNA在该切点相连就形成一个大型人工酵在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母菌后可像染色体一样复制，并随细胞母染色体，转化到酵母菌后可像染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNADNA的目的外源的目的外源DNADNA片段的装载导致抑制基因片段的装载导致抑制基因sup4sup4插入失活，从而使重组菌形成插入失活，从而使重组菌形成红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落红色菌落；而载体自
11、身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。为白色。YACYAC的缺点：插入片段容易出现缺失和重排现象，的缺点：插入片段容易出现缺失和重排现象，YACYAC与与酵母染色体大小相似不容易分离和纯化。酵母染色体大小相似不容易分离和纯化。YACYAC的优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的的优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的和极端的DNADNA片段有更强的容忍性，文库的代表性强，适合片段有更强的容忍性，文库的代表性强，适合作真核染色体片段功能研究。作真核染色体片段功能研究。人工染色体载体课件12第三节第三节 细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体（
12、bacterial artificial bacterial artificial chromosomechromosome，BACBAC）：就是基于大肠杆菌的就是基于大肠杆菌的F F质粒质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。构建的高容量低拷贝质粒载体。F F质粒质粒：是一个约：是一个约100kb100kb的质粒，编码的质粒，编码6060多种参多种参与复制、分配和结合过程的蛋白质。与复制、分配和结合过程的蛋白质。人工染色体载体课件13一、一、BACBAC载体及其结构组成载体及其结构组成 BACBAC载体大小约载体大小约7.5kb7.5kb，其本质是一个质，其本质是一个质粒克隆载体。粒克隆载体。BAC
13、BAC载体与常见克隆载体的核心载体与常见克隆载体的核心区别在于其区别在于其复制单元复制单元的特殊性的特殊性。复制单元复制单元来自来自F F质粒，包括严谨型控制的质粒，包括严谨型控制的复制区复制区oriSoriS、启动、启动DNADNA复制的由复制的由ATPATP驱动的解驱动的解旋酶（旋酶（RepERepE），以及），以及3 3个确保低拷贝并使质粒个确保低拷贝并使质粒精确分配至子代细胞的基因座（精确分配至子代细胞的基因座（parAparA、parBparB、parCparC）。）。人工染色体载体课件14人工染色体载体课件15二、二、BACBAC载体工作原理载体工作原理 BACBAC载体的工作原理
14、与常规的质粒克隆载体的工作原理与常规的质粒克隆载体相似。不同的是，载体相似。不同的是，BACBAC载体装载的是大片载体装载的是大片段段DNADNA，一般在一般在100100300kb300kb。对如此大的。对如此大的DNADNA片段一般要通过脉冲场凝胶电泳来分离。另片段一般要通过脉冲场凝胶电泳来分离。另外，由于外，由于BACBAC载体的拷贝数小，制备难度大。载体的拷贝数小，制备难度大。为解决这个问题，有的学者将为解决这个问题，有的学者将BACBAC载体作为外载体作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上，从而源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上，从而在大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载在大肠杆菌中以
15、多拷贝的形式复制，便于载体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。人工染色体载体课件16第四节第四节 P1P1噬菌体载体和噬菌体载体和P1P1工人染色体载体工人染色体载体一、一、P1P1噬菌体的分子特征噬菌体的分子特征：双链线状双链线状DNADNA，110kb110kb，末端具有，末端具有10kb10kb左右冗余序列，感染进入左右冗余序列，感染进入大肠杆菌后冗余序列发生重组，形成环状分子，大肠杆菌后冗余序列发生重组，形成环状分子，c c决定进决定进入溶原或裂解状态。入溶原或裂解状态。包装方式与包装方式与不同。不同。二、二、P1P1噬菌体载体元件噬菌体载体元件：复制元件、环化和包装信号、标记基：复制元件、环化和包装信号、标记基因、克隆位点、填充片段。因、克隆位点、填充片段。P1P1噬菌体载体工作原理：与粘粒相似。噬菌体载体工作原理：与粘粒相似。三、三、P1P1人工染色体载体：人工染色体载体：结合了结合了P1P1噬菌体载体和噬菌体载体和BACBAC载体的最佳特性，如载体的最佳特性，如pCYPAC1pCYPAC1，允许，允许外源片段为外源片段为130-150kb130-150kb，采用电转化，外源片段的嵌合和重，采用电转化，外源片段的嵌合和重组现象较低，对重组序列的回文结构的忍受性强。组现象较低，对重组序列的回文结构的忍受性强。人工染色体载体课件17
